張俊波+印雙紅+李默+冉輝+羅靜+李建新+陸安法+郭飛+陳創(chuàng)夫

摘要： 為了檢測(cè)對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路在巨噬細(xì)胞內(nèi)布魯氏菌存活的影響，將布魯氏菌粗糙型菌株RB51和光滑型菌株S2308分別侵染細(xì)胞，應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)RB51和S2308和對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)p-Akt（S473）和p-Akt（T308）表達(dá)的影響；用MTT法檢測(cè)抑制劑LY294002（LY）對(duì)細(xì)胞活性的影響；通過(guò)菌落計(jì)算法，檢測(cè)抑制劑LY對(duì)胞內(nèi)菌RB51和S2308存活的影響。結(jié)果表明，粗糙型菌株RB51和光滑型菌株S2308都可激活 PI3K/Akt信號(hào)通路，但粗糙型菌株RB51的激活程度顯著弱于光滑型菌株S2308（P<0.01）；抑制劑LY在小于或等于20 μmol/L濃度時(shí)不影響細(xì)胞活性；抑制劑LY（20 μmol/L）可顯著抑制光滑型菌株S2308的存活，但不影響粗糙型菌株RB51的存活。本研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路在光滑型菌株存活中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞： PI3K/Akt信號(hào)通路；布魯氏菌RB51和S2308；胞內(nèi)存活

中圖分類(lèi)號(hào)： S855.99 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）03-0036-04

布魯氏菌病是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)和家畜健康的人獸共患傳染病[1-2]。布魯氏菌為革蘭氏陰性的兼性胞內(nèi)寄生菌，其急性期的臨床特點(diǎn)主要為惡寒、發(fā)熱、關(guān)節(jié)和肌肉痛等；人感染布魯氏菌后造成骨關(guān)節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等損害，慢性期主要癥狀為骨關(guān)節(jié)病及包括神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的多系統(tǒng)多器官的損害，患者一般會(huì)表現(xiàn)出神經(jīng)-精神癥狀，病程較長(zhǎng)，容易復(fù)發(fā)并再感染，從而導(dǎo)致勞動(dòng)力的喪失。動(dòng)物布魯氏菌病的特點(diǎn)是生殖器官、胎膜及其他多種器官組織發(fā)炎、壞死和肉芽腫的形成，引起流產(chǎn)、睪丸炎及關(guān)節(jié)炎等癥狀。布魯氏菌病給人類(lèi)健康和畜牧業(yè)和諧發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)重危害[3]。因此，研究布魯氏菌及其對(duì)宿主細(xì)胞的致病機(jī)制，為布魯氏菌疫苗研發(fā)和防控提供理論依據(jù)，對(duì)于國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和社會(huì)的安全具有重大的意義。

PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是重要的細(xì)胞生存通路之一，Akt作為PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵分子，在促進(jìn)細(xì)胞生存、生長(zhǎng)、增殖，促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制細(xì)胞凋亡方面起核心作用[4]。PI3K/Akt信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在多種腫瘤組織有Akt的過(guò)度表達(dá)和活化。PI3K/Akt 信號(hào)通路還與一些病毒的生存繁殖密切相關(guān)，然而，PI3K/Akt信號(hào)通路與布魯氏菌的生存關(guān)系如何，目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道，本研究推測(cè)PI3K/Akt信號(hào)通路在布魯氏菌致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，因此，研究PI3K/Akt信號(hào)通路在布魯氏菌致病過(guò)程中的作用，有助于揭示布魯氏菌的致病機(jī)制，為抗布魯氏菌藥物的研制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細(xì)胞與質(zhì)粒 牛種布魯氏菌參考株2308和牛種布魯氏菌疫苗株RB51，由石河子大學(xué)人畜共患病實(shí)驗(yàn)室提供；大腸桿菌DH5α，由銅仁學(xué)院生物與農(nóng)林工程學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒、增強(qiáng)型 HRP-DAB 試劑盒，購(gòu)自天根生化（北京）科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000，購(gòu)自Invitrogen公司；酵母提取物（Yeast Extract）、蛋白胨（Tryptone）、NaCl，購(gòu)自O(shè)xoid公司；瓊脂糖購(gòu)自上海生物工程技術(shù)有限公司。MTT、DMSO，且以DMSO作為溶劑，購(gòu)自索萊寶公司；LY 購(gòu)自碧云天公司；兔抗鼠磷酸化Akt（Ser473）和Akt（Thr308）、Akt單克隆抗體和HRP—羊抗兔二抗，購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；β-actin購(gòu)自bioworld公司；ECL熒光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Thermo公司；BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海生物工程技術(shù)有限公司。

