李曉鵬2，劉昕1 ，張忠明1，何守貴2，曹磊1，張衛(wèi)兵1

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州730000；2. 甘肅金亞科技發(fā)展有限公司，甘肅 蘭州730000）

乳酸菌的組合發(fā)酵條件優(yōu)化

李曉鵬2，劉昕1 ，張忠明1，何守貴2，曹磊1，張衛(wèi)兵1

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州730000；2. 甘肅金亞科技發(fā)展有限公司，甘肅 蘭州730000）

以甘南牧區(qū)家庭自制牦牛乳酸奶中分離篩選出的乳酸菌為試驗(yàn)菌株，將其進(jìn)行組合發(fā)酵試驗(yàn)，以期為工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。采用單因素試驗(yàn)考察了菌種組合比例、發(fā)酵溫度、加糖量等因素對酸奶品質(zhì)的影響，結(jié)果表明最佳菌株組合為Q2∶G4，該組合的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度43.0 ℃、接種量4.0 %、菌株Q2∶G4的比例為1∶3。

組合發(fā)酵; 乳酸菌；優(yōu)化

人類對乳酸菌發(fā)酵劑的研究始于19世紀(jì)末至20世紀(jì)初，Grigoroff在1905年首次對酸奶細(xì)菌學(xué)的研究，標(biāo)志著人們利用自然環(huán)境中“天然乳酸菌”時(shí)代的結(jié)束[1-3]。而Petter和Lolkema在1950年發(fā)現(xiàn)酸乳生產(chǎn)中共同使用S.t和L.b產(chǎn)酸速率明顯加快則是傳統(tǒng)液體發(fā)酵劑應(yīng)用的開始[4-6]。液體發(fā)酵劑使用方便、價(jià)廉，且大小生產(chǎn)廠家均可自行調(diào)制的特點(diǎn)，極大擴(kuò)充了酸奶的生產(chǎn)領(lǐng)域，但在酸奶工業(yè)的進(jìn)一步集約化、規(guī)?；l(fā)展中，傳統(tǒng)發(fā)酵劑多次活化和擴(kuò)培的煩瑣工藝越來越不能滿足要求；伴隨著低溫干燥生物技術(shù)的發(fā)展，西方乳業(yè)發(fā)達(dá)國家已開發(fā)出了用量小、郵寄儲藏方便，能直接投入生產(chǎn)的多功能商品化發(fā)酵劑。

我國在發(fā)酵劑的研究方面比較滯后，目前還沒有一家專業(yè)化發(fā)酵劑生產(chǎn)廠商。但我國的酸奶生產(chǎn)中，有80%以上的酸奶使用的發(fā)酵劑是濃縮型凍干發(fā)酵劑，其中絕大部分是購自國外知名發(fā)酵劑公司，導(dǎo)致發(fā)酵劑市場被國外企業(yè)壟斷，每年花費(fèi)高達(dá)15億元來引進(jìn)酸奶發(fā)酵劑[7]。因此，對于加強(qiáng)國內(nèi)自主研發(fā)乳酸菌發(fā)酵劑制備的研究水平和工業(yè)化生產(chǎn)刻不容緩。

本研究是以甘南牧區(qū)家庭自制牦牛乳酸奶中分離篩選出的乳酸菌為試驗(yàn)菌株，將其進(jìn)行組合發(fā)酵試驗(yàn)，以期為工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1、材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 菌種

本實(shí)驗(yàn)室自甘南牧區(qū)發(fā)酵乳中分離篩選出的菌株Q2、Q5、G1、G3、G4、G6。

1.12 試劑

胰蛋白胨，酵母粉，酵母膏，瓊脂糖，牛肉膏，蛋白胨，葡萄糖，磷酸氫二鉀（鈉），磷酸二氫鉀（鈉），硫酸氫二鉀（鈉），硫酸二氫鉀（鈉），氯化鈣，氯化鈉，氯化鉀，硫酸鎂，硫酸亞鐵，氯化鈉，硫酸錳，乙醇，雙乙酰，氫氧化鈉，以上試劑均為分析純。脫脂奶粉（黑龍江完達(dá)山）為市售。

