張　旸　胡中影　趙月明　李　娜　解莉楠,*

1東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040;2黑龍江生物科技職業(yè)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150025

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羽衣甘藍(lán)自交不親和與自交親和系種子萌發(fā)期DNA甲基化的動(dòng)態(tài)變化

張旸1胡中影1趙月明1李娜2解莉楠1,*

1東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040;2黑龍江生物科技職業(yè)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150025

摘要:自交不親和系植株的種子往往出現(xiàn)退化現(xiàn)象,為了研究種子的退化現(xiàn)象是否與甲基化相關(guān),因此本文采用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)技術(shù),以羽衣甘藍(lán)自交不親和系9#種子、自交親和系14#種子為研究對象,對其生長發(fā)育過程種子基因組DNA甲基化水平變化情況進(jìn)行研究。采用改良的CTAB法提取種子萌發(fā)不同時(shí)期DNA,然后通過MSAP分析、統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增條帶,比較二者之間的差異。對9#種子DNA甲基化狀態(tài)分析表明,萌發(fā)前期(0～2 d)發(fā)生甲基化位點(diǎn)數(shù)目持續(xù)增多,但萌發(fā)后期(2～8 d)發(fā)生去甲基化的數(shù)目大量增加,整個(gè)萌發(fā)期去甲基化位點(diǎn)數(shù)目是甲基化位點(diǎn)數(shù)目的11倍,說明9#種子萌發(fā)過程中DNA甲基化修飾是基因表達(dá)的重要調(diào)控方式之一;在相同發(fā)育時(shí)期,9#在總甲基化、全甲基化、半甲基化水平上均不同程度高于14#。隨著種子的萌發(fā),9#全甲基化水平明顯上升,半甲基化水平幾乎不變,而14#變化趨勢與9#相反,半甲基化水平明顯上升,全甲基化水平幾乎不變。

關(guān)鍵詞:羽衣甘藍(lán);自交不親和性;自交親和性;DNA甲基化

本研究由中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(DL09AB13)和哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項(xiàng)資金項(xiàng)目(青年科技創(chuàng)新人才) (2013RFQXJ036)資助。

This study was supported by the Basic Scientific Research Expenses of the Higher Education Institutions of Central Government,China (DL09AB13) and the Subject of Innovative Talents for Science and Technology research in Harbin (Youth Talents in Science and Technology Innovation) (2013RFQXJ036).

第一作者聯(lián)系方式:E-mail:summerzhang@126.com

羽衣甘藍(lán)(Brassica oleracea var.acephala D.C.)別名牡丹草、花甘藍(lán)、花菜、花苞菜等[1],觀賞期達(dá)3～4個(gè)月,其葉型豐富,葉色絢麗繽紛,在我國作為花壇、花境及盆栽的重要觀賞花卉[2]。羽衣甘藍(lán)原產(chǎn)于地中海地區(qū),早在公元前200年古希臘和古羅馬就廣為栽培,目前已成為一種常見的園林綠化植物[3]。近年來,國家蔬菜工程技術(shù)研究中心從美國、德國、荷蘭等國引進(jìn)優(yōu)良羽衣甘藍(lán)品種,經(jīng)過系統(tǒng)選育,培育出了葉色深綠、風(fēng)味濃、品質(zhì)優(yōu)、抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量高的新品種“開樂”,其維生素、可溶性鈣、類胡蘿卜素含量豐富,是一種高營養(yǎng)價(jià)值的新型蔬菜。

