陳蘭妹　唐靈芝　吳雅茗　林小華

廈門醫(yī)學高等?？茖W校，福建　廈門　361002

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刺莧根提取物化學成分分析及其排石活性初探

陳蘭妹唐靈芝吳雅茗林小華

廈門醫(yī)學高等?？茖W校，福建廈門361002

【摘要】目的：對刺莧根分部位成分進行分析及對正丁醇提取部分進行排石活性研究。方法：采用不同極性溶劑對刺莧根提取后進行成分分析；選取正丁醇提取部位，對乙醛酸誘導的C57BL/6小鼠連續(xù)灌胃5d后，取心臟血測血漿肌酐(CRE)及血漿尿素氮(BUN)濃度；取左側腎臟測腎組織鈣含量。結果：刺莧的正丁醇部位提取物，在25mg/ml及50mg/ml兩個劑量水平均能明顯降低腎臟組織的鈣含量，確實具有明確的排石效果；同時能明顯降低血漿CRE及BUN含量，能夠明顯恢復腎臟排泄功能。結論：刺莧對乙醛酸所致的小鼠草酸鈣結石模型有明確的排石活性。

【關鍵詞】刺莧根；乙醛酸；C57BL/6小鼠；排石

刺莧為莧科莧屬植物刺莧(AmaranthusspinosusL)的全草，分布于華東、中南、西南、陜西等地。刺莧甘、涼，歸肺、肝二經，具有涼血止血，清利濕熱，解毒消癰等功效[1]。在閩西民間被廣泛用于腎結石的治療，排石效果好，治療周期短。目前，國內外對刺莧的藥理作用研究主要集中在抗炎鎮(zhèn)痛、利尿、退熱、改善免疫、降血糖、保肝、抗瘧、抗菌、抗氧化等方面[2]，未見有關于刺莧排石活性的實驗研究報道。同時，關于刺莧治療腎結石的臨床資料亦較少，文獻復習僅見俞艷春[3]報道用刺莧根治療腎結石患者76例，排石率達70%以上。

研究對刺莧根進行活性成分提取并進行化學定性分析，再利用小鼠草酸鈣腎結石模型，通過測定實驗動物血漿肌酐及尿素氮的含量、測定實驗動物腎臟組織的鈣含量，量化評價刺莧對乙醛酸所致的C57BL/6小鼠草酸鈣腎結石模型的排石作用，以期為刺莧排石活性提供依據(jù)。

1實驗材料

1.1藥物與試劑刺莧采集于福建省漳平市和平鎮(zhèn)野地，由廈門醫(yī)學高等?？茖W校中藥鑒定鮑紅娟副教授鑒定為AmaranthusspinosusL.。乙醛酸(Sigma-Aldrich)、尿素氮試劑盒(脲酶法)、肌酐試劑盒(肌氨酸氧化酶法)、Ca試劑盒(微板法)均為南京建成生物工程研究所產品；其它試劑均為國產分析純。

1.2動物6~8周齡C57BL/6小鼠24只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.3儀器Thermo Labsystems Multiskan Spectrum酶標儀(芬蘭Labsystems)；BT125D天平(賽多利斯)；PHS-3CpH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)； N-1200B旋轉蒸發(fā)儀(EYELA)；Freezone 6冷凍干燥機(LABCONCO)；ULT2186-4V立式超低溫冰箱(Thermo)。

2方法

2.1刺莧根提取物制備刺莧根洗凈干燥粉碎，用60%乙醇按生藥比1∶4浸漬過夜后，加熱回流提取2次，每次2h。醇提液經濃縮后，藥液按1∶1比例用石油醚萃取分離4次。石油醚不溶物按1∶1比例用乙酸乙酯萃取分離4次。石油醚不溶物按1∶1比例用水飽和正丁醇加熱回流3次。分別得到石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液、水液共四部分提取物。分別減壓蒸餾盡可能除去溶劑得濃縮物，濃縮物用適量水熱溶，冷凍干燥。分別得石油醚提取部分濃縮物，乙酸乙酯提取部分濃縮物，正丁醇提取部分濃縮物，水提取部分濃縮物。各部位提取濃縮物進行氨基酸、多肽、蛋白質、糖、多糖、苷類、生物堿類、黃酮、蒽醌類、強心苷、酚類、植物甾醇、三萜等物質的化學定性試驗[4](結果見表2)。選取正丁醇部位提取物研究其對小鼠草酸鈣腎結石模型的排石作用。