1.13 培養(yǎng)基

MRS固體培養(yǎng)基、SL培養(yǎng)基、Elliker培養(yǎng)基、脫脂乳固體培養(yǎng)基及脫脂乳液體培養(yǎng)基。

TJA 培養(yǎng)基：番茄汁50mL，酵母膏5g，牛肉膏10g，乳糖20g，葡萄糖2g，磷酸氫二鉀2g，吐溫-801mL，乙酸鈉5g，加蒸餾水至1000mL，調(diào)節(jié)pH6.8±0.2，于121℃滅菌15min備用[8]。

APT培養(yǎng)基：胰胨10g，吐溫-80lmL，酵母提取物5g，氯化鈉5g，檸檬酸鈉5g，硫酸鎂0.8g，葡萄糖10g，氯化錳0.14g，磷酸氫二鉀5g，硫酸亞鐵0.04g，加蒸餾水至1000mL，調(diào)整pH值為6.7～7.0，121 ℃滅菌15min[8]。

1.14 設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），YX-280A高壓滅菌鍋（上海三申醫(yī)療器械有限公司），HG303-4電熱恒溫培養(yǎng)箱（南京實(shí)驗(yàn)儀器廠），XSP-18S顯微鏡（上海蔡康光學(xué)儀器有限公司），PB-203電子天平（Mettler-Toledo公司）pHS-25數(shù)顯pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器廠）， KUBOTA3740冷凍離心機(jī)（日本KUBOTA久保田公司），YQX-1型厭氧培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康醫(yī)療器械廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 球菌與桿菌間的組合發(fā)酵

篩選菌株經(jīng)過活化后，將其中的2株球菌與4株桿菌分別組合，以3%（V/V）的接種量接種于滅菌的牛奶中，41℃發(fā)酵，凝乳后放入冰箱中4℃冷藏24h后，測定其滴定酸度及黏度，并進(jìn)行感官綜合評價(jià)。球菌與桿菌的組合見表5。

1.2.2 復(fù)配比例的篩選

菌株Q2、G4活化后，將其發(fā)酵液分別按1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1（V/V）進(jìn)行復(fù)配，以3%（V/V）的接種量接種于含6%（m/m）蔗糖的滅菌牛奶中，41℃培養(yǎng)，凝乳后放入冰箱中4℃冷藏24h后，測定其酸度及黏度，并進(jìn)行感官綜合評價(jià)。

1.2.3 發(fā)酵溫度的篩選

菌株Q2、G4活化后，將菌株Q2、Q4的發(fā)酵液按1∶3（V/V）進(jìn)行復(fù)配后，以3%（V/V）的接種量接種于含6%（m/m）蔗糖的滅菌牛奶中，分別置于37、39、41、43、45℃培養(yǎng)，凝乳后放入冰箱中4℃冷藏24h后，測定其酸度及黏度，并進(jìn)行感官綜合評價(jià)。

1.2.4 接種量的篩選

菌株Q2、G4活化后，將菌株Q2、Q4的發(fā)酵液按1∶3（V/V）進(jìn)行復(fù)配后，分別以2、3、4、5%（V/V）的接種量接種于含6%（m/m）蔗糖的滅菌牛奶中，置于43℃培養(yǎng)，凝乳后放入冰箱中4℃冷藏24h后，測定其酸度及黏度，并進(jìn)行感官綜合評價(jià)。

2、結(jié)果與分析

2.1 球菌與桿菌間的組合發(fā)酵

表1 組合發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

由表1可見，8個(gè)組合所發(fā)酵酸奶的黏度在4.20～10.20 dpa. s之間，與市場上酸奶的黏度3～4dpa.s相比，8個(gè)組合所發(fā)酵的酸奶都有很好的黏度，且8個(gè)組合所發(fā)酵酸奶的黏度差異顯著（P＜0.05）。B3組合的黏度最高，A4組合的黏度最低，8個(gè)組合所發(fā)酵酸奶的黏度從強(qiáng)至弱的順序?yàn)锽3＞A2＞A3＞B4＞B2＞A1＞B1＞A4。8個(gè)組合所發(fā)酵酸奶的酸度在74～100°T，滿足酸奶奶酸度70～110°T之間的要求，且8個(gè)組合所發(fā)酵酸奶的酸度存在差異顯著（P＜0.05）。8個(gè)組合發(fā)酵酸奶的酸度從高至低的順序?yàn)椋篈3＞A2＞B3＞A1＞B4＞B2＞A4＞B1。從感官評價(jià)結(jié)果來看，8個(gè)組合所發(fā)酵酸奶的綜合評價(jià)分值在79～88之間，8個(gè)組合發(fā)酵酸奶的綜合評價(jià)分值存在差異顯著（P＜0.05），其中，A3組合發(fā)酵酸奶的綜合評價(jià)結(jié)果最好，A2組合發(fā)酵酸奶的綜合評價(jià)結(jié)果最差。綜上所述，篩選出A3組合為最佳組合，即菌株Q2和G4的組合為最佳組合。