被子植物在長期進(jìn)化過程中形成了一種有利于異花授粉、阻礙自體受精的生殖隔離機(jī)制——自交不親和性(self-incompatibility,SI)[4],即指雌雄二性配子均有正常生活受精能力,在不同基因型的株間授粉能正常結(jié)籽,但花期自交不能結(jié)籽或結(jié)籽率極低的特性[5]。目前普遍認(rèn)為,自交不親和性由S基因控制,當(dāng)雌雄性器官具有相同的S基因時(shí),交配不親和,雌雄雙方的S基因不同時(shí)交配能親和[6-7]。根據(jù)花器官的形態(tài),SI可分為同型自交不親和(homomorphic incompatibility)和異型自交不親和(heteromorphic incompatibility)兩大類[8]。在同型SI中,同一物種內(nèi)所有不同個(gè)體花形態(tài)相同,此類型在被子植物中較為普遍,如白菜、甘藍(lán)等[9];而在異型SI中,主要表現(xiàn)在雌、雄蕊的相對長度上,異型SI植物主要分布于雨久花科、報(bào)春科、茜草科等[10],同型SI植物分布較為廣泛普遍。SI作為植物自花授粉的遺傳屏障,是植物采取的一種促進(jìn)異交、避免自交、防止物種退化的精密且有效的機(jī)制,在植物進(jìn)化過程中起著非常重要的作用[11]。我們在育種過程中發(fā)現(xiàn)羽衣甘藍(lán)經(jīng)過多代自交后,自交不親和系后代有嚴(yán)重退化現(xiàn)象,種子的千粒重幾乎是親和系種子的一半,且生長勢衰退,易感病。這些不利因素,都給雜交育種帶來困難,嚴(yán)重影響了羽衣甘藍(lán)新品種的創(chuàng)新。目前對羽衣甘藍(lán)自交不親和系種子退化這一現(xiàn)象的研究非常少,如何有效的保持自交后代的品質(zhì)是我們急需解決的難題。

DNA甲基化(DNA methylation)是基因組DNA的一種重要表觀遺傳修飾方式,也是最早發(fā)現(xiàn)的基因修飾途徑,其作用機(jī)制是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的催化作用下,以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)為甲基供體,從而將甲基轉(zhuǎn)移到特定堿基上的過程[12]。DNA甲基化現(xiàn)象廣泛存在于細(xì)菌[13]、植物和動(dòng)物[14]中,參與生物體的多種生物學(xué)過程,包括復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)基因和細(xì)胞分化,是調(diào)節(jié)基因功能的重要手段之一[15]。在植物中,DNA甲基化主要發(fā)生在對稱序列CG中,在CHG和CHH (H=A、C 或T)序列中也有發(fā)生,異染色質(zhì)區(qū)域的DNA甲基化程度較高。植物基因組的CpG以及CpNpG、CpNpN序列上的C會(huì)在MET1 (Dnmt1同源蛋白)或CMT3 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下發(fā)生甲基化修飾。同時(shí)MET1和CMT3也參與DNA的甲基化,含MET1和CMT3突變的擬南芥胚芽發(fā)育不良,說明DNA的甲基化對于植物胚芽和種子發(fā)育起到了重要的作用[16]。因此,認(rèn)為自交不親和性的自交個(gè)體后代易退化現(xiàn)象是由于自交使個(gè)體DNA甲基化程度積累產(chǎn)生。

本研究從機(jī)理和研究技術(shù)都比較成熟的基因組DNA甲基化水平分析入手,選用羽衣甘藍(lán)自交不親和系9#與自交親和系14#種子為試材,分析不同時(shí)期DNA甲基化狀態(tài),從總體上掌握自交不親和系種子在萌發(fā)過程中基因組DNA甲基化的動(dòng)態(tài)變化,探討DNA甲基化在種子萌發(fā)過程中控制基因表達(dá)的作用,以期了解自交不親和系種子退化現(xiàn)象與甲基化的相關(guān)性。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

東北林業(yè)大學(xué)花卉生物工程研究所從日本引進(jìn)的羽衣甘藍(lán)“赤兔”和“白波”兩個(gè)品種,經(jīng)九代自交純化選育,從“赤兔”品種的自交后代中選育出自交不親和系9#;從“白波”品種的后代中選育出自交親和系14#。9#和14#經(jīng)多代嚴(yán)格套袋自交后,收獲成熟種子,挑取飽滿籽粒,實(shí)驗(yàn)室4℃保存。

在干凈的培養(yǎng)皿中加2層濾紙,用蒸餾水充分浸濕,將9#與14#種子分別放入培養(yǎng)皿中,每皿30粒,在全自動(dòng)光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(22℃,光/暗為16 h/8 h)。取9#種子萌發(fā)過程中的第0、第0.5、第1、第2、第4和第8天的種子或幼苗,用液氮冷凍后放入-80℃冰箱保存。取9#與14#種子及萌發(fā)2 d的幼苗,用液氮冷凍后放入-80℃冰箱保存。