1.2.3 布魯氏菌侵染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 將16M用PBS洗脫菌體，利用細(xì)菌比濁法計(jì)算數(shù)量，按比例通過(guò)10倍稀釋菌懸液，然后將懸液涂于固體培養(yǎng)基上，置于37 ℃、10% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，每個(gè)稀釋濃度重復(fù)3次，進(jìn)行計(jì)數(shù)取平均值確定布魯氏菌數(shù)目。以50 ∶ 1（細(xì)菌個(gè)數(shù) ∶ 細(xì)胞個(gè)數(shù)）的比例，用16M侵染RAW264.7細(xì)胞，并將侵染后的RAW264.7細(xì)胞置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 細(xì)胞蛋白質(zhì)提取 細(xì)胞計(jì)數(shù)并收集1×106個(gè)細(xì)胞，1 500 r/min 離心5 min棄上清收集細(xì)胞。加入1×PBS洗滌3次棄上清。細(xì)胞沉淀中加入100 μL RIPA裂解液。加入PMSF （100 mmol/L）10 μL/mL、 Na3VO4（200 mmol/L）5 μL/mL、NaF（0.5 mmol/L） 2 μL/mL、phosSTOP phosphatase inhibitor （Roche） 150 μL/mL，細(xì)胞懸浮混勻，在冰上靜置 20 min。 4 ℃ 15 000 r/min離心15 min。移出上清置于1支新離心管即為含總蛋白的溶液。

1.2.5 BCA法蛋白濃度測(cè)定 吸取50 μL樣品于標(biāo)記好的試管中。加入1 mL BCA工作液，輕柔渦旋混勻。標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)：37 ℃孵育30 min或室溫放置2～16 h。加強(qiáng)型檢測(cè)：在60 ℃孵育15 min，將試管冷卻至室溫。在1個(gè)干凈的吸光杯中加入1 mL水，在波長(zhǎng)562 nm調(diào)零。將待測(cè)液加入干凈的吸光杯。10 min內(nèi)測(cè)定并記錄所有反應(yīng)液的吸光度（D562 nm），校正的吸光度為各標(biāo)樣和試樣的讀數(shù)減去空白樣吸光度。結(jié)合已知的BSA標(biāo)樣的量和校正過(guò)的吸光度畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線。參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)各蛋白試樣的校正吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)讀出各樣品的蛋白濃度。根據(jù)樣品體積和稀釋度計(jì)算原來(lái)樣品中的蛋白量。

1.2.6 Western blot檢測(cè) 當(dāng)SDS-PAGE結(jié)束時(shí)，將含有目的蛋白的凝膠切下，盡量避免用手碰觸。同時(shí)裁剪6～7張大小和凝膠相同的濾紙和1 張硝酸纖維素膜（NC膜），切除凝膠、NC膜與濾紙 1 角作為標(biāo)記。將凝膠與NC膜在膜轉(zhuǎn)移緩沖液中靜置平衡10 min，NC膜與濾紙分開(kāi)浸泡。 轉(zhuǎn)膜：將3 層濾紙放于半干式電轉(zhuǎn)儀中，后放膠，將NC膜放于其上，再鋪3層濾紙，200 mA 20 V 電泳1～2 h。封閉：小心取出NC膜，放在1 個(gè)干凈平皿中，用TBST洗膜3次，每次5 min。將NC膜放入雜交瓶中，加入10 mL膜封閉液，37 ℃于雜交儀上封閉1 h。與一抗的結(jié)合：倒去封閉液，將NC膜放入盛有TBST的平皿中沖膜3次，每次5 min。將NC膜放入雜交瓶中，加入用TBST稀釋的一抗（1 ∶ 1 000），37 ℃于雜交儀上雜交1～2 h。與二抗的結(jié)合：用TBST沖膜3次，每次5 min。加入用TBST稀釋的過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔HRP-IgG二抗5 mL（1 ∶ 3 000），37 ℃于雜交儀上雜交1 h。用TBST沖膜3次，每次10 min。加ECL底物顯色液，避光顯色1 min，照相。

1.2.7 LY抑制試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞，在10% FBS培養(yǎng)基中2 mL細(xì)胞以1×106個(gè)/mL密度接種于6 孔培養(yǎng)板中。繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，加入LY，濃度分別選取10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L，1 h后觀察p-Akt（S473）和p-Akt（T308）抑制狀態(tài)。將細(xì)胞混懸液立即置入液氮以終止反應(yīng)，然后以冰凍PBS洗滌細(xì)胞3次。細(xì)胞收集后，采用1×106個(gè)/50 μL RIPA提取總蛋白質(zhì)，BCA法測(cè)定總蛋白濃度。

