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九香蟲對染錳雄性大鼠生殖損傷的保護(hù)

2016-04-08 08:36何志全孫志誠侯曉暉
中成藥 2016年2期

何志全, 張 莉, 凌 蕾, 孫志誠, 侯曉暉

(遵義醫(yī)學(xué)院,貴州遵義563003)

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九香蟲對染錳雄性大鼠生殖損傷的保護(hù)

何志全, 張 莉, 凌 蕾, 孫志誠, 侯曉暉*

(遵義醫(yī)學(xué)院,貴州遵義563003)

摘要:目的 探討九香蟲對生殖系統(tǒng)損傷的雄性大鼠生殖功能的保護(hù)作用。方法 將35只8周齡的雄性SD大鼠隨機(jī)均分為5組,即模型組、空白組和九香蟲高、中、低劑量干預(yù)組。除空白組外,其余大鼠給予腹腔注射15 mg/kg MnC12·4H2O建立生殖損傷模型,九香蟲組飼料含高、中、低劑量的九香蟲,連續(xù)8周。觀察和檢測SD大鼠的生殖能力指標(biāo)(性行為、大鼠精子數(shù)、睪丸和附睪的臟器系數(shù)、血清性激素水平)。結(jié)果 模型組的撲捉次數(shù),射精能力,和精子數(shù)量較空白組和九香蟲中、低劑量干預(yù)組明顯下降;模型組睪丸、附睪臟器系數(shù)均顯著低于空白組和九香蟲高劑量干預(yù)組;模型組血清中睪酮水平均低于空白組和九香蟲干預(yù)組,而黃體生成素水平則高于空白組和九香蟲中劑量干預(yù)組。結(jié)論 中劑量的九香蟲對生殖系統(tǒng)損傷的雄性大鼠生殖功能具有最佳保護(hù)功效果。

關(guān)鍵詞:九香蟲;錳染毒;生殖損傷;生殖保護(hù)

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.006

KEY W 0RDS: stik-bug(AsPongoPus chinensis);exPosure to manganese;reProductive damage;reProductive Protection

九香蟲為昆蟲綱半翅目蝽科九香蟲(AsPongo-Pus chinensis)的干燥全蟲,主產(chǎn)于貴州、四川、云南等地,俗稱“屁板蟲”、“打屁蟲”、“屁巴蟲”。在民間,可作為中藥昆蟲和保健食品而廣泛食用,具有很高的藥用和食用價值,素有“有錢吃鹿茸,無錢吃打屁蟲”和“吃了屁巴蟲,滋補(bǔ)賽參茸,嚴(yán)冬不怕冷,夜間不尿床”等俗諺。《本草綱目》記載,該藥“氣味咸溫、無毒,主治膈脘滯氣、脾腎虧損、壯元陽”?!吨袊幍洹芬灿涊d其“歸肝脾腎經(jīng),功能理氣止痛、溫中助陽,用于胃寒脹痛、脾胃氣痛、腎虛陽痿、腰膝酸痛”。研究證實(shí)[1-2]:九香蟲含有多種維持人體正常生理功能所必須的氨基酸、脂肪酸、維生素,微量元素(Fe、Zn)等營養(yǎng)物質(zhì),具有抗菌抑菌等藥理作用;其粗提物對于肝癌、胃癌細(xì)胞的體外生長亦有一定的抑制作用[3];對治療遺精、陽痿、腎炎、胃痛、痛經(jīng)等有很好功效[4-9]。如此國藥瑰寶,若能通過現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)和方法證實(shí)其“溫中助陽”的功能,必將為其進(jìn)一步開發(fā)為藥品或保健品提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。迄今為止,國內(nèi)外對九香蟲用于生殖系統(tǒng)損傷保護(hù)方面的研究尚未見報道,因此,本實(shí)驗(yàn)設(shè)計了九香蟲干預(yù)生殖損傷實(shí)驗(yàn),通過檢測大鼠精子數(shù)、睪丸和附睪的臟器系數(shù)、血清性激素水平等指標(biāo)反映九香蟲對生殖損傷的保護(hù)作用和功能水平改善,通過性行為觀察推斷九香蟲是否具有促進(jìn)“溫中助陽”功效。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 清潔級SD大鼠,8周齡,體質(zhì)量(200±10)g,雄性和雌性各35只,購于重慶第三軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)室,許可證號: SCXK(渝)2012-0005。適養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑 九香蟲若干(采自貴州省遵義市正安等縣),MnC12·4H2O(分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司),NaC1(分析純,上?;瘜W(xué)試劑總廠),總蛋白定量測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.1.3 飼料制備 九香蟲飼料的制備:將購于遵義醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心的普通飼料磨成粉后,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、10%、5%的九香蟲粉末,混勻,將其制成圓柱形,置于37℃烘箱中烘干,備用。

