權(quán)效珍　覃小敏　劉　韻

441021 湖北省襄陽市中心醫(yī)院

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重組蛋白P53聯(lián)合紫杉醇在宮頸癌中的抑制作用

權(quán)效珍覃小敏劉韻

441021 湖北省襄陽市中心醫(yī)院

【摘要】目的探討P53聯(lián)合紫杉醇在宮頸癌中的抑制作用。方法利用宮頸癌細胞系HeLa細胞進行實驗研究，利用MTT實驗對單獨加入P53重組蛋白、紫杉醇和P53聯(lián)合紫杉醇對細胞增殖進行檢測，兩者均不加為對照組，同樣的設(shè)計思路對細胞單克隆進行檢測，最后用western-blot進行4種細胞蛋白的檢測。結(jié)果重組蛋白聯(lián)合紫杉醇時抑制宮頸癌細胞的生長，且抑制作用具有統(tǒng)計學(xué)差異；細胞單克隆形成數(shù)目也是減少，在初步探討其作用機制時發(fā)現(xiàn)VEGF表達減少。結(jié)論P53重組蛋白聯(lián)合紫杉醇能有效抑制宮頸癌細胞生長，其潛在作用機制是抑制VEGF的表達。

【關(guān)鍵詞】VEGF；宮頸癌；P53；紫杉醇

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:359～361)

早期的宮頸癌通常通過手術(shù)切除或者放療等措施進行治療，但是晚期的惡性宮頸癌沒有手術(shù)切除機會，而放療效果低且復(fù)發(fā)率高，同時還會帶來身體上的損傷[1-2]。許多事實證明，合適的化療藥物能夠減小腫瘤體積和數(shù)量，為手術(shù)治療提供一個良好的環(huán)境，但是，眾所周知的藥物耐藥性是化療藥物的一個瓶頸，如何降低機體對藥物的耐藥性這是一個問題[3-4]。

有研究表明，野生型P53基因的突變在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中有著重要作用，而且腫瘤耐藥性也與野生型P53基因的突變有關(guān)系[5-6]。本文主要集中在研究人源性P53聯(lián)合紫杉醇在宮頸癌細胞株中的作用，而且我們探討P53聯(lián)合紫杉醇是否通過VEGF這一途徑對宮頸癌細胞產(chǎn)生作用。

1材料與方法

1.1細胞資料

宮頸癌細胞HeLa購買于ATCC，37 ℃，5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)，DMEM培養(yǎng)，在細胞處于對數(shù)期時用于實驗。

1.2方法

1.2.1MTT檢測①接種細胞:用含10%胎小牛血清的培養(yǎng)液配成單細胞懸液，每孔1 000～10 000細胞，接種96孔板，每孔體積200 μl。重組蛋白P53用量為5×107vp/ml，紫杉醇用量為3 μg/ml。②待TEC貼壁后，每孔加MTT(噻唑藍)溶液(5 mg/ml用PBS配制pH=7.4)20 μl，繼續(xù)孵育4 h終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需要離心再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150 μl DMSO振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。③選擇490 nm波長酶標(biāo)儀上測定各孔光吸收值記錄結(jié)時間，橫坐標(biāo)吸光值，縱坐標(biāo)繪制細胞生長曲線。

1.2.2平板克隆實驗將細胞懸液計數(shù)后接種約100個細胞于細胞培養(yǎng)皿中，待細胞長成肉眼可見的克隆后開始實驗，棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定細胞5 mL固定15 min。然后去固定液，加適量結(jié)晶紫染色液染色，10～30 min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。克隆形成反映細胞群體依賴性和增殖能力2個重要性狀。

1.2.3SDS-PAGE電泳:①上樣前將膠板下的氣泡趕走。②蛋白樣品調(diào)至等濃度后上樣，蛋白上樣量保證在一定濃度上進行，同時加入6 μl蛋白marker。③以初始電壓為80 V時跑濃縮膠，然后升至120 V跑分離膠。④在目的蛋白泳動至距膠下緣1 cm以上結(jié)束。浸泡PVDF膜：將PVDF膜泡在甲醇中5 min。

轉(zhuǎn)膜:恒流250 mA，90 min，然后將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，TBST稍加漂洗，5%脫脂牛奶封閉液中緩慢搖蕩1 h。TBST稍加漂洗，一抗孵育過夜，第2天將其放在常溫復(fù)溫40 min，然后TBST漂洗膜3次，每次5 min。根據(jù)一抗來源選擇二抗，室溫輕搖1 h。二抗孵育結(jié)束后，用TBST漂洗膜3次，每次5 min。對洗后的PVDF膜發(fā)光顯影，用ECL發(fā)光液進行發(fā)光顯影，配置方法為A液與B液1∶1進行配置，進行發(fā)光顯影。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件包處理，采用t檢驗，Pearson相關(guān)分析，χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1重組蛋白聯(lián)合紫杉醇抑制宮頸癌細胞的生長

在人宮頸癌細胞株中單次加入紫杉醇和單次加入P53，作為實驗控制組，不加為對照組，聯(lián)合P53和紫杉醇加入宮頸癌細胞株中，單獨加入P53或紫杉醇時抑制作用不明顯，當(dāng)兩者聯(lián)合作用時，其抑制作用明顯，且與對照組相比差異明顯(P<0.001)，見圖1。