2.2 復(fù)配比例的篩選

表2 菌種復(fù)配比例篩選結(jié)果

由表2可見，隨著發(fā)酵劑中菌株復(fù)配比例不同，所發(fā)酵酸奶的黏度、滴定酸度及感官評價(jià)分值都出現(xiàn)明顯的變化。5種不同發(fā)酵劑所發(fā)酵酸奶的黏度在7.00～9.10dPa.s之間，且存在顯著差異（P＜0.05）。復(fù)配比例為1∶3（V/V）時(shí)所發(fā)酵酸奶的黏度最高，復(fù)配比例為1∶1（V/V）時(shí)發(fā)酵劑所發(fā)酵酸奶的黏度最低。滴定酸度結(jié)果顯示，5種不同發(fā)酵劑所發(fā)酵酸奶的滴定酸度在86.00～96.00 °T之間，且存在顯著的差異（P＜0.05）。復(fù)配比例為1∶3（V/V）時(shí)所發(fā)酵酸奶的酸度最高，復(fù)配比例為1∶1（V/V）時(shí)所發(fā)酵酸奶的酸度最低，感官評價(jià)結(jié)果顯示，復(fù)配比例為1∶3（V/V）時(shí)所發(fā)酵酸奶的感官評價(jià)分值最高，與其余4種發(fā)酵劑所發(fā)酵酸奶的感官評價(jià)分值相比存在顯著的差異（P＜0.05）。綜上所述，最終篩選出最佳復(fù)配比例為1∶3，因?yàn)樵诮臃N比例為1∶3時(shí)，所發(fā)酵酸奶的黏度比較高，組織狀態(tài)比較好，乳清析出也比較少，且發(fā)酵酸奶的滋氣味也比較好。

2.3 發(fā)酵溫度的篩選

表3 單因素試驗(yàn)最佳發(fā)酵溫度篩選結(jié)果

由表3可見，隨著發(fā)酵溫度的變化，所發(fā)酵酸奶的黏度、滴定酸度及感官評價(jià)分值都出現(xiàn)較大的變化。著發(fā)酵溫度的逐步升高，5個(gè)溫度下所發(fā)酵酸奶的黏度也呈現(xiàn)遞增的趨勢。5個(gè)溫度下所發(fā)酵酸奶的黏度在12～15dPa.s，說明5個(gè)溫度下所發(fā)酵酸奶都具有很好的黏度。37℃下發(fā)酵的酸奶黏度最高，45℃下發(fā)酵的酸奶黏度最低，且不同溫度下所發(fā)酵的酸奶黏度存在顯著性差異（P＜0.05），因?yàn)榘l(fā)酵溫度高時(shí)菌株發(fā)酵產(chǎn)酸比較快，酪蛋白凝結(jié)過快造成乳清析出，所以黏度就比較低。隨著發(fā)酵溫度的逐步升高，5個(gè)溫度下所發(fā)酵酸奶的酸度也呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。5個(gè)溫度下所發(fā)酵酸奶的酸度在85～100°T之間，在酸奶產(chǎn)品要求的70～110°T之內(nèi)。43℃下所發(fā)酵酸奶的酸度最高，37℃下所發(fā)酵酸奶的酸度最低，且5個(gè)溫度下所發(fā)酵酸奶的酸度存在顯著性差異（P＜0.05），因?yàn)樗Y選菌株均為高溫發(fā)酵菌株，在低溫狀態(tài)下代謝比較慢，產(chǎn)酸能力也比較弱。隨著發(fā)酵溫度的逐步升高，5個(gè)溫度下所發(fā)酵酸奶的感官評價(jià)分值也呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。43℃下所發(fā)酵酸奶的感官評價(jià)分值最高，37℃下所發(fā)酵酸奶的感官評價(jià)分值最低，且5個(gè)溫度下所發(fā)酵酸奶的感官評價(jià)分值存在顯著性差異（P＜0.05），因?yàn)榘l(fā)酵溫度過高，菌株發(fā)酵酸奶的組織狀態(tài)比較差；發(fā)酵溫度過低，菌株產(chǎn)酸速率比較低，發(fā)酵酸奶的滋氣味比較差。綜上所述，篩選出43℃為最佳發(fā)酵溫度。

