趙　娟　崔　龍

441021 湖北省襄陽市中心醫(yī)院

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Nedd4L對前列腺癌患者TrkA抑癌性泛素化的影響研究

趙娟崔龍

441021 湖北省襄陽市中心醫(yī)院

【摘要】目的探討Nedd4L對前列腺癌患者TrkA抑癌性泛素化的影響。方法采用熒光定量PCR法,檢測60例前列腺癌組織(PC組)及24例前列腺良性增生組織(BPH組)中Nedd4L及TrkA的水平，分析Nedd4L和TrkA的相關性，同時分析NEDD4L和TrkA的水平分別與前列腺癌臨床特征(年齡、Gleason評分、TNM分期)的關系。采用免疫印跡法進一步檢測TrkA蛋白水平和TrkAde泛素化水平。結(jié)果①PC組Nedd4L的mRNA水平顯著低于BPH組Nedd4L的mRNA水平(t=13.01,P<0.0001)；PC組TrkA mRNA水平明顯高于BPH組TrkA mRNA水平(t=8.097,P<0.0001)，且Nedd4L mRNA水平與TrkA mRNA水平呈顯著負相關(γ=-0.8029,P=0.0156)。② Nedd4L水平與患者年齡、Gleason評分、TNM分期呈明顯負相關(P<0.05),TrkA mRNA水平與患者年齡、Gleason評分、TNM分期呈顯著正相關(P<0.05)。③PC組TrkA蛋白水平顯著高于BPH組TrkA蛋白水平(t=11.06,P<0.0001),而PC組TrkA泛素化水平顯著低于BPH組TrkA泛素化水平，差異具有統(tǒng)計學意義(t=5.538,P<0.0001)。結(jié)論前列腺癌患者中Nedd4L表達水平下調(diào)，TrkA表達水平上調(diào)，TrkA泛素化水平的降低與前列腺癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關。

【關鍵詞】Nedd4L；前列腺癌；TrkA；泛素化

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:366～368)

前列腺癌(prostate cancer,PC)是1種惡性腫瘤，主要發(fā)生在老年男性，近幾年的發(fā)病率日趨上升，由于其高度的轉(zhuǎn)移性及惡性程度較高，前列腺癌患者預后往往較差，早期的診斷及治療對于前列腺癌患者的生存質(zhì)量具有重要的意義。目前關于前列腺癌的分子遺傳學發(fā)病機制尚未完全清楚。有研究指出，前列腺癌的發(fā)生及發(fā)展與Mel-18、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、FoxM1、神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體有密切的關系[1-4],特別是神經(jīng)營養(yǎng)因子受體TrkA近年來引起廣泛的關注，TrkA的負性調(diào)控被認為是前列腺癌細胞凋亡和抑制細胞增殖及腫瘤細胞侵襲性降低標志[5]。NEDD4L是一類具有E3泛素連接酶的蛋白質(zhì)，新近的研究顯示NEDD4L通過泛素化能下調(diào)腫瘤抑制基因PTEN的水平[6]。關于Nedd4L對前列腺癌中TrkA泛素化水平的影響未見報道。本研究通過熒光定量PCR法及免疫印跡法檢測Nedd4L及TrkA的水平，探討Nedd4L對前列腺癌患者TrkA泛素化的影響。

1材料與方法

1.1一般資料

選擇2010年3月至2014年6月本院行根治性前列腺癌切除術(shù)60例前列腺組織標本，經(jīng)病理學檢查證實為前列腺癌。患者平均年齡為(58.7±12.4)歲，根據(jù)Gleason評分，其中1～5分23例，6分14例。7分13例，8～10分10例。按照TNM分期，其中T1～T2期13例，T3～T4期10例，N0期11例，N1期15例，M0期6例，M1期5例。以24例前列腺良性增生組織為對照(BPH)。

