蔡鳳香+陳豆豆+楊飛+鄭欣+張思韜+趙鳳云

摘要： 用水稻 （Oryza sativa L.） 中花 11 號分析了0.06%、0.006%、0.000 6% H2O2 處理 5 d 對水稻幼苗生長、H2O2 產(chǎn)生、細(xì)胞死亡及生長素積累分布的影響。結(jié)果表明，高濃度 H2O2 （0.06%）抑制地上部分和不定根的伸長及不定根上側(cè)根的形成和生長，但對初生根上的側(cè)根生長無明顯影響。低濃度（0.000 6% ）H2O2 促進(jìn)初生根和不定根的伸長及其側(cè)根數(shù)量增多和長度增加。根尖 H2O2 積累和細(xì)胞死亡隨著 H2O2 濃度的增大而增加。利用 DR5-GUS 轉(zhuǎn)基因水稻分析顯示高濃度 H2O2 促進(jìn)生長素在根尖的過量積累，本試驗條件下 H2O2 對生長素積累和分布的調(diào)節(jié)與其激活轉(zhuǎn)錄有關(guān)。由此可見，高濃度 H2O2 對水稻幼苗生長的抑制作用與其誘導(dǎo)細(xì)胞死亡及生長素過度積累有密切關(guān)系。

關(guān)鍵詞： 過氧化氫（H2O2）；生長素；水稻；幼苗；生理調(diào)節(jié)；側(cè)根數(shù)量；側(cè)根長度；根尖細(xì)胞

中圖分類號：S511.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）03-0074-04

H2O2是植物體內(nèi)重要的信號分子，參與調(diào)節(jié)眾多細(xì)胞應(yīng)答過程，包括生長發(fā)育、向地性生長和激素信號等[1]。對H2O2與根系生長發(fā)育的關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，在正常和脅迫條件下H2O2都參與根系形態(tài)建成的調(diào)節(jié)。如用不同脅迫處理擬南芥，產(chǎn)生的表型非常相似，暗示有共同的分子-生理系統(tǒng)調(diào)節(jié)脅迫下的形態(tài)應(yīng)答，推測H2O2在控制形態(tài)建成變化中可能起關(guān)鍵作用[2]。非脅迫條件下，清除H2O2促進(jìn)擬南芥根的伸長但抑制根毛的形成[3-4]。研究還發(fā)現(xiàn)，H2O2 既是玉米根細(xì)胞壁松弛和伸長生長所必需的[5]，也是水稻根生長所必需的[6]。H2O2 是黃瓜[7] 和綠豆[Mucuna pruriens （Linn.） DC. var. utilis][8] 不定根形成和發(fā)育的信號分子。這些結(jié)果表明，H2O2 對調(diào)節(jié)根系的生長發(fā)育可能起關(guān)鍵作用。眾所周知，生長素是調(diào)節(jié)根系生長發(fā)育不可缺少的信號分子，它們是根細(xì)胞分裂、伸長生長、向地性應(yīng)答和側(cè)根發(fā)育必需的[9]。研究顯示，H2O2 與生長素的相互作用對根系的生長發(fā)育產(chǎn)生影響。在正常生長條件下，生長素誘導(dǎo)H2O2 的產(chǎn)生是玉米根向地性生長所必需的[10]。用綠豆研究發(fā)現(xiàn)，外源生長素IBA誘導(dǎo)H2O2的過量產(chǎn)生，從而促進(jìn)不定根的形成[8]。生長素促進(jìn)番茄根尖H2O2 積累但抑制根的生長[11]。對擬南芥研究表明，H2O2代謝的變化可能通過影響生長素的平衡而控制脅迫誘導(dǎo)的形態(tài)生長應(yīng)答[2]。氧化脅迫抑制擬南芥主根的伸長，但是能促進(jìn)側(cè)根的形成。在脅迫誘導(dǎo)的生長重新定向過程中，H2O2可能促進(jìn)生長素驅(qū)動的細(xì)胞分裂[2]。這些研究表明，H2O2 和生長素之間的相互作用參與了根系生長發(fā)育的調(diào)節(jié)。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫誘導(dǎo)水稻根系生長的變化與H2O2 的積累有關(guān)[12]。Zn對Cd脅迫水稻根系生長的調(diào)節(jié)與其減少H2O2產(chǎn)生并誘導(dǎo)生長素積累和分布的變化有密切關(guān)系[13]。本試驗旨在研究非脅迫條件下外源H2O2調(diào)節(jié)水稻幼苗生長的生理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