1.2 方法

1.2.1 染錳雄性大鼠生殖損傷模型建立 將35只雄性SD大鼠隨機(jī)分為模型組、空白組和九香蟲高、中、低劑量干預(yù)組,每組7只。通過腹腔注射15 mg/kg MnC12·4H2O,1次/d,每周5 d,連續(xù)8周,空白組同樣方式給予等量的生理鹽水,通過錳染毒制備生殖損傷模型[10]。

1.2.2 九香蟲干預(yù)實(shí)驗(yàn) 生殖損傷模型建立后第2周(即造模開始第9周)進(jìn)行了九香蟲干預(yù)實(shí)驗(yàn),為保證每只大鼠的攝食量一致,采取單籠飼養(yǎng),每日每只飼喂30 g飼料,九香蟲高、中、低劑量干預(yù)組分別給予含九香蟲20%、10%、5%的飼料喂養(yǎng),模型組、空白組給予不含九香蟲的飼料喂養(yǎng),1次/d,7 d/周,連續(xù)8周。

1.2.3 生殖能力指標(biāo)檢測

1.2.3.1 性行為觀察 發(fā)情雌鼠制備:通過手術(shù)方法,將35只雌性SD大鼠雙側(cè)卵巢切除,術(shù)后經(jīng)肌肉注射青霉素2 U/d,連續(xù)3 d。飼養(yǎng)2周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)前48 h肌注苯甲酸雌二醇200 μg/kg,合籠前4 h肌注2 mg/kg黃體酮,以獲得發(fā)情良好的雌鼠。

性行為觀察:晚上7點(diǎn)開始觀察,將雄性SD大鼠放入紅色燈光下的透明盒10 min后,再將發(fā)情的雌鼠放入,觀察到大鼠間互相接觸、嗅舔、外生殖器探測等,之后出現(xiàn)撲捉和射精行為,每只雄性SD大鼠觀察15 min。記錄撲捉次數(shù)、騎跨次數(shù)、插入次數(shù)以及射精次數(shù)。

1.2.3.2 睪丸和附睪臟器系數(shù) 處死大鼠,摘取睪丸,迅速剝?nèi)ブ車窘M織和結(jié)締組織后稱重,并按下列公式計算睪丸臟器系數(shù):睪丸臟器系數(shù)=(睪丸質(zhì)量/體質(zhì)量)×100%。附睪臟器系數(shù)計算方法同睪丸。

1.2.3.3 精子計數(shù)及每日精子生成量測定 精子計數(shù):取大鼠一側(cè)附睪,剪碎附睪尾,置于4 mL PBS緩沖液中,于37℃水浴箱中孵育15 min,制備精子混懸液,混勻,取出10 μL精子混懸液于另一盛有90 μL PBS的離心管中,混勻,取10 μL于血球細(xì)胞計數(shù)板上,在顯微鏡下數(shù)出5個中方格的總精子數(shù)n,則每mL精液中含有的精子數(shù)為n× 25/5×稀釋倍數(shù)(10)×104。

每日精子生成量(dai1y sPerm Production,DSP)測定:取睪丸組織精確稱重,移至加少量睪丸勻漿液(STM)勻漿管,在內(nèi)切式組織勻漿器中勻漿,定容至25 mL。取10 μL勻漿液于血球計數(shù)板,在顯微鏡下數(shù)出5個中方格的總精子數(shù)n。每克睪丸中精子頭數(shù)=n×25/5×STM稀釋系數(shù)(25)×104÷組織質(zhì)量;每日精子生成量=每克睪丸精子頭計數(shù)÷大鼠精子發(fā)生所需時間(6.1 d)。

1.2.3.4 血清中性激素測定 用ELISA法,按照試劑盒說明書的操作方法檢測各組雄性SD大鼠血清中的睪酮和黃體生成素。

2 結(jié)果

2.1 九香蟲對SD大鼠性行為的影響 表1顯示:空白組大鼠相對活躍,表現(xiàn)多動,興奮,而模型組則精神萎靡不振、少動,兩組之間的撲捉次數(shù)、騎跨次數(shù)、插入次數(shù)以及射精次數(shù)有顯著性差異(P<0.05),說明生殖系統(tǒng)損傷模型建立成功;九香蟲干預(yù)組與模型組比較,中、低劑量組大鼠撲捉次數(shù)、騎跨次數(shù)、插入次數(shù)和射精次數(shù)明顯增多,差異顯著(P<0.05),高劑量組的騎跨次數(shù)和插入次數(shù)明顯增多(P<0.05),而撲捉次數(shù)和射精次數(shù)沒有顯著差異。可推斷飼喂一定劑量九香蟲對大鼠有改善性行為的功效,但過量飼喂九香蟲后改善功效出現(xiàn)下降趨勢。