MSAP試驗(yàn)所用接頭和引物均由華大基因合成。MSAP試驗(yàn)所用酶類包括T4連接酶,EcoR I、Hap II、Msp I、rTaq Mix和rATP,均購自TaKaRa公司。聚丙烯酰胺凝膠電泳所有試劑:三羥甲基氨基甲烷(tris)、尿素(urea)、丙烯酰胺(acrylamide)、N’-N’甲叉雙丙烯酰(bis-acrylamide)、四甲基乙二胺(TEMED)、親和硅烷(bind-silane)、剝離硅烷(repel-silane)均購自MYM公司;苯酚、β-巰基乙醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA·Na2H2O)、過硫酸銨(AP)、溴酚藍(lán)(bromophenol blue)、二甲苯青(xylene cyanol FF)、甲酰胺(formamide)均購自哈爾濱伊事達(dá)生物有限公司;氫氧化鈉、冰醋酸、無水乙醇均為分析純試劑,購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司;硼酸、硫代硫酸鈉(Na2S2O3·5H2O)購自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;無水碳酸鈉購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;氯仿、異戊醇購自北京化工廠;甲醛購自北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司;十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)購自Amresco公司;硝酸銀購自上海試一化學(xué)試劑有限公司;RnaseA、柱式DNA純化回收試劑盒,購自北京天根生化技術(shù)有限公司。

1.2羽衣甘藍(lán)基因組總DNA提取

采用改良的CTAB法,提取羽衣甘藍(lán)自交不親和系9#種子萌發(fā)過程不同時(shí)期(0、0.5、1、2、4和8 d)的基因組DNA及自交親和系14#種子及萌發(fā)2 d種子的基因組,采用NanoDrop ND-2000微量核酸測定儀測定DNA濃度和純度,并用0.8％ (w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量,若主帶明亮并且沒有拖尾和雜帶的現(xiàn)象,則DNA可用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3MSAP體系的建立

MSAP分析參考Xiong等的方法[17]。試驗(yàn)采用的接頭序列、預(yù)擴(kuò)增引物及選擇性擴(kuò)增引物見表1。

(1)雙酶切反應(yīng)體系25 μL (EcoR I+Hpa II酶切體系):5×R/L緩沖液5 μL,基因組DNA 1 μg,EcoR I (10 U) 0.63 μL,Hpa II (10 U) 0.67 μL,ddH2O補(bǔ)充體積至25 μL。EcoR I+Msp I酶切體系:5×R/L緩沖液5 μL,基因組DNA 1 μg,EcoR I 0.63 μL,Msp I 0.72 μL,ddH2O補(bǔ)充體積至25 μL。37℃酶切2 h,取10 μL酶切產(chǎn)物用0.8％ (w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測,成功的酶切條帶成完全彌散狀。

(2)連接反應(yīng)體系25 μL:5 pmol μL-1EcoR I接頭0.5 μL,50 pmol μL-1Hpa II/Msp I接頭0.5 μL,rATP 1 μL,5×R/L緩沖液2 μL,ddH2O 0.5 μL,1 U μL-1T4 DNA連接酶0.5 μL;酶切產(chǎn)物5 μL。在16℃酒精浴中過夜連接16 h后4℃保存。EcoR I接頭5'-CTCGTAGA CTGCGTACC-3',3'-CATCTGACGCATGGTTAA-5';Hpa II/Msp I接頭5'-GATCATGAGTCCTGCT-3',3'-AGTACTCAGGACGAGC-5'。

(3)預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系25 μL:稀釋好的模板DNA 2.5 μL,EcoR I預(yù)選引物(8.3 μm) 1 μL;Hpa II/Msp I預(yù)選引物(8.3 μm) 1 μL,rTaq Mix 12.5 μL,ddH2O 8 μL。充分混勻后進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增,反應(yīng)程序如下:94 ℃ 2 min,94℃ 30 s;56℃ 60 s,72℃ 60 s,21個(gè)循環(huán);72℃ 7 min,10℃+∞。取預(yù)擴(kuò)增PCR產(chǎn)物,用0.8％ (w/v)的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測,理想擴(kuò)增效果為DNA條帶成彌散狀分布,-20℃保存。

(4)選擇性擴(kuò)增體系25 μL:稀釋好的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物,0.5 μL;EcoR I選擇引物(10 μm) 1 μL,Hpa II/Msp I選擇引物(10 μm) 1 μL,rTaq Mix 12.5 μL,ddH2O 10 μL。充分混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)程序如下:94℃10 s,65℃ 30 s (-0.7℃/cycle),72℃ 60 s,13個(gè)循環(huán);94℃ 10 s,56℃ 30 s,72℃ 60 s,25個(gè)循環(huán)。72℃ 7 min,10℃+∞。選擇擴(kuò)增產(chǎn)物變性后進(jìn)行6％ (w/v)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,硝酸銀染色后進(jìn)行泳道條帶數(shù)及帶型統(tǒng)計(jì)分析。