2.2實驗動物分組給藥與取材將C57BL/6小鼠隨機分成4組，分別為正常對照組、模型組、刺莧低劑量組(25mg/mL)、刺莧高劑量組(50mg/ml)，每組6只，適應性喂養(yǎng)一周后進行實驗。參照Atsushi Okada[5-6]及賈猛[7]的方法制作C57Bl/6小鼠草酸鈣腎結石模型。各實驗組動物根據(jù)體重以0.2ml/10g的劑量，每日灌胃給予藥物(刺莧正丁醇提取物水溶液)或對照物(超純水)，半小時后再根據(jù)體重以0.2ml/10g的劑量，腹腔給予造模劑(80mg/ml乙醛酸)或對照物(生理鹽水)。具體給藥設計見表1。連續(xù)給藥造模5d，末次給藥24h后，乙醚麻醉實驗動物，取心臟血測血漿肌酐(CRE)及血漿尿素氮(BUN)濃度；取左側腎臟測腎組織鈣含量。

表1　實驗動物給藥方案設計

2.3血肌酐、尿素氮的測定實驗小鼠全血，肝素抗凝，2400r離心5min后取上層血漿待測。按試劑盒操作步驟，用肌氨酸氧化酶測定CRE含量，脲酶法測BUN含量。

2.4腎組織鈣含量的測定左腎組織剝除包膜后稱重，按1∶4重量/體積比，加入超純水后勻漿，勻漿液120℃ 干燥至樣本炭化，加0.2mL濃硝酸，80℃水浴消解得黃色清亮消解液，十倍量稀釋后按照試劑盒操作步驟測定組織鈣含量。

2.5統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和發(fā)差齊性檢驗；組間數(shù)據(jù)采用ANOVA方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3結果

3.1刺莧根各部位提取物化學定性分析結果通過化學定性實驗對刺莧根的各部位提取物進行化學定性分析(見表2)可知，水提取部分含糖、多糖、苷類、有機酸類、生物堿類等物質；正丁醇提取部位含有機酸類、強心苷類、甾醇三萜類、生物堿類等物質；乙酸乙酯提取部分含黃酮類、蒽醌類、植物甾醇三萜類、生物堿類等物質；石油醚提取部分含黃酮類、植物甾醇類物質。

3.2血漿CRE及BUN濃度、腎組織鈣含量模型組小鼠血漿CRE、BUN濃度及腎組織鈣含量均顯著高于陰性對照組小鼠。刺莧低劑量組及高劑量組血漿CRE、BUN濃度及腎組織鈣含量均顯著低于模型組小鼠，與陰性對照組小鼠相比差異無統(tǒng)計學意義。提示刺莧正丁醇提取物的25mg/ml及50mg/ml口服劑量均能顯著減少乙醛酸導致的小鼠腎臟草酸鈣結石沉積，并對腎臟排泄CRE及BUN有明顯的改善作用。實驗結果見表3及圖1~3示。

表2　刺莧根各部位提取物化學定性分析

注：“+”表示鑒別反應呈陽性；空格表示鑒別反應呈陰性

表3　刺莧正丁醇提取物對腎結石模型小鼠血漿CRE、BUN濃度以及腎組織Ca含量的影響　±s，n=6)

注：與陰性對照組相比，#P< 0.05； 與模型組相比，△P<0.05。

4討論

泌尿系結石是泌尿外科的常見病，其發(fā)病率居高不下，結石引起的尿路梗阻可嚴重影響腎臟的泌尿功能，對患者的生活質量產生嚴重影響。隨著“體外沖擊波碎石術(ESWL)”的發(fā)展，尿路結石患者不需傳統(tǒng)的開放式尿路取石手術即可在損傷很小的情況下去除結石，解除病痛。但ESWL仍可能會造成腎損傷，且碎石后的殘余結石碎片也為新結石成核提供機會從而造成結石復發(fā)。而中藥對于停留時間短暫、橫徑<0.6cm的小結石有良好的治療效果，其排石率明顯高于單純西醫(yī)治療。因此尋找預防結石形成及復發(fā)的有效藥物具有積極意義。刺莧分布范圍廣泛，廉價易得，在閩西民間被廣泛用于腎結石的治療，但目前關于刺莧排石活性及其機制的研究報道極少，值得深入開展研究。

