崔 　 靜，　李 　 成，　孫 曉 萌，　劉 佳 欣，　張 　 涵，　叢 麗 娜

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連　116034 )

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海參腸道酵母菌產(chǎn)胞外多糖的抗氧化性

崔 靜，李 成，孫 曉 萌，劉 佳 欣，張 涵，叢 麗 娜

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連116034 )

摘要:研究了3株源于海參腸道的酵母菌HS-J6，HS-J8和HS-J9中胞外多糖的提取及其抗氧化活性。采用95%乙醇沉淀、Sevage法除蛋白、透析、冷凍干燥獲得其胞外粗多糖，分別命名為EPS6、EPS8和EPS9，采用3種方法測定它們產(chǎn)胞外多糖的抗氧化能力。結(jié)果表明，3種胞外多糖都具有一定的抗氧化能力，EPS6和EPS8的還原力相近，明顯高于EPS9。EPS9對的清除能力最強(qiáng)，清除率最大為35.3%；EPS6對·OH 的清除能力最強(qiáng)，最高可達(dá)91.5%。

關(guān)鍵詞:酵母菌；胞外多糖；抗氧化

0引言

微生物多糖是細(xì)菌、真菌、藍(lán)藻等微生物在代謝過程中產(chǎn)生的對微生物有保護(hù)作用的生物高聚物，具有還原氧化劑的能力，又因其安全無毒、理化性質(zhì)獨(dú)特等優(yōu)良性質(zhì)而倍受關(guān)注[1]。研究發(fā)現(xiàn)，海洋共附生微生物可能參與大型宿主生物的生物合成、代謝及其他生命活動[2]。海洋共附生微生物胞外多糖的特殊結(jié)構(gòu)和功能已引起廣泛關(guān)注，是開發(fā)多糖類海洋新藥的重要資源[3-4]。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

3株酵母菌HS-J6，HS-J8和HS-J9，本實(shí)驗(yàn)室分離保藏。

1.1.2培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨1%，硫酸銨1.5%，磷酸二氫鉀0.25%，pH 6.6～6.7。

1.2方法

1.2.1胞外多糖的提取

1.2.1.1酵母菌的發(fā)酵培養(yǎng)

將-80 ℃保藏的菌株，按4%體積分?jǐn)?shù)的接種量接入種子培養(yǎng)基，28 ℃、160 r/min搖床振蕩培養(yǎng)13～16 h，然后將活化后的菌株種子液，按4%的體積分?jǐn)?shù)接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在28 ℃、160 r/min的條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)48 h。

1.2.1.2酵母胞外多糖的提取

實(shí)驗(yàn)采用醇沉提取法，具體流程如下：發(fā)酵液離心收集上清液，加3倍體積95%乙醇(4 ℃，沉降處理12 h)離心收集沉淀。依次使用95%乙醇、無水乙醇、丙酮洗滌得粗多糖樣品，用ddH2O溶解，并用Sevage法去除蛋白5次[8]。上清液加3倍體積95%乙醇(4 ℃，沉降處理12 h)，離心后收集沉淀，利用ddH2O溶解沉淀樣品后，透析(截留分子質(zhì)量為3.5 ku)，冷凍干燥得酵母胞外粗多糖EPS6，EPS8和EPS9。

1.2.2多糖純度測定

采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[9]。將冷凍干燥后的多糖干粉用蒸餾水制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的多糖溶液，用時取0.5 mL多糖液補(bǔ)水至2 mL，按葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法進(jìn)行操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算樣品中多糖的含量，確定胞外粗多糖的純度。

利用紫外(UV)光譜法檢測蛋白雜質(zhì)。將胞外多糖以蒸餾水配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的溶液，在190～600 nm利用紫外分光光度計進(jìn)行紫外全波長掃描，以確定胞外多糖粗品中是否含有蛋白質(zhì)綴合物[10]。

1.2.3多糖還原力測定

取2 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液(0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL)，加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH 6.6)和1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，得混合物于50 ℃水浴保溫20 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液。吸取混合溶液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，搖勻，室溫下反應(yīng)10 min，以蒸餾水為空白，在700 nm處測吸光度，吸光度代表多糖的還原能力。不同濃度的樣品分別作3次獨(dú)立平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。

1.2.4多糖對 O2-·自由基的清除作用

取25 ℃預(yù)熱20 min的Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 8.2)2.5 mL，加入25 ℃預(yù)熱20 min 的45 mmol/L鄰苯三酚10 μL，并加入不同質(zhì)量濃度(0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL)的樣品溶液，反應(yīng)體系總體積為2.51 mL，搖勻，體系在25 ℃恒溫水浴中精確反應(yīng)4 min，每隔30 s 在325 nm處測定溶液的吸光度，并計算其吸光度變化率(ΔAs)。對照組：以Tris-HCl緩沖液替代樣品溶液，計算吸光度變化率(ΔAc)[11]。

1.2.5多糖對·OH 自由基的清除作用

取磷酸鹽緩沖液(150 mmol/L，pH 7.4)2.85 mL，0.26 mg/mL番紅花紅T 0.15 mL，1% H2O20.6 mL，0.56 mmol/L EDTA-Fe2+溶液0.525 mL，加入不同質(zhì)量濃度 (0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL)的樣品溶液，反應(yīng)體系總體積為3 mL，搖勻，37 ℃恒溫水浴反應(yīng)30 min，520 nm處測定吸光度即樣品組(As)?？瞻捉M(A0)：以等體積磷酸鹽緩沖液代替H2O2、EDTA-Fe2+和樣品溶液。對照組(Ac)：以等體積的磷酸鹽緩沖液代替多糖溶液[12]。