1.2方法

1.2.1實時熒光定量PCR檢測組織Nedd4L和TrkA的表達水平采用實時熒光定量PCR檢測Nedd4L基因和TrkA的mRNA的表達。具體過程如下：采用QIAquickRNA Extraction Kit(購自QIAGEN公司,德國)抽提前列腺癌組織及前列腺良性增生組織的總RNA。濃度及純度符合要求的RNA進行合成cDNA第一鏈，cDNA第一鏈的合成按照First Strand cDNAsynthesis Kit操作說明(Takara公司，日本)，反應條件為：42 ℃孵育30 min。合成的cDNA第一鏈放于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)Nedd4L和TrkA基因序列，在Oligo 7.5軟件上設計Nedd4L和TrkA基因熒光定量(qPCR)引物,引物序列為：Nedd4L-F:5’-GGCGACCGGGCTCGGGGAG-3’,Nedd4LR:5’-GCTCTAGAATCCACCCCTTC-3’,擴增片段長度為105 bp；TrkAF:5’-CCTGCTCAGTAAGCTGAT-3’，TrkAR:5’-CCCGAAACTGAGCCGACTAGA’,擴增片段長度為127 bp； 以GAPDH作為參考基因，引物序列為：5’-CGACGTAGTCTCATCTGACTT-3’,5’-GTTGCAGTCGACATAATCGTTGA-3’，片段長度為112 bp，引物均由上海生工有限公司合成。實時熒光定量PCR 20 μl反應體系為：cDNA第一鏈1 μl,2xTrans Start Top Green qPCRSuperMix 10 μl,引物1(10 μM)0.6 μl,引物2(10 μM)0.6 μl,Passive Reference Dye 0.4 μl, ddH2O 7.4 μl(試劑購于北京全式金有限公司)，反應在ABI7500熒光定量PCR儀中進行，擴增程序為：95 ℃預變性3 min,95 ℃10 s；58 ℃20 s；72 ℃30 s，40個循環(huán)，同時進行溶解曲線的分析，程序為：60 ℃1 min;95 ℃30 s。在ABI7500分析軟件上分析Nedd4L和TrkA基因的Ct值，采用2-Ct法計算前列腺良性增生組織及前列腺癌細胞組織Nedd4L和TrkA的相對表達量，采用公式Ct= Ct(Nedd4L 或TrkA基因)- Ct(GAPDH基因)。

1.2.2TrkA抑癌性泛素化水平的檢測采用免疫印跡法檢測TrkA泛素化水平，將前列腺癌組織及前列腺良性增生組織加入100 μl蛋白裂解液后冰上勻漿30 min,4 ℃離心20 min，取上清液，從中取2 μl采用Braford試劑盒在酶標儀上檢測總蛋白含量。按蛋白質(zhì)的含量取相應的上樣量，進行SDS-PAGE及轉(zhuǎn)膜。采用ECL試劑盒(購于碧云天生物技術(shù)有限公司)對膜進行封閉，一抗雜交，洗膜，二抗雜交，洗膜，曝光。膠片上的免疫反應帶在凝膠成像系統(tǒng)成像，并應用圖像分析軟件(Bio- rad Quantity One)進行定量分析(以平均光密度Density表示)。完成TrkA的檢測后，再將已結(jié)合于膜上的TrkA一抗和相應的二抗用strip液洗去，從封閉開始重復免疫印跡的步驟，換用Nedd4L一抗(購于上海瑞齊生物技術(shù)有限公司)和相應的二抗檢測TrkA的泛素化水平。

1.3統(tǒng)計學處理

應用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理分析，計量資料進行t檢驗，計數(shù)資料進行t檢驗，計數(shù)資料進行χ2檢驗，以P<0.05為具有統(tǒng)計學差異。