1.2.8 MTT試驗(yàn) 將抑制劑不同濃度的LY（10、20、40 μmol/L）與巨噬細(xì)胞共同孵育，以0.1% DMSO處理細(xì)胞為對(duì)照。置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱，使細(xì)胞貼壁培養(yǎng)6～24 h。加入適當(dāng)濃度的受試化合物，繼續(xù)培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間。小心吸取上清，加入90 L新鮮培養(yǎng)液，再加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去上清，每孔加入110 L Formazan溶解液，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm 處測(cè)量各孔的吸光度。同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、Formazan溶解液）、對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、Formazan溶解液），每組設(shè)定3復(fù)孔。

1.2.9 布魯氏菌的培養(yǎng)、計(jì)數(shù) 將保存的凍干布魯氏菌接種于10%小牛血清肝瓊脂培養(yǎng)基，置CO2培養(yǎng)箱37 ℃、10% CO2培養(yǎng)4 d，挑取單菌落，接種于斜面培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 d，加入2 mL生理鹽水，用接種環(huán)輕輕刮下斜面培養(yǎng)基上的細(xì)菌，以10-1～10-15均勻稀釋細(xì)菌，并取200 μL 10-13、10-14、10-15稀釋菌液涂布于120 mmol/L含有10%小牛血清肝瓊脂培養(yǎng)基的平板中，每個(gè)稀釋度涂2個(gè)平板，置于10% CO2 37 ℃ 的CO2培養(yǎng)箱 4 d，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 17.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 布魯氏菌對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的激活

在布魯氏菌RB51和S2308侵染巨噬細(xì)胞中，其細(xì)胞內(nèi)對(duì)應(yīng)的p-Akt（S473）與β-actin的灰度值比值分別為 0.32±0.034和1.12±0.045，而對(duì)照組值為0.12±0.035。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在粗糙型RB51感染細(xì)胞的p-Akt（S473）灰度比值顯著高于對(duì)照組（P<0.01），但又顯著低于S2308感染的細(xì)胞（P<0.01）。p-Akt（T308）與β-actin的灰度值比值p-Akt（S473）比值趨勢(shì)是一致的（圖1）。然后利用抑制劑LY（20 μmol/L）與巨噬細(xì)胞作用1 h，然后分別用RB51和S2308侵染巨噬細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RB51和S2308誘導(dǎo)的 p-Akt（S473/308） 的表達(dá)與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P>0.05）。結(jié)果表明，在巨噬細(xì)胞中，粗糙型的RB51激活PI3K/Akt信號(hào)通路的程度極顯著弱于光滑型的S2308（P<0.01），并且抑制劑LY可阻斷布魯氏菌對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的激活。

2.2 抑制劑LY對(duì)巨噬細(xì)胞活性的影響

抑制劑LY和DMSO分別與巨噬細(xì)胞作用48 h，MTT法檢測(cè)結(jié)果：當(dāng)抑制劑LY的濃度為10 μmol/L和20 μmol/L時(shí)不影響細(xì)胞的活性，但是在濃度為40 μmol/L時(shí)細(xì)胞的成活率降至70%。加DMSO后的細(xì)胞形態(tài)為小圓球形，與正常細(xì)胞形態(tài)相同，因此對(duì)照組加DMSO不影響細(xì)胞的活性。加入LY的濃度為10 μmol/L和20 μmol/L時(shí)細(xì)胞形態(tài)也為小圓球形，與正常細(xì)胞形態(tài)相同，當(dāng)LY的濃度為40 μmol/L時(shí)，細(xì)胞變大，形態(tài)開(kāi)始呈不規(guī)則形（圖2）。結(jié)果表明，采用抑制劑LY的濃度20 μmol/L不影響巨噬細(xì)胞的活性，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)胞內(nèi)布魯氏菌存活的影響

抑制劑LY與巨噬細(xì)胞作用1 h，然后，分別用RB51和S2308侵染巨噬細(xì)胞，分別在4、12、24 h檢測(cè)布魯氏菌的CFU，結(jié)果顯示LY處理細(xì)胞中RB51的lgCFU與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P>0.05）（圖3）；而對(duì)于S2308菌株，LY處理細(xì)胞的lgCFU與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）（圖3）。結(jié)果表明，LY抑制了巨噬細(xì)胞內(nèi)S2308的存活，但對(duì)RB51的存活無(wú)影響。