1.4MSAP差異條帶的統(tǒng)計(jì)分析

同裂酶Hpa II和Msp I對基因組DNA的CCGG位點(diǎn)甲基化敏感性不同,Hpa II能識(shí)別并切割非甲基化和單鏈甲基化位點(diǎn),但不能切割雙鏈甲基化位點(diǎn);而Msp I可以切割單鏈或雙鏈上內(nèi)甲基化位點(diǎn),但不能切割外甲基化位點(diǎn)。所以在變性聚丙烯酰胺凝膠上,同一基因組DNA序列分別用EcoR I/Hpa II(記為H)和EcoR I/Msp I (記為M)酶切后,都可能出現(xiàn)以下4種譜帶情況:I型(H+M+,記為11):均有帶,代表該位點(diǎn)無甲基化;II型(H+M-,記為10):H有帶,而M無帶,代表該位點(diǎn)為單鏈外側(cè)胞嘧啶甲基化;III型(H-M+,記為01):M有帶,而H無帶,代表該位點(diǎn)為雙鏈內(nèi)側(cè)胞嘧啶甲基化。IV型(H-M-,記為00):均無帶,代表無CCGG位點(diǎn)或該位點(diǎn)為雙鏈外側(cè)胞嘧啶甲基化或雙鏈內(nèi)外側(cè)胞嘧啶甲基化。

由于Hpa II和Msp I兩個(gè)同裂酶對CCGG位點(diǎn)胞嘧啶的甲基化敏感存在差異,將限制性內(nèi)切酶不能識(shí)別、切割且沒有擴(kuò)增產(chǎn)物標(biāo)記為“0”,而能被同裂酶識(shí)別、切割且有擴(kuò)增產(chǎn)物標(biāo)記為“1”。對9#種子萌發(fā)過程中的后一個(gè)生長階段DNA甲基化狀態(tài)與前一個(gè)生長階段DNA甲基化狀態(tài)進(jìn)行比較,根據(jù)帶型的有無,將DNA甲基化位點(diǎn)模式分為兩大類:一類是單態(tài)性位點(diǎn),即同一CCGG位點(diǎn)帶型相同,甲基化模式保持不變,包括D1～D2;一類是多態(tài)性位點(diǎn),即帶型有差異,顯示多態(tài)性條帶。將多態(tài)性位點(diǎn)又細(xì)劃分為五類:A類為去甲基化類型,包括從甲基化狀態(tài)到非甲基化狀態(tài),以及從雙鏈外側(cè)、雙鏈內(nèi)外側(cè)甲基化狀態(tài)到單鏈外側(cè)、雙鏈內(nèi)側(cè)甲基化狀態(tài);B類為甲基化類型,即從非甲基化狀態(tài)到甲基化狀態(tài),以及從單鏈外側(cè)、雙鏈內(nèi)側(cè)甲基化狀態(tài)到雙鏈外側(cè)、雙鏈內(nèi)外側(cè)甲基化狀態(tài);C類為不定向變異類型,包括從單鏈外側(cè)甲基化到雙鏈內(nèi)側(cè)甲基化和從雙鏈內(nèi)側(cè)甲基化到單鏈外側(cè)甲基化。

本試驗(yàn)甲基化條帶計(jì)算公式:(1)擴(kuò)增條帶總數(shù):I+II+III型條帶數(shù);表示引物擴(kuò)增出的CCGG位點(diǎn)總數(shù)。(2)甲基化條帶總數(shù):II+III型條帶數(shù),表示CCGG位點(diǎn)中發(fā)生了甲基化的位點(diǎn)總數(shù)。(3)甲基化比率(MSAP％):II+III型條帶數(shù)占總擴(kuò)增條帶數(shù)的比例,表示基因DNA的整體甲基化水平。(4)半甲基化條帶數(shù)及半甲基化比率:II型條帶數(shù);II型條帶數(shù)占總擴(kuò)增條帶數(shù)的比例,表示半甲基化水平。全甲基化條帶數(shù)及全甲基化比率:III型條帶數(shù);III型條帶數(shù)占總擴(kuò)增條帶數(shù)的比例,表示全甲基化水平。