表1 各組間大鼠性行為的比較(±s,n=7)Tab.1 Comparlson of rats sexual behavlor lnd lces(±s,n=7)

表1 各組間大鼠性行為的比較(±s,n=7)Tab.1 Comparlson of rats sexual behavlor lnd lces(±s,n=7)

注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05

組 別  撲捉次數(shù)/次  騎跨次數(shù)/次  插入次數(shù)/次  射精次數(shù)/次空白組81.67±13.32 38.33±5.51 32.00±1.73 30.00±3.46模型組 57.00±15.89* 20.60±4.04* 12.66±8.50* 14.42±8.22*九香蟲高劑量干預(yù)組 70.63±9.32 32.67±7.23△ 28.00±7.00△ 18.00±8.83九香蟲中劑量干預(yù)組 82.00±16.87△ 33.80±8.58△ 31.20±7.19△ 28.00±9.31△九香蟲低劑量干預(yù)組 74.88±11.53△ 33.00±8.99△ 30.43±8.90△ 29.00±6.16△

2.2 各組大鼠睪丸臟器系數(shù)、附睪臟器系數(shù) 表2顯示:模型組與空白組相比,臟器系數(shù)明顯下降,有顯著差異(P<0.05),說明生殖系統(tǒng)損傷模型動物臟器發(fā)生了相應(yīng)的萎縮。但九香蟲干預(yù)后,與模型組比較,高劑量組大鼠體質(zhì)量及睪丸、附睪臟器系數(shù)顯著升高(P<0.05),中劑量組體質(zhì)量及睪丸臟器系數(shù)顯著升高(P<0.05),低劑量組睪丸臟器系數(shù)顯著升高(P<0.05)??赏茢嗑畔阆x對大鼠的臟器有一定的保護(hù)功能,且與九香蟲劑量有一定的正相關(guān)。

表2 各組大鼠睪丸臟器系數(shù)、附睪臟器系數(shù)的比較(x± s,n=7)Tab.2 Comparlson of rats testls organ coefflclent,epldldym ls(±s,n=7)

表2 各組大鼠睪丸臟器系數(shù)、附睪臟器系數(shù)的比較(x± s,n=7)Tab.2 Comparlson of rats testls organ coefflclent,epldldym ls(±s,n=7)

注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05

組別  體質(zhì)量/g 睪丸臟器系數(shù) 附睪臟器系數(shù)空白組431.60±32.31 0.95±0.05 0.39±0.11模型組 380.11±22.67*0.81±0.09*0.29±0.03*九香蟲高劑量干預(yù)組 423.10±52.08△0.96±0.04△ 0.38±0.06△九香蟲中劑量干預(yù)組 422.29±23.14△0.95±0.12△0.34±0.03九香蟲低劑量干預(yù)組 407.74±28.43  0.92±0.06△0.34±0.02

2.3 精子計數(shù)和每日精子生成量 表3顯示:模型組與空白組比較,精子數(shù)量和DSP都顯著下降(P<0.05),說明生殖系統(tǒng)損傷模型大鼠精子發(fā)生出現(xiàn)了一定的障礙。九香蟲干預(yù)后,與模型組比較,中、高劑量組大鼠精子數(shù)量和DSP明顯增加(P<0.05),低、中劑量組精子數(shù)顯著增加(P<0.05)??赏茢嗑畔阆x有助于精子發(fā)生,且與九香蟲劑量有一定的關(guān)聯(lián)。

表3 各組大鼠精子數(shù)量和每日精子生成量的比較(±s,n=7)Tab.3 Com parlson of rats sperm number and DSP(±s,n=7)

表3 各組大鼠精子數(shù)量和每日精子生成量的比較(±s,n=7)Tab.3 Com parlson of rats sperm number and DSP(±s,n=7)