2結(jié)果

2.1前列腺癌組織及前列腺良性增生組織中Nedd4L和TrkA的表達水平

前列腺癌組織中Nedd4LmRNA水平顯著低于前列腺良性增生組織中Nedd4L的mRNA水平(t=13.01,P<0.0001)；而前列腺癌組織TrkA mRNA水平明顯高于前列腺良性增生組織的TrkA mRNA水平，差異具有統(tǒng)計學意義(t=8.097,P<0.0001)，見表1。Nedd4L mRNA水平與TrkA mRNA水平呈顯著負相關(γ=-0.8029,P=0.0156)。

表1　前列腺癌組織及前列腺良性增生

2.2Nedd4L及TrkA與前列腺癌臨床特征的關系

Nedd4L和TrkA mRNA水平與患者年齡明顯相關，年齡<60歲患者Nedd4L mRNA水平顯著高于年齡>60歲的患者(t=2.745,P=0.0082)，而年齡<60歲患者TrkA mRNA水平顯著低于年齡>60歲患者(t=2.427,P=0.0187)。隨著Gleason評分的增高，Nedd4L mRNA水平明顯降低，且各評分之間差異顯著(F=52.80,P<0.0001)，而TrkA mRNA水平明顯升高，且各評分之間差異顯著(F=81.41,P<0.0001)。Nedd4L mRNA水平和TrkA mRNA水平與T分期、N分期、M分期顯著相關(P<0.05)，見表2。

表2　Nedd4L和TrkA mRNA水平與前列腺癌臨床

2.3前列腺癌患者TrkA泛素化水平的檢測結(jié)果

Nedd4L一抗的表達量與TrkA的表達量之比表示前列腺組織TrkA的表達量泛素化水平。PC組TrkA蛋白水平顯著高于BPH組TrkA蛋白水平(t=11.06,P<0.0001),而PC組TrkA泛素化水平顯著低于BPH組TrkA泛素化水平，差異具有統(tǒng)計學意義(t=5.538,P<0.0001)，見表3。

表3　前列腺癌患者TrkA泛素化水平的檢測±s)

3討論

隨著人口老齡化及飲食結(jié)構(gòu)的改變，前列腺癌發(fā)病率在我國呈上升趨勢，由于其高度的轉(zhuǎn)移性及惡性程度較高，嚴重影響患者的生化，但目前關于前列腺癌的分子遺傳學發(fā)病機制并不確切。近年來，從生物學的角度研究癌癥發(fā)病機制的探索引起廣泛的關注。有研究指出，前列腺癌的發(fā)生及發(fā)展與Mel-18、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、FoxM1、神經(jīng)營養(yǎng)因子及TrkA有密切的關系，其中TrkA作為參與多種癌癥大發(fā)生及發(fā)展的一個受體在前列腺癌中備受關注[7]。TrkA為酪氨酸激酶受體A,是神經(jīng)營養(yǎng)因子的高度特異性受體，目前的研究顯示TrkA的表達水平與癌癥的發(fā)生、發(fā)展、生物學行為及預后密切相關，TrkA信號通路的激活促進腫瘤細胞的增值[8]。TrkA的下調(diào)被認為是前列腺癌細胞凋亡和抑制細胞增殖及腫瘤細胞侵襲性降低標志。泛素化是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)修飾的一個過程，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的底物大多是癌基因和抑癌基因的表達產(chǎn)物[9]。Nedd4L是一類具有E3泛素連接酶的蛋白質(zhì)，據(jù)報道Nedd4L通過泛素化能促進腫瘤抑制基因PTEN的泛素化降解，而Nedd4L在前列腺癌的下調(diào)直接與前列腺癌Gleason評分相關[10]。鑒于此，本文從生物學的角度探討Nedd4L對前列腺癌中TrkA泛素化水平的影響。