2.4 接種量的篩選

表4 單因素試驗(yàn)最佳接種量試驗(yàn)結(jié)果

由表4可見，不同的接種量對發(fā)酵酸奶的黏度、酸度及感官評價(jià)分值均有較大的影響。黏度測定結(jié)果顯示，4個(gè)接種量時(shí)所發(fā)酵酸奶的黏度都在9～11dPa.s之間，與市場現(xiàn)有酸奶的黏度相比偏高。2%接種量時(shí)所發(fā)酵酸奶的黏度最高，4%接種量時(shí)所發(fā)酵酸奶的黏度最低，4個(gè)接種量時(shí)所發(fā)酵酸奶的黏度存在顯著性差異（P＜0.05），因?yàn)榻臃N比例大，菌體發(fā)酵過程中菌體數(shù)增長比較快，產(chǎn)生的乳酸比較多，產(chǎn)酸過快容易造成乳清析出。酸度測定結(jié)果顯示，4個(gè)接種量時(shí)所發(fā)酵酸奶的酸度在90～100°T之間，在酸奶產(chǎn)品要求的70～110°T之內(nèi)。4%接種量時(shí)所發(fā)酵酸奶的酸度最高，2%接種量時(shí)所發(fā)酵酸奶的酸度最低，4個(gè)接種量時(shí)所發(fā)酵酸奶的酸度存在顯著性差異（P＜0.05）。感官評價(jià)結(jié)果顯示，4% 接種量時(shí)所發(fā)酵酸奶的感官評價(jià)分值最高，2%接種量對應(yīng)發(fā)酵酸奶的感官評價(jià)分值最低，4個(gè)接種量時(shí)所發(fā)酵酸奶的酸度存在顯著性差異（P＜0.05）。綜上所述，在接種量為4%時(shí)，菌株發(fā)酵酸奶的感官狀態(tài)最好，因此，篩選出最佳接種量為4%。

3、結(jié)論

通過組合發(fā)酵試驗(yàn)篩選出菌株Q2∶G4為最佳組合，該組合的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度43.0℃、接種量4.0%、菌株Q2∶G4的比例為1∶3時(shí)，所發(fā)酵酸奶的組織狀態(tài)好，感官評價(jià)值最高，為94.90分。

[1] 甘伯中,杜寧娟,李帆,等．甘南牧區(qū)酸奶中乳酸菌的分離與發(fā)酵性能研究[J]．食品科學(xué),2009,30(3):204-208．

[2] 伊利端．幾種泡菜的安全性研究與優(yōu)良乳酸菌的分離、鑒定[D]． 北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2005．

[3] 孫福春．甘肅甘孜地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌分離、篩選、鑒定的研究[D]． 哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2007．

[4] El．Shafei, Ibrahim, Tawfrk． Beneficial uses of locally isolated lactic acid [J]．Egyptian Journal of Dairy Science．2002,30(1):15-25．

[5] 張?zhí)m威,鄂志強(qiáng),萬海峰,等．乳酸菌增菌培養(yǎng)基篩選及干燥保護(hù)劑的選擇[J]．中國乳品工業(yè),2000,28(2):7-9．

[6] 李霞．保加利亞乳桿菌超濃縮培養(yǎng)及生物學(xué)變化規(guī)律[D]．哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文．2006

[7] 奚震,劉然,力守朋,等．直投式乳酸菌發(fā)酵劑的制備團(tuán)[J]．食品研究與開發(fā)．2003,24(6):25．

[8] 李季倫,宋大康．微生物生理學(xué)[M]．北京:北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,1993．

蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號2015-3-138）

Q935

A