表1　接頭和引物序列Table 1　Sequences of adaptors and primers

2　結(jié)果與分析

2.1羽衣甘藍(lán)自交不親和系種子萌發(fā)過程基因組DNA甲基化水平

提取種子萌發(fā)不同時(shí)期基因組DNA,建立6個(gè)DNA反應(yīng)體系,分別用限制性內(nèi)切酶組合EcoR I/Hpa II和EcoR I/Msp I進(jìn)行消化、連接、預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增等步驟,從90對引物組合中篩選出20對擴(kuò)增結(jié)果多態(tài)性高、重復(fù)性好、可獲得清晰條帶的引物組合,對大小位于200～1000 bp范圍內(nèi)的DNA片段進(jìn)行譜帶統(tǒng)計(jì)(表2)。I為H、M酶切均有位點(diǎn);II為H酶切有位點(diǎn),M酶切無位點(diǎn);III為M酶切有位點(diǎn),H酶切無位點(diǎn)。

9#種子在萌發(fā)過程中擴(kuò)增出的條帶總數(shù)為676～712,其中甲基化條帶總數(shù)為162～202,全甲基化條帶數(shù)為91～130,半甲基化條帶數(shù)為62～80,由此可見,萌發(fā)過程中雙鏈內(nèi)側(cè)胞嘧啶甲基化程度始終高于單鏈外側(cè)胞嘧啶甲基化程度。9#種子萌發(fā)過程中各個(gè)時(shí)期的DNA甲基化水平有差異,總甲基化水平呈現(xiàn)出先緩慢上升再明顯下降的趨勢,在萌發(fā)2 d時(shí)達(dá)到最高為28.9％,萌發(fā)8 d時(shí)達(dá)到最低為22.7％,且低于0 d時(shí)的總甲基化水平25.4％;雙鏈全甲基化水平變化趨勢與總甲基化水平變化相似,也是先上升再下降,不同的是在萌發(fā)1 d時(shí)達(dá)到最高為18.7％;單鏈半甲基化水平變化較為復(fù)雜,在0～1 d半甲基化水平逐漸降低,1 d時(shí)達(dá)到最低為8.9％,隨后在2 d時(shí)明顯升高到11.4％,然后又緩慢下降到萌發(fā)8 d時(shí)為9.9％,且比0 d半甲基化水平11.1％低。從整個(gè)萌發(fā)階段比較,9#種子在萌發(fā)2 d時(shí)總甲基化、半甲基化水平最高,在萌發(fā)8 d時(shí)甲基化、半甲基化、全甲基化水平最低。

表2　9#種子萌發(fā)過程不同時(shí)期基因組DNA甲基化水平Table 2　Methylation levels of 9#at different development stages during seeding germination

2.2羽衣甘藍(lán)自交不親和系種子萌發(fā)過程中相鄰發(fā)育時(shí)期基因組DNA甲基化模式

對9#種子萌發(fā)過程中的后一個(gè)生長階段DNA甲基化狀態(tài)與前一個(gè)生長階段DNA甲基化狀態(tài)進(jìn)行比較,統(tǒng)計(jì)甲基化模式變化類型的數(shù)目(表3)。多態(tài)性位點(diǎn)占甲基化位點(diǎn)比例越高,說明在此發(fā)育階段內(nèi)甲基化模式發(fā)生變化越多,也就是在此發(fā)育階段內(nèi)發(fā)生甲基化和去甲基化過程越多。9#種子在萌發(fā)過程中,相鄰發(fā)育時(shí)期多態(tài)性比例分別為15.0％、16.4％、20.3％、22.6％和10.0％,表明大部分甲基化位點(diǎn)并未發(fā)生甲基化模式變異。其中0～4 d發(fā)育階段內(nèi),多態(tài)性比例逐漸升高,并在萌發(fā)4 d時(shí)比例達(dá)到最高,表明在0～4 d內(nèi)隨著種子的萌發(fā)甲基化模式發(fā)生變異增多,暗示發(fā)生甲基化和去甲基化過程增多;而在4～8 d這一發(fā)育階段,多態(tài)性比例快速下降(29.1％、13.3％),表明甲基化模式變異減少。種子萌發(fā)過程中,A類型在多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)的比例分別為65.7％、54.7％、50.8％、72.3％和91.7％,呈現(xiàn)先緩慢減小再快速增大的趨勢,可以看出在0～2 d這一階段發(fā)生甲基化數(shù)目持續(xù)增多,但在2～8 d這一階段發(fā)生去甲基化的數(shù)目大量增加,最終導(dǎo)致去甲基化位點(diǎn)數(shù)目是甲基化位點(diǎn)數(shù)目的11倍。無論是種子萌發(fā)過程中的哪一個(gè)時(shí)期,A類型都是多態(tài)性位點(diǎn)的最主要類型,發(fā)生去甲基化的位點(diǎn)數(shù)高于發(fā)生甲基化的位點(diǎn)數(shù),可見9#種子在萌發(fā)過程中同時(shí)存在DNA的甲基化和去甲基化作用,從整體上來看,以去甲基化為主。羽衣甘藍(lán)自交不親和系9#種子發(fā)育過程中的同一位點(diǎn)甲基化的反復(fù)變化可以說明部分基因在其發(fā)育過程中經(jīng)歷了反復(fù)的表達(dá)和沉默,這些位點(diǎn)高頻率的變化可能與發(fā)育有關(guān),這些位點(diǎn)的具體功能還需要后續(xù)測序并對其進(jìn)行功能性的驗(yàn)證。

