謝麗　李海燕

【摘要】作為對(duì)超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究的一種重要手段，掃描電子顯微鏡在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用受到高度重視。作者以“突出應(yīng)用，簡(jiǎn)化原理、立足平臺(tái)儀器”為原則，從課程目標(biāo)、課程內(nèi)容、課程完成的情況等方面，探索為生命科學(xué)學(xué)院研究生開設(shè)掃描電鏡課程的創(chuàng)新方法。

【關(guān)鍵詞】掃描電子顯微鏡 生命科學(xué) 研究生課程 創(chuàng)新方法

【基金項(xiàng)目】由“中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金”重點(diǎn)研究基地團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目資助的，項(xiàng)目編號(hào)：lzujbky-2014-bt05。

【中圖分類號(hào)】G64 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2095-3089（2016）06-0016-02

生命科學(xué)的理論和應(yīng)用歸根到底來(lái)自實(shí)驗(yàn)，并由實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)。近30年來(lái)，生命科學(xué)的發(fā)展極其迅速，取得了一系列令人矚目的成就。其中，大型精密儀器的作用功不可沒。大型儀器為研究生命物質(zhì)的作用和功能提供了定位、定性、定量，甚至實(shí)時(shí)的數(shù)據(jù)和圖片，為生命科學(xué)的重大發(fā)現(xiàn)提供著強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，決定性地引導(dǎo)著相關(guān)研究領(lǐng)域的發(fā)展方向。掃描電子顯微鏡是一種用電子束掃描樣品表面，通過電子束與樣品的相互作用產(chǎn)生多種效應(yīng)，從而獲取樣品表面放大的形貌像。這個(gè)像是在樣品被掃描時(shí)按時(shí)序建立起來(lái)的，其放大倍率從幾倍到幾十萬(wàn)倍連續(xù)可調(diào)，景深大，分辨率高，保真度好。在立體、清晰、多觀察角度等方面均較普通光學(xué)顯微鏡有不可比擬的優(yōu)越性。作為對(duì)超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究的一種重要手段，在生命科學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用受到高度重視。因此，為研究生設(shè)置掃描電鏡課的重要意義不言而喻。

1.課程內(nèi)容的設(shè)置

本門課程是以蘭州大學(xué)研究型生命科學(xué)大型儀器共享平臺(tái)為依托，授課所使用的Hitachi 3400N型掃描電鏡隸屬于該平臺(tái)，授課團(tuán)隊(duì)的各成員均來(lái)自于該平臺(tái)，且具有較豐富的生命科學(xué)的教育和科研背景，授課的對(duì)象也是生命科學(xué)各專業(yè)的研究生。基于此，并針對(duì)將經(jīng)常到平臺(tái)使用掃描電鏡的各專業(yè)研究生的學(xué)習(xí)特點(diǎn)和科研任務(wù)，本課程內(nèi)容的設(shè)置原則是：突出應(yīng)用，簡(jiǎn)化原理、立足平臺(tái)儀器。課程內(nèi)容強(qiáng)調(diào)掃描電鏡的功能及其各項(xiàng)性能指標(biāo)在生物體系內(nèi)的科學(xué)意義，簡(jiǎn)化儀器本身復(fù)雜的物理化學(xué)原理。這種將儀器功能和生物學(xué)特征直接聯(lián)系的課程，拉近了掃描電鏡和學(xué)生之間的距離。

1.1 課程目標(biāo)

對(duì)授課對(duì)象而言，本課程的目標(biāo)主要分三個(gè)方面：理論知識(shí)目標(biāo)、能力目標(biāo)和素質(zhì)目標(biāo)。理論知識(shí)目標(biāo)是讓學(xué)生了解Hitachi 3400N型掃描電鏡的工作原理、儀器構(gòu)造，掌握重要的儀器性能指標(biāo)和相關(guān)的儀器術(shù)語(yǔ)；掌握基本的樣品制備方法；掌握獲取優(yōu)質(zhì)掃描電子像的方法。能力目標(biāo)是讓學(xué)生能夠正確地使用和操作儀器，能夠簡(jiǎn)單排除故障，學(xué)會(huì)知識(shí)遷移的能力，從而多角度、多參數(shù)、多指標(biāo)的去驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中所得到的相同的理論結(jié)果。素質(zhì)目標(biāo)是培養(yǎng)學(xué)生的安全意識(shí)；培養(yǎng)學(xué)生精益求精、實(shí)事求是、一絲不茍的科研素質(zhì)；培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新素質(zhì)。對(duì)授課者及所屬儀器共享平臺(tái)而言，其目標(biāo)是增強(qiáng)管理人員的業(yè)務(wù)素質(zhì)，緩解平臺(tái)技術(shù)力量不足，提高掃描電鏡的利用效率等。

