張召興，李蘊(yùn)玉，賈青輝，張香齋，張艷英，耿田田，李佩國

(河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北秦皇島，066600)

秦皇島地區(qū)狐源致病性E.coli對(duì)四環(huán)素類藥物耐藥性和耐藥基因的檢測(cè)

張召興，李蘊(yùn)玉，賈青輝，張香齋，張艷英，耿田田，李佩國*

(河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北秦皇島，066600)

為了確定秦皇島地區(qū)狐源大腸桿菌(E.coli)對(duì)四環(huán)素類藥物的耐藥性和耐藥基因分布，采用常規(guī)的鑒定方法，從不同養(yǎng)狐場(chǎng)送檢的腹瀉的狐貍體內(nèi)分離鑒定出20株E.coli。致病性試驗(yàn)表明，該菌為致病性E.coli。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明：分離菌株對(duì)四環(huán)素和強(qiáng)力霉素藥率分別達(dá)到95%和90%。通過PCR方法檢測(cè)分離菌株四環(huán)素類藥物的耐藥基因，結(jié)果顯示，tetA和tetB基因的檢出率分別為100%和95%。本研究為秦皇島地區(qū)防治狐源致病性大腸桿菌病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

狐貍；E.coli；四環(huán)素；PCR；耐藥基因；秦皇島地區(qū)

大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)引起的一類疾病的總稱[1]。E.coli是一種人畜共患細(xì)菌，可以引起人及不同動(dòng)物發(fā)病[2]。該菌可以引起不同動(dòng)物腹瀉、腸炎、甚至脫水而死，也可以引起其他的器官感染[3]。相關(guān)的報(bào)道E.coli攜帶致病性毒力島，能引起水貂腹瀉，且呈急性死亡[4]。E.coli對(duì)四環(huán)素類藥物有強(qiáng)的耐藥性，主動(dòng)外排和核糖體保護(hù)作用是四環(huán)素產(chǎn)生耐藥的機(jī)制[5]。

筆者通過對(duì)秦皇島地區(qū)狐源E.coli分離鑒定，探索該菌對(duì)四環(huán)素類藥物的耐藥性和耐藥基因機(jī)制的攜帶情況。從分子生物學(xué)角度分析秦皇島地區(qū)狐源E.coli對(duì)四環(huán)素類藥物產(chǎn)生耐藥的原因，為秦皇島地區(qū)狐源E.coli防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

秦皇島地區(qū)不同養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的腹瀉的狐貍，采集肝、心等組織分離培養(yǎng)。

1.2 試劑及儀器

ID32E腸道菌鑒定試劑條由法國梅里埃(bioMerieuxsa)公司生產(chǎn)；DL2000 Marker，2×Taq Marker Mix，Gold View核酸染液和樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；常規(guī)試劑由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

約20 g健康BALB/c小白鼠84只，引自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.4 細(xì)菌分離純化

無菌采集肝臟劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)12～24 h。在普通瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.5 細(xì)菌形態(tài)特征

無菌挑取上述純化培養(yǎng)菌，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢。

1.6 細(xì)菌生化特性鑒定

用ID32E腸道菌鑒定試劑條和自動(dòng)ATB生化儀進(jìn)行生化試驗(yàn)。

1.7 致病性試驗(yàn)

將實(shí)驗(yàn)小鼠分為試驗(yàn)組與空白對(duì)照組，每組4只。試驗(yàn)組每只小鼠0.2 mL(109CFU/mL)腹腔注射；空白對(duì)照組每只小鼠注射等量生理鹽水。觀察發(fā)病及死亡情況，分離細(xì)菌并鑒定。

1.8 藥敏試驗(yàn)

按照美國臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行試驗(yàn)和結(jié)果判斷[6]。

1.9 引物設(shè)計(jì)

參考相關(guān)文獻(xiàn)[7]，并設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

1.10 細(xì)菌DNA模板提取

按樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒說明書操作，存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.11 耐藥基因PCR檢測(cè)

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25μL)：模板DNA，2 μL；上下游引物，各0.5 μL；2×Taq Marker Mix，12.5 μL；ddH2O，9.5 μL。

反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性，5 min；94 ℃變性，50 s；退火(見表1)，50 s；72 ℃延伸，50 s；72 ℃終延伸，10 min。共30個(gè)循環(huán)。

擴(kuò)增產(chǎn)物取出5 μL電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離純化與形態(tài)觀察

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上長出具有粉紅色、邊緣光滑整齊、濕潤的扁圓的菌落；伊紅美蘭培養(yǎng)基上長出深紫黑色、帶金屬光澤的圓形菌落。在普通瓊脂平板上，形成白色、光滑濕潤的菌落。染色鏡檢，兩端鈍圓，呈桿狀的革蘭氏陰性桿菌(圖1)。

圖1 革蘭氏染色陰性(10×100)

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

20株分離菌株均能發(fā)酵甘露醇、葡萄糖、海藻糖、麥芽糖、阿拉伯糖、鼠李糖,產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解尿素。菌株不利用蔗糖，吲哚試驗(yàn)為陽性，用ATB全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)分析，鑒定結(jié)果為E.coli，評(píng)定結(jié)果合格率為99.9%。

2.3 致病性試驗(yàn)

試驗(yàn)組小鼠大約24 h全部發(fā)病死亡，分離培養(yǎng)鑒定。結(jié)果顯示所分離菌與該病原菌一致。對(duì)照組4只小白鼠健康存活，表明該菌有一定致病性。

2.4 藥敏試驗(yàn)