大約3/4的泌尿系結石含有草酸鈣的成分[8]，故研究選取小鼠草酸鈣腎結石模型，研究刺莧提取物的排石活性。通過給藥組與模型組實驗數(shù)據(jù)相比較，結果顯示刺莧的正丁醇部位提取物，在25mg/ml(相當于36g生藥/kg體重)及50mg/ml(相當于72g生藥/kg體重)兩個劑量水平均能明顯降低腎臟組織的鈣含量，具有明顯的排石效果，同時能明顯降低血漿CRE及BUN含量，能夠明顯恢復腎臟排泄功能。

實驗研究證實刺莧對乙醛酸所致的小鼠草酸鈣結石模型有明確的排石活性，但其排石的作用機制仍有待進一步研究。Arul Amuthan 等[9]報道了刺莧具有利尿作用且其利尿作用機理類似于噻嗪類利尿劑，而噻嗪類利尿劑是臨床上常用的一類含鈣結石的治療藥物，考慮刺莧的排石作用可能是通過其利尿作用實現(xiàn)，在此基礎上刺莧對腎臟是否存在其它途徑的保護作用仍有待進一步研究證實。

參考文獻

[1]江蘇新醫(yī)學院編.中藥大辭典(上冊)[M].上海:上海科學技術出版社,1979:1370.

[2]曾恕芬,丁艷芬,楊崇仁. 民間中草藥刺莧的化學與藥理研究進展[J].中國民族民間醫(yī)藥，2012,21(14):42-43.

[3]俞艷春.刺莧根治療腎結石[J].中國民間療法,2009,17(12):66.

[4]廖里,鄭作文.刺莧的藥理研究[J].廣西中醫(yī)學院學報,1999,16(3):107-109.

[5]Atsushi Okada, Shintaro Nomura, Yuji Higashibata, et al. Successful formation of calcium oxalate crystal deposition in mouse kidney by intraabdominal glyoxylate injection[J]. Urol Res,2007,35:89-99.

[6]Atsushi Okada, Takahiro Yasui, Shuzo Hamamoto, et al. Genome-Wide Analysis of Genes Related to Kidney Stone Formation and Elimination in the Calcium Oxalate Nephrolithiasis Model Mouse: Detection of Stone-Preventive Factors and Involvement of Macrophage Activity[J]. Journal of Bone and Mineral Research,2009,24(5): 908-923.

[7]賈猛,諶衛(wèi),胡海燕,等. 復方金錢草減輕小鼠草酸鈣結晶腎損傷的實驗研究[J].中國中西醫(yī)結合腎病雜志,2013,14(11)：947-950.

[8]葉章群,鄧耀良,董誠,等.泌尿系結石[M]. 2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2003:9-13.

[9]Arul Amuthan, Bharti Chogtu, K.L. Bairy, et al. Evaluation of diuretic activity of Amaranthus spinosus Linn. Aqueous extract in Wistar rats[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2012(140):424-427.

Chemical Composition Analysis ofAmaranthusspinosusLinn. Extracts and Evaluation of the Effect of Discharging Kidney Calculus

CHEN LanmeiTANG LingzhiWU YamingLIN Xiaohua

Xiamen Medical College,Xiamen 361002,China

Abstract:Objecive: This study was aimed to analyze the chemical compositions of Amaranthus spinosus Linn. extracts obtained using various solvent systems. N-butanol extract was further evaluated for the discharging effect of kidney calculus. Methods: Amaranthus spinosus Linn. extracts were obtained with solvent systems of different polarity and subject to chemical composition analysis. N-butanol extract was selected and administered daily by oral gavage to C57BL/6 mice for five continuous days. At the time mice were removed from the study, the heart blood plasma was collected for creatinine (CRE) and blood urea nitrogen (BUN) level, and the left kidney tissue was collected for Ca(2+) concentration. Results: N-butanol extract of Amaranthus spinosus Linn. clearly decrease the calcium level in kidney tissue at 25mg/ml and 50mg/ml doses, demonstrating the calculus discharging effect. Meanwhile, the creatinine (CRE) and blood urea nitrogen (BUN) levels were also clearly decreased, indicating the recovery of kidney function. Conclusion: The result clearly indicates n-butanol extracts of Amaranthus spinosus Linn. demonstrate discharging effect of kidney calculus in glyoxylic acid-induced calcium oxalate calculus mice model.

Key words:Amaranthus spinosus Linn.; glyoxylic acid; C57BL/6 mice; discharging effect of urinary calculus

(收稿日期：2015.12.16)

【中圖分類號】R284.1

【文獻標志碼】A

【文章編號】1007-8517(2016)05-0006-03