1.2 課程內(nèi)容的設(shè)置

本課程的內(nèi)容見圖1。課程內(nèi)容分課堂講授理論知識(shí)和上機(jī)實(shí)訓(xùn)兩個(gè)部分。本門課程總學(xué)時(shí)為18個(gè)學(xué)時(shí)，理論知識(shí)占6個(gè)學(xué)時(shí)，上機(jī)實(shí)訓(xùn)占12個(gè)學(xué)時(shí)。理論知識(shí)采取集中授課的方式進(jìn)行，上機(jī)實(shí)訓(xùn)按專業(yè)特點(diǎn)和研究方向分為植物組、動(dòng)物組、微生物組和細(xì)胞組，各組獨(dú)立制樣，上機(jī)實(shí)訓(xùn)；按實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)步驟、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論的內(nèi)容完成并提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告；最后分組討論。

2.課程的完成情況及結(jié)果

2.1 課程完成情況

順利完成了理論知識(shí)講授部分。因授課人員和掃描電鏡資源的缺乏，選課人數(shù)控制在15人以內(nèi)，實(shí)際選課人數(shù)為15人。把15人按研究方向分為四組，分組情況及各組的實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊姳?。按組進(jìn)行上機(jī)實(shí)訓(xùn)，以下將對(duì)上機(jī)實(shí)訓(xùn)的情況做相關(guān)陳述。

（1） 樣品制備方法的探索

探索樣品的制備方法，該任務(wù)由微生物組和植物組來(lái)完成。微生物組所用材料為檸檬酸桿菌，樣品制備實(shí)驗(yàn)共分四組，考察固定次數(shù)、固定時(shí)間和脫水劑濃度梯度、脫水時(shí)間對(duì)掃描圖像的影響，各組的實(shí)驗(yàn)步驟和所用材料、試劑見表2。植物組所用材料為擬南芥葉片和紫萍葉片，樣品制備共分三組，考察三種不同的樣品處理方式對(duì)掃描圖像的影響，各組的實(shí)驗(yàn)步驟和所用材料、試劑見表3。

動(dòng)物組所用材料為阿拉善雙峰駝的頭部皮膚，樣品處理不分組，該實(shí)驗(yàn)步驟和所用材料、試劑見表4。動(dòng)物細(xì)胞組因材料不同樣品制備被分為兩組，第一組的材料是小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞，為貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，其樣品制備的方法與植物組中的化學(xué)試劑處理組相同；第二組的材料是白血病細(xì)胞系（HL-60），為懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，其樣品制備的方法與微生物組中的常規(guī)組相同。

以上各種樣品制備過程中用到的化學(xué)試劑均為分析純，干燥所用的儀器為日立冷凍真空干燥儀（ES-2030），噴金所用的儀器為日立離子濺射儀（E-1010）。

（2）體會(huì)SEM各儀器參數(shù)的改變對(duì)圖像質(zhì)量的影響

影響掃描電鏡圖像質(zhì)量的因素主要有三部分：第一部分是儀器的工作狀態(tài)。獲取圖像時(shí)要使儀器處于正常的工作狀態(tài)，所謂儀器的正常工作狀態(tài)是指：鏡筒足夠清潔、電子系統(tǒng)的安裝和調(diào)節(jié)無(wú)誤、準(zhǔn)確合軸對(duì)稱，能進(jìn)行高倍聚焦、電噪音足夠小。第二部分是樣品材料要無(wú)水無(wú)揮發(fā)性物質(zhì)，具有一定的機(jī)械輕度，能耐受電子束的轟擊，具有導(dǎo)電性，能產(chǎn)生足夠的信號(hào)。