2.3羽衣甘藍(lán)自交不親和與自交親和系種子基因組DNA甲基化差異分析

對羽衣甘藍(lán)自交不親和系9#種子萌發(fā)過程不同時(shí)期的基因組DNA甲基化水平研究發(fā)現(xiàn),9#種子在萌發(fā)2 d時(shí)基因組DNA甲基化水平達(dá)到最高。為探究自交不親和系與自交親和系種子萌發(fā)過程中基因組DNA甲基化水平的差異,選取萌發(fā)2 d這一特殊的發(fā)育時(shí)期,以9#與14#種子萌發(fā)0 d和2 d為試材,進(jìn)行MSAP分析,統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增條帶(表4)。

由表可知,相同發(fā)育時(shí)期的9#與14#相比較,9#總甲基化、全甲基化、半甲基化水平均高于14#;無論是9#還是14#,萌發(fā)2 d時(shí)的總甲基化、全甲基化、半甲基化水平均高于0 d。從0～2 d,9#總甲基化水平上升幅度(25.4％～28.9％)與14#總甲基化水平上升幅度(21.3％～24.4％)接近,9#全甲基化水平上升幅度(14.3％～17.4％)明顯高于14#(13.6％～14.1％),而14#半甲基化水平上升幅度(7.7％～10.3％)明顯高于9#(11.1％～11.4％)。在9#和14#種子發(fā)芽0 d和2 d這2個(gè)時(shí)期,全甲基化水平均高于半甲基化水平,表明在這一發(fā)育階段中,雙鏈內(nèi)側(cè)胞嘧啶甲基化為9#和14#基因組DNA甲基化主要方式。

3　討論

DNA甲基化在植物的生長發(fā)育及基因表達(dá)調(diào)控等過程中發(fā)揮著重要作用[18],是植物表觀遺傳修飾的主要方式之一[19-20]。大量的證據(jù)表明,在植物發(fā)育不同階段,植物主要以胞嘧啶甲基化來調(diào)控基因表達(dá)[21],與其他植物一樣,羽衣甘藍(lán)種子的生長發(fā)育實(shí)際上就是基因有序調(diào)控表達(dá)的過程,因此本試驗(yàn)采用MSAP方法對羽衣甘藍(lán)種子胞嘧啶甲基化水平進(jìn)行研究。在植物種子胚胎發(fā)生早期,正確的甲基化模式是確保合子正常分裂并最終發(fā)育成有生命活力種子的基礎(chǔ)[22]。為了研究羽衣甘藍(lán)自交不親和系種子退化與DNA甲基化的相關(guān)性,就要明確種子萌發(fā)過程中DNA甲基化的變化規(guī)律和特點(diǎn)。從本文研究結(jié)果中可看到,羽衣甘藍(lán)9#種子在萌發(fā)過程中,其甲基化水平變化明顯,模式變化頻繁、樣式眾多、涉及位點(diǎn)也較多。

表3　9#種子萌發(fā)過程中相鄰發(fā)育時(shí)期DNA甲基化變化模式Table 3　DNA methylation patterns of adjacent developmental stages in seed germination