注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05

組別  精子數(shù)/ (107·mL-1)精子頭計數(shù)/ (×106·g-1)每日精子生成量/ [×106·(g·d)-1]2.47±0.50  81.466±18.351  13.355±3.008模型組 1.38±0.49*54.500±6.065* 8.934±0.994*九香蟲高劑量干預(yù)組1.91±0.56  73.302±17.676△12.017±2.898△九香蟲中劑量干預(yù)組2.40±0.95△68.527±11.583△11.324±5.678△九香蟲低劑量干預(yù)組2.32±0.55△64.368±13.637  10.552±空白組2.236

2.4 血清性激素睪酮(T)和黃體生成素(LH)的含有量測定結(jié)果 表4顯示:模型組與空白組相比,血清中的睪酮含有量降低,黃體生成素含有量升高,差異極顯著(P<0.01),與已有報道一致。九香蟲干預(yù)組與模型組比較,血清中的睪酮水平升高,有顯著差異(P<0.05);中劑量組黃體生成素含有量下降,有顯著差異(P<0.05),高、低

表4 各組大鼠血清睪酮和黃體生成素含有量測定結(jié)果的比較(±s,n=7)Tab.4 Com parlson of serum testosterone and lutelnlzlng rats results to determ lne plgment content(±s,n=7)

表4 各組大鼠血清睪酮和黃體生成素含有量測定結(jié)果的比較(±s,n=7)Tab.4 Com parlson of serum testosterone and lutelnlzlng rats results to determ lne plgment content(±s,n=7)

注:與空白組比較,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05

組別  睪酮/(ng·L-1) 黃體生成素/(ng·L-1)空白組98.17±3.49 19.39±1.21模型組 90.43±2.69** 23.56±1.60**九香蟲高劑量干預(yù)組 97.36±4.14△ 20.82±2.43九香蟲中劑量干預(yù)組 97.27±3.31△ 20.01±2.48△九香蟲低劑量干預(yù)組 97.08±4.33△21.94±0.96

劑量組無顯著差異。說明一定劑量的九香蟲有助于改善雄性大鼠的生精功能。

3 討論

近年來,隨著社會科技的發(fā)展、人們健康意識的加強(qiáng)及生殖醫(yī)學(xué)的發(fā)展,錳與生殖健康的關(guān)系越來越受到關(guān)注。研究證實(shí)[10-11],錳暴露能引起包括生精細(xì)胞凋亡、睪丸生長發(fā)育與成熟延遲、精液濃度和精子活率降低、生精功能障礙等生殖系統(tǒng)損傷。而九香蟲在民間,可作為中藥昆蟲和保健食品而廣泛食用,具有很高的藥用和食用價值。研究也證實(shí)[1-2],九香蟲含有多種維持人體正常生理功能所必須的氨基酸、脂肪酸、維生素,微量元素(Fe、Zn)等營養(yǎng)物質(zhì),是人體所需的重要營養(yǎng)成分,具有抗菌抑菌等藥理作用;其粗提物對于肝癌、胃癌細(xì)胞的體外生長亦有一定的抑制作用[3],但對生殖系統(tǒng)損傷的生殖功能是否具有保護(hù)作用仍未得到證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)從動物的性行為、大鼠精子數(shù)、睪丸和附睪的臟器系數(shù)、血清性激素水平等生殖能力指標(biāo)來分析判斷九香蟲對生殖系統(tǒng)的保護(hù)功效。