掃描電鏡圖像質(zhì)量的高低除了儀器本身的狀態(tài)和樣品材料的狀態(tài)問題外，更主要的是操作條件，也就是儀器參數(shù)的設(shè)置決定的。應(yīng)根據(jù)不同的樣品選擇最佳的掃描參數(shù)，才能得到高質(zhì)量的圖像。這些儀器參數(shù)主要有：加速電壓、掃描速度、工作距離、探針電流、物鏡光闌孔徑、信噪比和象散校正。

上機(jī)實(shí)訓(xùn)的主要目的就是體會(huì)SEM各儀器參數(shù)的改變對(duì)圖像質(zhì)量的影響，并學(xué)會(huì)如何設(shè)置各個(gè)參數(shù)。

2.2結(jié)果

（1）樣品制備的探索結(jié)果

豐島等人的研究表明，樣品經(jīng)戊二醛固定后乙醇梯度脫水，樣品的收縮率與脫水時(shí)間有很大的關(guān)系，脫水時(shí)間越長(zhǎng)，收縮越大，反之則越小。特別是樣品直接進(jìn)行70%-90%-100%的乙醇梯度脫水，每步的脫水時(shí)間控制在5min以內(nèi)幾乎沒有收縮。嬌弱樣品的掃描電鏡制樣中，常規(guī)的固定方法是采用戊二醛和鋨酸雙固定，固定程序操作復(fù)雜且耗時(shí)，此外，鋨酸昂貴且需要進(jìn)口。徐柏森等人使用戊二醛一種固定劑，縮短固定時(shí)間至30min，在固定后直接進(jìn)行70%-90%-100%的乙醇梯度脫水，每個(gè)濃度脫水1次，每次5min，獲得了良好的掃描電鏡圖片。在上述研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，本次課程讓微生物組把樣品制備實(shí)驗(yàn)分為了四組，第三組、第四組都使用戊二醛一種固定劑，固定時(shí)間縮短至20min，在固定后直接進(jìn)行70%-90%-100%的乙醇梯度脫水，每個(gè)濃度脫水1次，第三組每次5min，第四組每次2min。也均獲得了良好的掃描電鏡圖片。

（2）體會(huì)改變SEM各儀器參數(shù)對(duì)電鏡圖像的影響

各組根據(jù)自己材料的不同，均能找到適合自己材料的各儀器參數(shù)，達(dá)到了上機(jī)實(shí)訓(xùn)的目的。

3.結(jié)語(yǔ)

綜上所述，通過課前制定科學(xué)詳細(xì)的課程規(guī)劃，這種“突出應(yīng)用，簡(jiǎn)化原理，立足平臺(tái)儀器”的理論體系和具有專業(yè)及實(shí)際特色的上機(jī)實(shí)訓(xùn)體系，使掃描電鏡課程深受學(xué)生的歡迎，收到了良好的效果，同時(shí)也最大程度地發(fā)揮了現(xiàn)有儀器的資源優(yōu)勢(shì)和師資特長(zhǎng)。

在以后的課程中，我們將對(duì)生命科學(xué)各種材料的制樣方法分階段進(jìn)行更高層次的探索，從而簡(jiǎn)化制樣步驟和創(chuàng)建新的制樣方法，為獲取優(yōu)質(zhì)掃描電鏡圖像提供最基本的保證，為本院研究生的科研競(jìng)爭(zhēng)力提供更優(yōu)秀的技術(shù)平臺(tái)。

參考文獻(xiàn)：

[1]章曉中. 電子顯微分析[M]. 北京：清華大學(xué)出版社，2006. [2]徐柏森，馮汀，劉剛. 掃描電鏡生物樣品的快速制備方法研究，中國(guó)野生植物資源，2000，19（6）：47-49.

[3]豐島良太等。第五回醫(yī)學(xué)生物學(xué)走查電顯シソボジウム記錄1976： 17.