表4　9# 與14#種子在萌發(fā)0 d、2 d基因組DNA甲基化水平Table 4　Methylation levels of 0 h and 48 h at seeding stages of 9#and 14#

在高等植物中,種子胞嘧啶甲基化水平因植物種類而異,油菜種子甲基化水平為15.7％[23],大麥種子甲基化水平為60.5％[24],不同生態(tài)型的擬南芥中為35.0％～43.0％[25]。這些不同物種間種子DNA甲基化水平的差異,一方面可能與檢測方法、試驗(yàn)條件有關(guān),另一方面可能是遺傳控制的結(jié)果。本研究結(jié)果顯示,無論在9#種子萌發(fā)的哪一個(gè)時(shí)期中,全甲基化水平均高于半甲基化水平,表明雙鏈內(nèi)側(cè)胞嘧啶甲基化程度始終高于單鏈外側(cè)胞嘧啶甲基化程度,9#種子在萌發(fā)過程中CCGG位點(diǎn)發(fā)生甲基化的方式主要是以雙鏈內(nèi)側(cè)胞嘧啶甲基化為主,這與甘藍(lán)型油菜種子萌發(fā)過程一致[23]。從甲基化模式變化上來看,在萌發(fā)早期(0～2 d),發(fā)生甲基化的多態(tài)性條帶占多態(tài)性條帶比例逐漸升高,并在萌發(fā)48 h時(shí)比例達(dá)到最高,表明在0～2 d內(nèi)隨著種子的萌發(fā),甲基化發(fā)生增多;在萌發(fā)后期(2～8 d),發(fā)生甲基化的多態(tài)性條帶比例快速下降并在萌發(fā)8 d時(shí)比例達(dá)到最低,表明在2～8 d內(nèi)隨著種子的萌發(fā),去甲基化發(fā)生增多,從而可能導(dǎo)致在植物生長發(fā)育中部分必要的基因表達(dá)關(guān)閉,這可能與自交不親和系種子退化現(xiàn)象有關(guān);在萌發(fā)后期(2～8 d)主要發(fā)生大量去甲基化過程,激活部分基因的表達(dá),整體上來看,9#種子萌發(fā)過程中,主要發(fā)生去甲基化事件。這一結(jié)果和陸光遠(yuǎn)等在油菜種子萌發(fā)過程中DNA甲基化的MSAP分析一致[24]。

前人的研究資料表明,植物在發(fā)育過程中,胞嘧啶的甲基化對基因具有重要的表達(dá)調(diào)控作用,在基因的內(nèi)部或鄰近區(qū)域發(fā)生甲基化可以抑制這些基因的表達(dá),而去甲基化后又可以激活基因的表達(dá),因此,對于這些基因而言,去甲基化似乎是基因表達(dá)的必須步驟。羽衣甘藍(lán)種子萌發(fā)過程中檢測到大量的去甲基化事件,是與種子萌發(fā)后啟動(dòng)了大量基因的表達(dá)相一致的。在種子萌發(fā)過程中同時(shí)還觀察到少量的甲基化事件,暗示部分基因正在關(guān)閉。這表明,植物通過DNA甲基化和去甲基化的方式實(shí)現(xiàn)基因的有序表達(dá)。

成長于相同環(huán)境下的2個(gè)羽衣甘藍(lán)品種自交不親和系9#和自交親和系14#在種子活力、幼苗長勢、植株表型等方面有著不同的表現(xiàn),盡管大多數(shù)的表型變異來自于自然遺傳變異,但是否與種子萌發(fā)過程中甲基化變化情況有關(guān),這仍需我們研究探索。目前已有對相同植物種屬的不同品種間甲基化修飾水平的研究報(bào)道,如在對大麥2個(gè)品種Steptoe (六棱飼草大麥,高度休眠)和Morex (六棱啤酒大麥,無休眠)種子成熟和萌發(fā)過程中全基因組DNA甲基化多樣性的研究發(fā)現(xiàn),表觀遺傳變異(15％)高于基因組遺傳變異(6.9％),在大麥種子成熟和萌發(fā)不同時(shí)期,Morex的DNA甲基化水平略高于相應(yīng)時(shí)期StePtoe的DNA甲基化水平[25]。對4個(gè)煙草品種云煙85、北卡89、K326、云煙87的基因組DNA甲基化研究發(fā)現(xiàn)[26],同一地點(diǎn)同一取樣時(shí)間的不同品種間甲基化情況有很大差異,表明相同植物種屬的不同品種間甲基化修飾水平不同。本試驗(yàn)對相同種屬的2個(gè)不同品種9#與14#種子萌發(fā)0 d和2 d全基因組DNA甲基化情況進(jìn)行研究,旨在探索自交不親和系9#種子退化現(xiàn)象與甲基化的相關(guān)性。試驗(yàn)結(jié)果表明,羽衣甘藍(lán)自交親和系與自交不親和系這兩個(gè)品系之間所表現(xiàn)出來的較大的甲基化狀態(tài)差異,可能會(huì)影響基因在種子發(fā)育過程中經(jīng)歷表達(dá)和沉默,而這些基因表達(dá)的開啟和關(guān)閉,可能是自交不親和9#種子退化,植株發(fā)育退化的原因之一。