·OH 清除率=[(As-Ac)/(A0-Ac)]×100%。

2結(jié)果與分析

2.1多糖的純度測定

苯酚-硫酸法得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=12.253 33x+0.005 7(R2=0.995 68)。

根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出1.0 mg/mL樣品溶液中多糖的質(zhì)量濃度分別為：EPS6，0.676 mg/mL；EPS8，0.628 mg/mL；EPS9，0.712 mg/mL。因此，粗多糖的純度分別為：EPS6，67.6%；EPS8，62.8%；EPS9，71.2%。

對3株酵母菌胞外多糖粗品進(jìn)行紫外全波長掃描(190～600 nm)，檢測生物大分子雜質(zhì)(蛋白)紫外吸收情況，結(jié)果如圖1所示。從圖1(a)中可以看出，3株酵母胞外多糖在280 nm處均有吸收，說明粗多糖樣品中含有一定的蛋白雜質(zhì)。圖1(b)顯示A280小于0.1，這表明多糖樣品中的蛋白含量很低。

圖13種胞外多糖的紫外全波長(a)和240～300 nm波段的掃描圖(b)

Fig.1Ultravioletfullwavelengthscans(a)and240-300nmscans(b)ofthreeextracellularpolysaccharides

采用苯酚-硫酸法檢測多糖的純度。濃硫酸先將多糖水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物。該化合物在490nm處，糖濃度和光吸收呈線性關(guān)系。因此，苯酚/濃硫酸不能與蛋白出現(xiàn)類似的衍生物，故實(shí)驗(yàn)排除了樣品中雜質(zhì)蛋白的干擾。

從胞外粗多糖的純度結(jié)果分析，樣品中除了少量蛋白之外，一定含有其他其雜質(zhì)分子。但是，本實(shí)驗(yàn)獲得的粗多糖樣品的純度基本可以滿足后續(xù)抗氧化結(jié)果的要求[13-14]。

2.2多糖還原力測定

還原力是抗氧化活力的重要指標(biāo)，一般情況下，還原力與抗氧化活性之間有顯著的相關(guān)性[15]，因此實(shí)驗(yàn)首先測了3種多糖的還原力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3株酵母菌的胞外多糖均表現(xiàn)出了一定的還原能力。樣品的還原能力和多糖的質(zhì)量濃度在一定的范圍內(nèi)具有較明顯的線性關(guān)系，如圖2所示，其還原能力隨著濃度的升高而增強(qiáng)。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度不高于1.0mg/mL時，EPS6和EPS8的還原力相近，明顯高于EPS9；當(dāng)多糖質(zhì)量濃度大于1.0mg/mL時，EPS8的還原力略高于EPS6，明顯高于EPS9。

圖2　3種多糖的還原能力

圖3　3種多糖對自由基的清除作用

3 O-2·

Fig.radicalscavengingactivityofthree

polysaccharide

2.4多糖對·OH自由基的清除作用

檢測了3種胞外多糖EPS6，EPS8和EPS9對·OH自由基的清除能力，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，3株酵母菌胞外多糖對·OH自由基都具有較強(qiáng)的清除能力，并隨著濃度的增加其清除率逐漸上升。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度不高于0.5mg/mL時，EPS6和EPS8對·OH自由基的清除能力相近，都略高于EPS9；至穩(wěn)定時，其對·OH自由基的清除率均大于60%；其中，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度升高至2.0mg/mL時，EPS6對·OH具有明顯的清除作用，清除率高達(dá)91.5%。

圖4　3種多糖對·OH 自由基的清除作用

3結(jié)論

3株篩自海參腸道的酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖具有一定的抗氧化活性，同時又具有生產(chǎn)周期短、成本低廉且無原料來源問題等優(yōu)點(diǎn)。綜上所述，海參腸道酵母菌發(fā)酵得到的胞外多糖作為天然抗氧化劑具有廣闊的應(yīng)用和開發(fā)前景。

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The antioxidant effects of extracellular polysaccharide of yeasts from sea cucumber intestine

CUIJing,LICheng,SUNXiaomeng,LIUJiaxin,ZHANGHan,CONGLina

( School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

Abstract:Three yeast strains of exopolysaccharide-producing named HS-J6, HS-J8 and HS-J9 were isolated from sea cucumber intestine. Three water-soluble polysaccharides named EPS6, EPS8 and EPS9, were extracted by 95% ethanol precipitation, deproteinization via Sevage, dialysis and lyophilization. The antioxidation of extracellular polysaccharide was test, and the results showed that the reduction capacity of EPS6 and EPS8 were significant higher than that of EPS9. But EPS9 exhibited high scavenging effects on radicals, with the maximum scavenging rate about 35.3%. The ·OH radical scavenging activity of EPS6 was the highest, with the scavenging rate about 91.5%.

Key words:yeast; extracellular polysaccharide; antioxidant effects

中圖分類號:TS201.3；Q539

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

作者簡介:崔 靜(1989-)，女，碩士研究生；通信作者：叢麗娜(1962-)，女，教授，E-mail:congln@dlpu.edu.cn.

基金項(xiàng)目:海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目(201405003-3)；遼寧省高等學(xué)校重大科技平臺專項(xiàng)項(xiàng)目(LT2011008);遼寧省教育廳一般項(xiàng)目(L2014217).

收稿日期:2015-03-05.

文章編號:1674-1404(2016)02-0084-04