挑選籽粒飽滿的水稻種子（品種為中花 11 號），去殼后消毒：75%乙醇（30 s）、0.1% 氯化汞（15 min）、2% 次氯酸鈉（20 min），用無菌水沖洗干凈，再將種子植入MS 培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)箱內(nèi)[光周期為 14 h光照，光照強(qiáng)度為 200 μmol/（m2·s），溫度 26 ℃，夜間10 h，溫度 20 ℃；相對濕度約為 50%～60%]培養(yǎng)6 d后轉(zhuǎn)到Hoagland營養(yǎng)液，使其適應(yīng)12 h后進(jìn)行H2O2處理：在 Hoagland營養(yǎng)液中分別添加0.06%、0.006%、0.000 6%的H2O2處理5 d。每天更換1次培養(yǎng)液，每種處理重復(fù)3次，每次至少3個重復(fù)，每個重復(fù)約50株。

1.2 根系生長指標(biāo)統(tǒng)計

初生根的長度：用尺子測量；初生根上側(cè)根的數(shù)量：只統(tǒng)計大于1 mm的；初生根上側(cè)根的長度：只測量5條最長的。每次重復(fù)測20株，每種處理統(tǒng)計60株。

不定根的數(shù)量：只計算大于1 cm的；不定根的長度：每株只測量5條最長的；不定根上側(cè)根的長度：每株只測量5條最長的不定根上的側(cè)根，每條不定根上只測量5條最長的側(cè)根；每條不定根上側(cè)根的數(shù)量：只統(tǒng)計大于1 mm的。每次重復(fù)測20株，每種處理統(tǒng)計60株。

1.3 H2O2的定性和定位測定

利用DAB染色法對根尖H2O2進(jìn)行定性和定位分析[14]，每種處理至少用20株染色。

1.4 細(xì)胞完整性的測定

通過Evans blue染色法對細(xì)胞完整性進(jìn)行定性測定[15]，每種處理至少染色20株。

1.5 根尖生長素分布和積累的測定

以轉(zhuǎn)DR5-GUS 基因水稻為材料，通過GUS 染色法對根尖生長素的分布和積累進(jìn)行測定，GUS 染色參考Petersson 等的方法[16]進(jìn)行。轉(zhuǎn)基因水稻種子在MS 培養(yǎng)基萌發(fā)生長6 d后轉(zhuǎn)入Hoagland營養(yǎng)液使其適應(yīng)12 h后添加0.06%的H2O2，在上述同樣條件下處理3 h，該處理至少重復(fù)3次，每次重復(fù)至少用20株進(jìn)行GUS 染色和活性測定。

1.6 H2O2 在RNA水平對水稻根系生長素分布的影響

將在MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 d的水稻幼苗轉(zhuǎn)入 Hoaglands 營養(yǎng)液中適應(yīng)12 h。在Hoaglands營養(yǎng)液中加入 DRB （5，6-dichlorobenzimidazole 1-β-D-ribofuranoside，RNA 合成抑制劑，濃度為65 μmol/L）預(yù)處理2 h后取出，轉(zhuǎn)入含0.06% H2O2的Hoaglands營養(yǎng)液中，在上述同樣條件下處理3 h。該處理至少重復(fù)3次，每次重復(fù)至少用20株進(jìn)行GUS 染色和活性測定。

1.7 數(shù)據(jù)處理

用SPSS軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，求出3次重復(fù)試驗的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。利用單因子方差分析各種處理與對照之間以及3種不同處理之間的差異，P<0.05 代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2對水稻幼苗生長的影響

2.1.1 H2O2對水稻幼苗株高和初生根長度的影響 圖1-A顯示，高濃度 H2O2 抑制植株生長，低濃度（0.000 6%）H2O2 對植株生長無顯著作用。0.06% H2O2處理5 d時其幼苗的株高比CK的低 24.3%，差異顯著（P<0.05）。低濃度（0.000 6%）H2O2 處理稍微促進(jìn)初生根的伸長生長，但各濃度H2O2處理與對照組之間差異不顯著（P>0.05）（圖1-B）。

2.1.2 H2O2對水稻幼苗初生根上側(cè)根數(shù)量和長度的影響 與CK相比，低濃度（0.000 6% ）H2O2促進(jìn)初生根上側(cè)根數(shù)量的增多和長度的增加（P<0.05）；高濃度（0.06% ）H2O2處理幼苗初生根上側(cè)根的數(shù)量和長度與對照組差異不顯著（圖2）。

2.1.3 H2O2對水稻幼苗不定根數(shù)量和長度的影響 由圖 3-A 可見，3種濃度的 H2O2 處理幼苗的不定根數(shù)量與對照組之間無明顯差異（P>0.05）。高濃度（0.06% ）H2O2處理抑制不定根的伸長生長，而低濃度H2O2 則促進(jìn)不定根的伸長生長，0.000 6% H2O2處理的幼苗不定根比CK 的長32%（P<0.05），差異顯著（圖3-B）。

2.1.4 H2O2對水稻幼苗不定根上側(cè)根數(shù)量和長度的影響

與對照組相比，低濃度（0.000 6% ）H2O2促進(jìn)不定根上側(cè)根數(shù)量的增多和長度的增加（P<0.05）；高濃度（0.06%）H2O2 處理顯著抑制不定根上側(cè)根的形成和生長（圖4），該處理條件下不定根上的側(cè)根數(shù)比對照組的少44.1%，差異極顯著（P<0.01）。