4　結(jié)論

利用MSAP技術(shù),對羽衣甘藍(lán)自交不親和系9#種子萌發(fā)過程不同時(shí)期基因組DNA甲基化差異的研究中得到:萌發(fā)過程中總甲基化水平呈現(xiàn)出先緩慢上升再明顯下降的趨勢;同時(shí)發(fā)生甲基化與去甲基化,但是去甲基化占主導(dǎo)地位;此外在種子發(fā)育過程中還發(fā)現(xiàn)同一位點(diǎn)甲基化模式的反復(fù)變化現(xiàn)象。對羽衣甘藍(lán)自交不親和系9#種子與自交親和系14#種子的DNA甲基化差異研究中得到:在相同發(fā)育時(shí)期,9#的總甲基化、半甲基化、全甲基化水平在不同程度上均高于14#,二者CCGG位點(diǎn)發(fā)生甲基化的方式都主要以雙鏈內(nèi)側(cè)胞嘧啶甲基化為主;隨著種子的萌發(fā),9#全甲基化水平明顯升高,半甲基化水平幾乎無變化;而14#半甲基化水平明顯升高,全甲基化水平幾乎無變化。這些結(jié)果為進(jìn)一步探討羽衣甘藍(lán)生長發(fā)育及器官分化過程中甲基化與去甲基化對相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的作用奠定了基礎(chǔ)。

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DNA Methylation Dynamic Analysis of Self Compatible Line and Self-Incompatible Line of Brassica oleracea var.acephala at Seed Germination Stage

ZHANG Yang1,HU Zhong-Ying1,ZHAO Yue-Ming1,LI Na2,and XIE Li-Nan1,*1College of Life Sciences,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China;2Heilongjiang Vocational College of Biology and Technology,Harbin 150025,China

Abstract:The seed of self-incompatible line often degraded.This study aims to clarify the relationship between the degradation of the seeds and methylation.In this experiment,methylation sensitive amplification polymorphism (MSAP) was used to study the status and patterns of the DNA methylation at different periods in seed germination of self-incompatible line 9#and self-compatible line 14#.The improved CTAB method is adopted to extract seed germination in different periods of DNA,and then through the MSAP analysis,statistical amplification bands,compare the differences between 9#and 14#.The results are shown as follows:DNA methylation modification throughout the whole process of seed germination of 9#,at the early stage of the germination (0 to 2 days) methylation sites continued to increase;at the later stage (2 to 8 days) demethylation increased apparently,and eventually the number of demethylation was 11 times more than methylation.It was proved that DNA methylation modification was an important way to regulate the gene expression during seed germination of self-incompatible line 9#.Self-incompatible line 9#and self-compatible line 14#had different DNA methylation status clearly at the respectively periods of 0 and 2 days after seed germination.The proportion of total methylation,full-methylation and semi-methylation of 9#was all higher than of 14#at the same period.As seedings continued to grow after germination,in 9#,the proportion of full-methylation increased clearly and almost that of semi-methylation did not change,while in 14#,the proportion of semi-methylation increased clearly andbook=533,ebook=72almost that of full-methylation did not change.

Keywords:Brassica oleracea var.acephala;Self-incompatibility;Self-compatibility;DNA methylation

收稿日期Received():2015-07-21;Accepted(接受日期):2015-11-20;Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期):2015-12-18.

*通訊作者(

Corresponding author):解莉楠,E-mail:linanxie@126.com

DOI:10.3724/SP.J.1006.2016.00532