20株狐源E.coli對(duì)四環(huán)素類藥物中的四環(huán)素、強(qiáng)力霉素兩種藥物均耐藥，對(duì)四環(huán)素的耐藥率為95%，對(duì)強(qiáng)力霉素耐藥性為90%(表2)。

2.5 耐藥基因PCR檢測(cè)結(jié)果

該菌對(duì)tetA基因檢出率100%(圖1)；tetB基因檢出率95%(圖2)；該菌對(duì)株tetA和tetB同時(shí)檢出率為95%。

表2 20株狐源E.coli對(duì)四環(huán)素類的藥物的耐藥結(jié)果(n=20)

注：S，高度敏感；I，中度敏感；R，耐藥。

圖1 PCR結(jié)果(tetA基因)

圖2 PCR結(jié)果(tetB基因)

3 結(jié)論與討論

在秦皇島地區(qū)不同的養(yǎng)狐場(chǎng)分離的20株病原菌，對(duì)其分離菌從形態(tài)特征觀察、培養(yǎng)特性分析、生化鑒定等多方面鑒定，確定為E.coli，與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中報(bào)道的E.coli的特性一致[8]。通過致病性試驗(yàn)，該菌有一定致病性。證實(shí)該地區(qū)分離的20株狐源E.coli均為致病性E.coli，該菌是引起不同日齡狐貍腹瀉的主要病原菌。

本次試驗(yàn)對(duì)從腹瀉狐貍體內(nèi)分離的20株致病性大腸桿菌，對(duì)四環(huán)素類藥物中常用的四環(huán)素、強(qiáng)力霉素進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明：20株致病性大腸桿菌對(duì)兩種藥有很強(qiáng)的耐藥性。四環(huán)素類的藥物是常用的廣譜抗生素，被廣泛用于動(dòng)物的治療及細(xì)菌性疾病的預(yù)防。主要的抗菌機(jī)理為阻止氨酰tRNA與核糖體的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合來阻止細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成[5]。其主要的耐藥機(jī)制為：主動(dòng)外排作用、核糖體保護(hù)作用、產(chǎn)生滅活四環(huán)素的酶以及一種未名機(jī)制，通常認(rèn)為主動(dòng)外排和核糖體保護(hù)作用是四環(huán)素產(chǎn)生耐藥的機(jī)制，以大腸桿菌為代表的革蘭氏陰性菌就是以主動(dòng)外排為主[9]。對(duì)于狐源致病性大腸桿菌對(duì)四環(huán)素類的藥物耐藥的研究報(bào)道很少，對(duì)四環(huán)素產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性，可能與致病性大腸桿菌本身對(duì)該類藥物的耐藥機(jī)制有關(guān)。

tetA和tetB是四環(huán)素主要耐藥基因。該試驗(yàn)對(duì)秦皇島地區(qū)的狐源E.coli對(duì)四環(huán)素類藥物tetA和tetB基因進(jìn)行了檢測(cè)，試驗(yàn)表明了該菌攜帶tetA和tetB基因100%和95%。多重耐藥性達(dá)95%。Bryan等對(duì)人及動(dòng)物體內(nèi)分離的E.coli通過對(duì)四環(huán)素類藥物的tetA和tetB耐藥基因分析具有很高的檢出率[9]。相關(guān)報(bào)道四環(huán)素耐藥基因tetA和tetB對(duì)豬源E.coli攜帶率為27%和59%[10]。該試驗(yàn)結(jié)果與報(bào)道的四環(huán)素類藥物的耐藥基因的檢測(cè)分析基本一致。秦皇島地區(qū)狐源E.coli對(duì)四環(huán)素類藥物產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性，除了對(duì)四環(huán)素類藥物的不合理或高劑量的使用之外，也可能是接合質(zhì)粒上耐藥基因發(fā)生轉(zhuǎn)移導(dǎo)致該菌產(chǎn)生耐藥性[5]。對(duì)四環(huán)素類藥物的耐藥機(jī)制再做進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：朱寶昌，陳于和)

Resistance of PathogenicE.coliIsolated from Qinhuangdao Foxes to Tetracycline Antibiotics and Detection of Resistance Genes

ZHANG Zhaoxing, LI Yunyu, JIA Qinghui, ZHANG Xiangzhai, ZHANG Yanying,GENG Tiantian, LI Peiguo

(Hebei Normal University of Science & Technology, Hebei Province Key Laboratory of Veterinary Preventive Medicine, Qinhuangdao Hebei, 066600, China)

In order to understand the resistance of pathogenicE.colioriginated from the foxes in Qinhuangdao area to tetracycline antibiotics and distribution of resistance genes, twentyE.colistrains were isolated and identified from inspection diarrhea fox body in different fox farms. The results showed that all the isolated strains expressed pathogenically. The drug sensitivity test indicated that the isolated strains were highly resistant to tetracycline and doxycycline. The detection rate of drug resistance to tetracycline and doxycycline might reach 95% and 90%, respectively. PCR detection implied the detection rates of tetracycline resistance genestetA andtetB were as high as 100% and 95%, respectively. The research would provide an experimental basis for the prevention and treatment of the fox-derived pathogenicE.coliin Qinhuangdao area.

fox;E.Coli;tetracycline;PCR;resistance gene;Qinhuangdao area

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2016.02.010

秦皇島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2014-04)。

2016-05-11; 修改稿收到日期: 2016-06-13

S852.61+2

A

1672-7983(2016)02-0055-04

張召興 (1988-)，男，在讀碩士研究生。主要研究方向：獸醫(yī)微生物學(xué)與免疫學(xué)。

*通訊作者，男，教授，博士。主要研究方向：動(dòng)物疫病防控技術(shù)。E-mail: lpeiguo@163.com。