3 討論

PI3K/Akt信號(hào)通路與很多疾病有關(guān)，在細(xì)胞內(nèi)參與調(diào)控物質(zhì)代謝、細(xì)胞增殖與存活等生物學(xué)行為。PI3K下游靶蛋白Akt具有絲氨酸/蘇氨酸殘基，可直接被PI3K激活。在PI3K途徑中，當(dāng)上游信號(hào)作用于細(xì)胞膜表面時(shí)，穿膜受體酪氨酸激酶自磷酸化或磷酸化其他底物后，能在細(xì)胞膜內(nèi)表面產(chǎn)生PI3K結(jié)合點(diǎn)，PI3K結(jié)合后可產(chǎn)生一些磷脂，然后激活A(yù)kt，被激活的Akt可介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，同時(shí)還可提高抗凋亡基因的表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡，或活化其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)調(diào)控細(xì)胞的適應(yīng)性生存。PI3K/Akt異常激活與體內(nèi)許多癌癥發(fā)生密切相關(guān)[5]。p-Akt是Akt的功能活化狀態(tài)，Akt只有被激活后才具有生物學(xué)功能。p-Akt在大多數(shù)腫瘤組織中過(guò)度表達(dá)。Akt的活化同時(shí)需要催化結(jié)構(gòu)域的Th308位點(diǎn)和C端的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的Ser473位點(diǎn)2個(gè)位點(diǎn)的磷酸化，只有2個(gè)位點(diǎn)的磷酸化才能使Akt充分活化從而達(dá)到最大活化狀態(tài)。本研究表明，光滑型菌株（S2308）及可激活p-Akt的Thr308和Ser473 2個(gè)位點(diǎn)，充分活化的Akt調(diào)控細(xì)胞的一系列生理活動(dòng)；而粗糙型菌株（RB51）也可激活p-Akt的Th308和Ser473 2個(gè)位點(diǎn)， 但是與光滑型菌株相比對(duì)p-Akt的激活程度顯著下降。對(duì)p-Akt的激活程度可能與光滑型菌株的毒力強(qiáng)和粗糙型菌株的毒力弱有關(guān)。其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步探索。

LPS是布魯氏菌的經(jīng)典毒力因子，包括類(lèi)脂A、核心低聚糖和O抗原或O鏈3個(gè)部分。布魯氏菌LPS的生物學(xué)活性與傳統(tǒng)的內(nèi)毒素不同，主要與其特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。當(dāng)布魯氏菌LPS的O-多聚糖缺失時(shí)，布魯氏菌從光滑型轉(zhuǎn)變?yōu)榇植谛停瑢?dǎo)致細(xì)菌的毒力減弱，易于被巨噬細(xì)胞殺死[6～7]。已有研究表明，脂多糖O-型多糖抑制細(xì)胞的吞噬作用，抑制溶酶體溶解和宿主細(xì)胞凋亡[8]。布魯氏菌與其宿主細(xì)胞最開(kāi)始的接觸是始于布魯氏菌表面和宿主細(xì)胞胞質(zhì)膜的接觸，脂多糖缺失的突變株毒力較親本株減弱，這說(shuō)明布魯氏菌LPS在細(xì)菌毒力上具有很重要的作用[9]。本研究推測(cè)，對(duì) PI3K/Akt 激活的強(qiáng)弱與布魯氏菌致病性成正相關(guān)，光滑型布魯氏菌致病性強(qiáng)的原因可能與其LPS能激活PI3K/Akt通路程度較強(qiáng)有關(guān)，粗糙型布魯氏菌致病性弱的原因可能與其LPS能激活PI3K/Akt通路程度較弱有關(guān)。

LY （PI3 Kinase Inhibitor） 體內(nèi)是一個(gè)高度特異性的抑制劑。它可以特異地抑制 PI3 kinase的活性，但是不抑制其他的脂質(zhì)和蛋白激酶活性。研究表明LY可以抑制 PI3K-依賴的Akt磷酸化和激酶活性，它通過(guò)和ATP競(jìng)爭(zhēng)PI3K催化結(jié)構(gòu)域的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)揮作用[10]，從而有效抑制其下游蛋白Akt的磷酸化，已被廣泛應(yīng)用于信號(hào)傳導(dǎo)通路的作用及靶向治療的研究中。

布魯氏菌在宿主細(xì)胞中的復(fù)制和增殖受到各種因素的影響。為了在宿主細(xì)胞中復(fù)制和增殖，布魯氏菌通過(guò)激活宿主細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路控制宿主細(xì)胞的存活、凋亡和自噬，以逃避宿主免疫應(yīng)答。已有研究表明，某些病毒為了更加有效地進(jìn)行復(fù)制，通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路抑制宿主細(xì)胞的早期凋亡、促進(jìn)細(xì)胞自噬和抑制細(xì)胞免疫以延長(zhǎng)在胞內(nèi)的復(fù)制時(shí)間[11-13]，甲型流感病毒的NS1蛋白可與PI3K的p85β亞基結(jié)合而激活PI3K/Akt。但是PI3K/Akt是否在布魯氏菌感染中起作用尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，LY抑制PI3K/Akt信號(hào)通路后，光滑型布魯氏菌S2308存活能力顯著下降，而粗糙型菌株RB51存活力無(wú)顯著變化。本研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路抑制后主要影響光滑型菌株的生存，其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步探索。

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