圖1　重組蛋白P53和紫杉醇對宮頸癌細胞生長的抑制作用

2.2重組蛋白聯(lián)合紫杉醇抑制宮頸癌細胞的克隆形成

上述我們已經(jīng)證實在聯(lián)合加入P53重組蛋白和紫杉醇后期細胞生長明顯受到抑制，但是MTT實驗室檢驗的是一群細胞的增殖能力，所以接下來我們對單個細胞的增殖能力進行檢測。在平板克隆中我們發(fā)現(xiàn)在加入單個或不加P53、紫杉醇時其克隆形成較加入P53重組蛋白和紫杉醇時明顯，在加入P53重組蛋白和紫杉醇后其克隆形成明顯減少，見圖2。

圖2　重組蛋白P53和紫杉醇對宮頸癌細胞的克隆

2.3在同時加入P53重組蛋白和紫杉醇時細胞VEGF表達量減少

在我們研究中我們已經(jīng)證實P53和紫杉醇的聯(lián)合作用能有效降低宮頸癌細胞的增殖能力，但是如何引起這一現(xiàn)象的發(fā)生呢？據(jù)我們所知，在腫瘤治療中有一種治療策略為腫瘤饑餓療法，而在臨床研究中VEGF是靶向血管的影響因子，其作用方式就是通過減少血管的生成進而達到饑餓腫瘤的方法。所以在以上猜想后我們進行了VEGF的檢測，在單獨加入P53重組蛋白或者紫杉醇時VEGF表達量相比于對照組有所降低，但是降低效果不是很明顯，當(dāng)P53重組蛋白和紫杉醇聯(lián)合用藥后VEGF的表達量相比于其他3組明顯降低，見圖3。

圖3　VEGF-C在宮頸癌細胞中的表達

3討論

宮頸癌是人類疾病中惡性程度較高的一類疾病，其主要是易發(fā)生轉(zhuǎn)移，特別是淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，其是導(dǎo)致其難治愈的一個主要原因[7]。轉(zhuǎn)移的腫瘤通過血液、淋巴管，進而形成多種其他腫瘤，淋巴管的轉(zhuǎn)移包括一系列的復(fù)雜過程，包括，①原位癌惡性腫瘤細胞擴散至旁邊淋巴管；②腫瘤細胞通過淋巴管轉(zhuǎn)運至鄰近的淋巴結(jié)；③腫瘤細胞在淋巴結(jié)中的著落；④轉(zhuǎn)移性的腫瘤在淋巴結(jié)中的擴散[8-10]。P53基因作為腫瘤相關(guān)原因已經(jīng)被廣大科研工作者所研究[11]。有研究表明P53基因不僅僅和宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)系，還和其藥物作用有關(guān)系。紫杉醇是臨床上較為常見的腫瘤藥物，其產(chǎn)于太平洋紫杉山桃花心木，聚合作用和解聚作用是微管形成的重要因素，而微管形成是染色質(zhì)形成的重要原因，紫杉醇與微管β部位鏈接后阻止細胞進行擴增，導(dǎo)致細胞走向凋亡[12-14]。紫杉醇在治療卵巢癌、宮頸癌等其他惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用[15]。但是P53聯(lián)合紫杉醇的作用還未見詳細報道。

我們的實驗證實，單獨使用P53重組蛋白或者紫杉醇時宮頸癌細胞HeLa細胞在細胞生長方面有所下降，但是其抑制作用不是很明顯，當(dāng)P53重組蛋白聯(lián)合紫杉醇時其抑制細胞生長作用明顯。我們也對腫瘤生長必須的表皮生長因子進行了檢測，發(fā)現(xiàn)在聯(lián)合給藥時細胞中VEGF表達量明顯減少。本研究創(chuàng)新點在于首次揭示了P53和紫杉醇可以聯(lián)合用來抑制宮頸癌細胞進行生長，也初步解釋了其抑制機制，但美中不足之處在于，我們沒有詳細的解釋為什么是VEGF影響腫瘤細胞，這一點還需我們更多的實驗數(shù)據(jù)來驗證。

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(編輯：甘艷)

The Inhibitory Effect of Recombinant Human P53 Combined with Paclitaxel on Human Cervical Cancer Cell

QUANXiaozhen,QINXiaomin,LIUYun.

HubeiUniversityofArtsandScienceAffiliatedXiangyangCentralHospital,Xiangyang,441021

【Abstract】ObjectiveTo detect the inhibitory effect of recombinant human P53 combined with paclitaxel on human cervical cancer cell and its mechanism.MethodsHuman HeLa cell was used to detect the cell proliferation,and add P53 or paclitaxel alone,and both of them as experiment,blank as a control,the congenic assay was detected,and the protein was detected by western-blot.ResultsThe growth of HeLa cells decreased after add P53 and paclitaxel,the P53 and paclitaxel alone also decreased，P53 and paclitaxel had statistical difference,P<0.001,and the ability of congenic decreased after add P53 and paclitaxel,and the expression of VEGF decreased.ConclusionThe inhibitory ability of recombinant human P53 combined with paclitaxel on human cervical are efficient,its potential mechanism of action is inhibition of the expression of VEGF.

【Key words】VEGF-C;Cervical cancer;P53;Paclitaxel

(收稿日期2015-06-09修回日期 2015-09-28)

中圖分類號：R737.33

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-5930(2016)03-0359-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.03.004

通訊作者：劉韻