2.2 H2O2處理對水稻幼苗根系H2O2積累和分布的影響

如圖5所示，不同處理條件下初生根根尖上H2O2的積[JP3]累量存在差異，H2O2產(chǎn)生量由少到多的順序為CK <0.000 6% H2O2<0.006% H2O2<0.06% H2O2。H2O2主要集中在成熟區(qū)前端和伸長區(qū)，外源H2O2濃度越高積累面積越大。H2O2在不定根根尖中的積累變化情況與初生根的類似（數(shù)據(jù)略）。

2.3 H2O2處理對水稻幼苗根系細(xì)胞完整性的影響

細(xì)胞完整性是檢測氧化脅迫程度的重要指標(biāo)之一，它與H2O2的積累有密切關(guān)系。為進(jìn)一步了解外源H2O2 對細(xì)胞完整性的影響，試驗利用Evans blue染色法定性測定了細(xì)胞完整性的變化。圖6顯示，不同濃度H2O2處理條件下初生根上染色程度和分布面積存在差異，染色由淺到深和面積從小到大的順序為CK<0.000 6% H2O2<0.006% H2O2<0.06% H2O2。各種處理中染色深度與H2O2的積累（圖5）基本一致。在不定根根尖中的染色變化情況與初生根的類似（數(shù)據(jù)略）。

2.4 H2O2對水稻幼苗根系生長素積累和分布的調(diào)節(jié)

生長素是調(diào)節(jié)根系生長的重要信號分子之一。為了解H2O2對水稻幼苗根系生長的調(diào)節(jié)是否與生長素有關(guān)，本試驗利用轉(zhuǎn)DR5-GUS 轉(zhuǎn)基因水稻對0.06% H2O2處理幼苗根系生長素的分布和積累進(jìn)行了測定 （圖7）。與對照相比，H2O2誘導(dǎo)生長素在整個初生根根尖的積累明顯增加，同樣條件下不定根中生長素的積累和分布與初生根的類似（數(shù)據(jù)略）。為了進(jìn)一步分析H2O2 調(diào)節(jié)生長素積累分布的機(jī)制，對根系分別進(jìn)行了DRB （RNA合成抑制劑）、BFA（蛋白運(yùn)輸抑制劑）、CHX （蛋白合成抑制劑） 和 MG132（蛋白降解抑制劑）處理，結(jié)果顯示H2O2 +DRB處理的初生根根尖生長素的積累比單一H2O2處理的明顯減少。該處理條件下不定根中生長素積累也顯著減少（數(shù)據(jù)略），但是在H2O2 +BFA/CHX/MG132處理條件下根尖生長素的積累與單一H2O2處理的無明顯差異，說明本試驗條件下0.06% H2O2 誘導(dǎo)生長素的增加與其激活轉(zhuǎn)錄有密切關(guān)系。

3 討論

H2O2 是植物體內(nèi)重要的信號分子之一，參與植物生長發(fā)育的眾多過程[1-8]。本研究結(jié)果表明，高濃度 H2O2 抑制水稻幼苗地上部分及不定根的生長，特別對不定根上側(cè)根的形成和生長具有顯著的抑制作用，但低濃度的 H2O2 促進(jìn)植物的生長。在本試驗中，高濃度H2O2 對水稻幼苗生長的抑制作用可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞的死亡增加有關(guān)。生長素在調(diào)節(jié)植物根系生長過程中發(fā)揮重要作用，但是生長素的過度積累則抑制植物的生長。大量研究顯示，H2O2 與生長素的相互作用對根系的生長發(fā)育產(chǎn)生影響[2，8，11]。如生長素促進(jìn)番茄根尖 H2O2 的積累但抑制根的生長[11]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，Cd 脅迫下水稻根系生長的變化與 H2O2 的產(chǎn)生和生長素的積累分布有關(guān)[12]。Zn 對 Cd 脅迫水稻根系生長的調(diào)節(jié)也與其減少H2O2 產(chǎn)生并誘導(dǎo)生長素積累和分布的變化有密切關(guān)系[13]。本試驗條件下高濃度（0.06%）的外源 H2O2 對水稻幼苗生長的抑制作用可能是由其誘導(dǎo)生長素的過度積累造成的。試驗結(jié)果表明，H2O2 導(dǎo)致的生長素過度積累可能是通過激活轉(zhuǎn)錄途徑調(diào)節(jié)的。由此可見，H2O2 和生長素互為因果關(guān)系，二者的平衡對調(diào)節(jié)植物的生長具有重要作用。綜上所述，適量 H2O2 是調(diào)節(jié)植物生長所必須的。高濃度 H2O2 引起細(xì)胞死亡和生長素在根尖的過度增加從而抑制植物生長。

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