本研究通過熒光定量PCR法檢測前列腺癌組織及正常前列腺良性增生組織Nedd4L和TrkA的mRNA水平，結(jié)果顯示前列腺癌組織Nedd4L的mRNA水平顯著低于前列腺良性增生組織(t=13.01,P<0.0001)，而前列腺癌組織TrkA mRNA水平明顯高于前列腺良性增生組織(t=8.097,P<0.0001)，提示前列腺癌的發(fā)病機制與Nedd4L的下調(diào)及TrkA的上調(diào)有關；相關性分析結(jié)果顯示Nedd4L mRNA水平與TrkA mRNA水平呈顯著負相關(γ=-0.8029,P=0.0156)，表明前列腺癌中Nedd4L水平直接影響TrkA的水平，兩者密切相關。進一步的分析表明前列腺癌Nedd4L水平與患者的年齡、Gleason評分、TNM分期呈明顯負相關(P<0.05),TrkA mRNA水平與患者的年齡、Gleason評分、TNM分期呈顯著正相關(P<0.05)，提示前列腺癌Nedd4L水平的降低促使TrkA水平升高，進一步導致前列腺癌病情的惡化及癌癥向淋巴結(jié)和骨組織等的遠處轉(zhuǎn)移，且隨著年齡的增長，前列腺癌病情的惡化程度加快。采用免疫印跡法檢測前列腺癌組織和正常前列腺良性增生組織TrkA的蛋白水平及其泛素化水平，結(jié)果顯示，前列腺癌組織的TrkA蛋白水平顯著高于BPH組(t=11.06,P<0.0001),而TrkA泛素化水平顯著低于BPH組，差異具有統(tǒng)計學意義(t=5.538,P<0.0001)，表明Nedd4L能促進TrkA泛素化，而Nedd4L的下調(diào)導致TrkA泛素化水平的降低，使得TrkA的水平上調(diào)，進一步引起前列腺癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。

綜上所述，前列腺癌患者中Nedd4L呈下調(diào)表達，而TrkA呈上調(diào)表達，TrkA的表達水平與Nedd4L的表達水平密切相關，且Nedd4L的高表達水平能促進TrkA的泛素化水平，降低TrkA的水平，進一步改善前列腺癌患者的病情。

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(編輯：吳小紅)

Effect of Nedd4L on TrkA Ubiquitination in Patients with Prostate Cancer

ZHAOJuan,CUILong.

CentralHospitalofXiangyang,Xiangyang,441021

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of Nedd4L on TrkA ubiquitination in patients with prostate cancer.MethodsThe levels of TrkA and Nedd4L in tissues of 60 patients with prostate cancer (PC group) and 24 patients with benign prostatic hyperplasia (BPH group) were detected by fluorescence quantitative PCR and their correlation were analyzed.Meanwhile the relationship between TrkA and Nedd4L levels and clinical characteristics of prostate cancer (age,Gleason score,TNM stage) were analyzed.TrkA protein level and TrkA ubiquitination level were tested by Western blot.Results① The mRNA level of Nedd4L in PC group was significantly lower than that of BPH group (t=13.01,P<0.0001);while TrkA mRNA level in PC group was significantly higher than that of BPH group (t=8.097,P<0.0001).The Nedd4L mRNA level showed a significant negative correlation with TrkA mRNA level (γ=-0.8029,P=0.0156).② The level of Nedd4L displayed negative correlation with patient's age,Gleason score,and TNM stage (P<0.05),while The level of TrkA showed a significant positive correlation with age,Gleason score and TNM stage (P<0.05).③The TrkA protein level in PC group was significantly higher than that of BPH group (t=11.06,P<0.0001),while the level of TrkA ubiquitination was markedly lower than that of BPH group,there had statistically significant difference (t=5.538,P<0.0001).ConclusionThe level of Nedd4L decreased in prostate cancer and TrkA increased.Decreased level of TrkA ubiquitination is closely related to the development and transfer of prostate cancer.

【Key words】Nedd4L;Prostate cancer;TrkA;Ubiquitination

(收稿日期2015-06-12修回日期 2015-01-05)

中圖分類號：R737.25

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5930(2016)03-0366-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.03.006

通訊作者：崔龍