白露艷，馬嵐青

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，昆明650032)

?

幽門螺桿菌感染對(duì)細(xì)胞自噬影響的研究進(jìn)展

白露艷，馬嵐青

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，昆明650032)

幽門螺桿菌(Hp)是一種廣泛定植于人胃黏膜的革蘭陰性菌，它與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。自噬是真核生物進(jìn)化過程中的高度保守過程，可清除細(xì)胞內(nèi)的病原微生物，對(duì)維持機(jī)體內(nèi)壞境起重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，Hp能夠入侵胃上皮細(xì)胞和某些免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，并可在自噬體中復(fù)制后被清除。 Hp介導(dǎo)自噬的分子機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，目前認(rèn)為Hp介導(dǎo)自噬與活性氧、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶、未折疊蛋白反應(yīng)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋1、PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。

幽門螺桿菌；自噬；空泡毒素A ；細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A；活性氧；未折疊蛋白反應(yīng)

幽門螺桿菌(Hp)是廣泛定植于胃黏膜的革蘭陰性菌，目前已知其與慢性胃炎、胃和十二指腸潰瘍、胃黏膜相關(guān)的淋巴樣組織淋巴瘤和胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。 Hp可產(chǎn)生多種致病因子，如尿素酶、空泡毒素(VacA)以及細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白(CagA)、脂多糖(LPS)，這些毒力因子參與了疾病的發(fā)生、發(fā)展。Hp感染對(duì)人類的健康造成了巨大威脅，三聯(lián)、四聯(lián)療法是國內(nèi)外推薦的一線治療方法，但隨著Hp對(duì)常用抗生素耐藥率的增加導(dǎo)致其根除率日益下降。自噬是真核生物進(jìn)化過程中的高度保守過程，是機(jī)體抵抗外來刺激的保護(hù)機(jī)制。近期有研究表明，Hp可誘導(dǎo)自噬從而保護(hù)機(jī)體免受毒素?fù)p害。本文對(duì)Hp如何介導(dǎo)自噬進(jìn)行綜述，為Hp感染的防治提供新思路。

1　Hp與自噬的關(guān)系

當(dāng)前一系列證據(jù)提示，Hp能夠在巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞和胃上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬。Terebiznik等[1]首先報(bào)道，胃腺癌上皮細(xì)胞(AGS)被Hp60190菌株感染后誘發(fā)自噬，用Western blot檢測(cè)到細(xì)胞溶質(zhì)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化，熒光顯微鏡下觀察到GFP-LC3向自噬小體聚集；另一方面，Hp誘導(dǎo)的自噬可降解AGS內(nèi)的VacA，抑制其對(duì)宿主細(xì)胞的損傷，這體現(xiàn)自噬可能是宿主細(xì)胞對(duì)抗Hp感染的一種自我保護(hù)機(jī)制。然而，Raju等[2]報(bào)道，AGS細(xì)胞孵育于VacA+Hp培養(yǎng)上清液24 h，會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生缺乏降解底物的組織蛋白酶D的自噬小體；通過Western blot檢測(cè)到自噬降解底物p62表達(dá)增加，LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化減少。提示自噬減弱，并且這些自噬小體成為Hp在細(xì)胞內(nèi)存活和復(fù)制的庇護(hù)所，最終導(dǎo)致持續(xù)性炎癥和胃癌。以上均表明VacA的慢性作用可擾亂細(xì)胞的自噬降解過程。

Chu等[3]首次報(bào)道，自噬增強(qiáng)劑Rapamycin能夠增強(qiáng)Hp清除。該研究小組還發(fā)現(xiàn)，Hp將自噬體作為其生存復(fù)制的地方，但是這些自噬體與溶酶體結(jié)合后能夠降解自噬體內(nèi)的細(xì)菌。Tang等[4]發(fā)現(xiàn)，慢性持續(xù)性Hp感染患者自噬比未感染人群低，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)小分子RNA MIR30B在各種人胃上皮細(xì)胞系(包括AGS)和Hp感染胃黏膜組織中高表達(dá)，過表達(dá)的MIR30B可以抑制BECN1和ATG12的表達(dá)進(jìn)而抑制自噬；其次，通過化學(xué)抑制自噬也證實(shí)能夠增加Hp胞內(nèi)存活。