本研究結(jié)果可知:九香蟲干預(yù)生殖系統(tǒng)損傷的動物模型后,其大鼠相對活躍,表現(xiàn)多動,興奮,與模型組相比,中、低劑量組的撲捉次數(shù)、騎跨次數(shù)、插入次數(shù)以及射精次數(shù)明顯增多(P<0.05),其表現(xiàn)接近于空白組??赏茢嗑畔阆x有改善大鼠性行為的功效。臟器系數(shù)是指實(shí)驗(yàn)動物某臟器的質(zhì)量與其體質(zhì)量之比值。正常時各臟器與體質(zhì)量的比值相對恒定,但動物染毒后隨受損臟器質(zhì)量改變臟器系數(shù)也發(fā)生改變。因此,臟器系數(shù)的變化可反映在環(huán)境因素影響下臟器的增生、充血、水腫或萎縮等變化,是毒理實(shí)驗(yàn)中常用的指標(biāo)。表2結(jié)果顯示:九香蟲干預(yù)后,高劑量組的體質(zhì)量及睪丸、附睪臟器系數(shù)均高于模型組(P<0.05)。可推斷九香蟲對大鼠的臟器有一定的保護(hù)功能,且與九香蟲劑量有一定的正相關(guān)。精子數(shù)量和DSP是研究環(huán)境因素對男(雄)性生殖健康影響的重要觀察點(diǎn)之一,可有效判斷生殖毒性。表3顯示:九香蟲干預(yù)后,與模型組比較,低、中劑量組的精子數(shù)明顯增加(P<0.05),中、高劑量組的精子頭數(shù)和DSP明顯增加(P<0.05)。可推斷九香蟲有利于改善生精環(huán)境,有助于精子發(fā)生,且與九香蟲劑量有一定的關(guān)聯(lián)。血清中性激素水平是評價精子發(fā)生,了解睪丸組織結(jié)構(gòu)特征的重要指標(biāo),可反映睪丸的生精功能。研究證實(shí)[12-13]:染錳可引起雄性動物血清中的睪酮含有量降低,黃體生成素含有量升高。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明:模型組與空白組相比,血清中的睪酮含有量降低,黃體生成素含有量升高,差異極顯著(P<0.01),與已有報道一致。九香蟲干預(yù)后,與模型組比較,血清中的睪酮含有量明顯升高(P<0.05);中劑量組的黃體生成素明顯下降(P<0.05)??赏茢嗑畔阆x有助于改善激素調(diào)控水平,增強(qiáng)雄性大鼠的生精功能。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時也顯示,部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)出現(xiàn)高劑量組的保護(hù)效果不如低、中劑量組明顯的現(xiàn)象,可能是高劑量并非最佳的給藥劑量,九香蟲劑量過多其保護(hù)作用可能下降。因此,善需進(jìn)一步摸索九香蟲的最佳保護(hù)劑量。

綜上所述,九香蟲干預(yù)生殖系統(tǒng)損傷的雄性大鼠后,其各項(xiàng)生殖能力指標(biāo)均有較明顯的改善,說明九香蟲對生殖系統(tǒng)損傷的雄性大鼠生殖功能具有保護(hù)功效,且保護(hù)效果多以九香蟲高、中劑量干預(yù)組效果最佳,但其保護(hù)的作用機(jī)制仍不清楚,還有待下一步繼續(xù)研究。

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[臨 床]

Protectlon of stlnk-bug on manganese-lnduced reproductlve damage to male rats

HE Zhi-quan, ZHANG Li, LIN Lei, SUN Zhi-cheng, HOU Xiao-hui*
(ZunyiMedical College,Zunyi563003,China)

ABSTRACT:AIM To investigate the Protective effect of stink-bug(AsPongoPus chinensis)on the manganeseinduced reProductive damages toma1e rats.METH0DS Thirty-fivema1e eightweeks o1d SD ratswere random1y divided into five grouPs(n =7): the mode1grouP,the b1ank grouP and stink-bug high-,medium-and 1ow-dose intervention grouPs.ExcePt the b1ank grouP,the rest of rats received intraPeritonea11y MnC12·4H2O(15 mg/kg)to create reProductive damaged mode1 rats.Stink-bug grouPswere fed on the fodderwith stink-bug for eightweeks. The rats' reProductive caPacity indices,inc1uding sexy activity,sPerm count,the organ coefficientof testis and eP-ididymis,and serum sex hormone 1eve1weremeasured.RESULTS ComPared with the b1ank grouP and stink-bug medium-and 1ow-dose grouPs,sexua1 behavior indexes inc1uding caPturing times,ejacu1ation abi1ity,and sPerm count in themode1grouP were 1ower;comPared with the b1ank grouP and stink-bug high dose grouP,the coefficient of testis and ePididymis viscera in themode1grouP was a1so 1ower.The serum testosterone 1eve1s in themode1grouP were 1ower than those of the b1ank grouP and stink-bug grouPs(P<0.05).But1uteinizing hormone 1eve1was higher than that of the b1ank grouP and stink-bugmedium grouP.C0NCLUSI0N Themedium-dose stink-bug is the best choice in terms of rePairing the reProductive damages ofma1e rats.

*通信作者:侯曉暉(1980—),女,博士,教授,主要從事生物學(xué)研究。E-mai1: 330539793@qq.com

作者簡介:何志全(1979—),男(瑤族),碩士,副教授,主要從事生殖發(fā)育研究。E-mai1: 17563239@qq.com

基金項(xiàng)目:貴州省“125計劃”重大科技專項(xiàng)(黔教合重大專項(xiàng)字[2014]031);貴州省中醫(yī)藥管理局基金(QZYY2011-65);貴州省級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項(xiàng)目(201413653018)

收稿日期:2015-3-03

中圖分類號:R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1001-1528(2016)02-0258-04