近期有研究[5]表明，唾液酸和兒茶素等藥物能夠?qū)p所致胃部損傷起到潛在的保護(hù)作用,其機(jī)制可能與Hp感染的胃上皮細(xì)胞上調(diào)細(xì)胞生存相關(guān)的自噬和下調(diào)死亡相關(guān)的凋亡從而降低了炎性反應(yīng)有關(guān)。

2　Hp介導(dǎo)自噬的分子機(jī)制

Hp介導(dǎo)自噬的分子機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，目前認(rèn)為Hp介導(dǎo)自噬與活性氧(ROS)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)、未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋1(LRP1)、PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。

2.1ROSROS是一類化學(xué)性質(zhì)活潑、具有較高氧化活性的分子或離子的總稱,主要包括超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)、羥自由基(HO)、一氧化氮(NO) 等。有文獻(xiàn)報(bào)道，用VacA孵育胃黏膜上皮細(xì)胞，可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP水平降低和ROS水平升高[6]。Calvino-Fernández等[7]發(fā)現(xiàn)，Hp感染后ROS升高，且ROS的量隨Hp感染量和感染時(shí)間升高。在壞死性小腸結(jié)腸炎疾病中，TNF-α可造成線粒體功能異常，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)源性ROS水平升高，引起自噬[8]。Tsugawa等[9]發(fā)現(xiàn)，Hp感染胃黏膜上皮細(xì)胞后，m1型VacA與LPR1結(jié)合導(dǎo)致ROS聚集、谷胱甘肽水平降低進(jìn)而使Akt磷酸化，活化的Akt通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)誘導(dǎo)鼠雙微基因2(MDM2)介導(dǎo)p53降解從而激活自噬，而自噬的激活使得CagA降解。Ishimoto等[10]研究表明，CagA在CD44v9表達(dá)陽性的腫瘤干細(xì)胞上得以蓄積，主要是由于CD44v9表達(dá)陽性細(xì)胞通過xCT介導(dǎo)胱氨酸吸收增加，進(jìn)而促進(jìn)谷胱甘肽的合成抑制自噬所致，表明CagA的聚集可能是Hp與胃癌之間的分子聯(lián)系。近期研究發(fā)現(xiàn)柳氮磺吡啶為xCT抑制劑，可抑制CagA在CD44v9表達(dá)陽性的腫瘤干細(xì)胞上聚集。有文獻(xiàn)[11]提出，ROS聚集可激活 p38有絲分裂原蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路進(jìn)而激活凋亡和自噬。這些研究都提示了ROS與自噬密切相關(guān)。

2.2ERKERK是MAPK中的一員。有文獻(xiàn)[12]報(bào)道，某些抗腫瘤藥物引起肺小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞激活ERK1/2信號(hào)途徑進(jìn)而激活自噬發(fā)生。Kim等[13]報(bào)道，Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的激活通過上調(diào)LC3、SQSTM1 mRNA水平進(jìn)而激活自噬。CagA通過Ⅳ型分泌系統(tǒng)進(jìn)入宿主細(xì)胞后, 其C端的酪氨酸位點(diǎn)發(fā)生了酪氨酸磷酸化, 磷酸化的CagA可以特異地與SHp-2結(jié)合并激活其磷酸酶活性, 這種相互作用激活了多個(gè)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Chen等[14]發(fā)現(xiàn)，烯醇化酶-α(ENO1)在感染了CagA+Hp的AGS中過表達(dá)，利用MAP激酶抑制劑U0126降低MEK1和MEK2的活性從而阻礙ERK1/2磷酸化，36 h后通過Western blot檢測(cè)到ENO1表達(dá)水平較空白對(duì)照組降低，這提示了CagA通過MEK/ERK通路介導(dǎo)ENO1過表達(dá)。近期有研究發(fā)現(xiàn)，ENO1沉默的細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅱ及ATG4B的表達(dá)水平增高，提示自噬被激活。以上為CagA與胃癌分子機(jī)制的研究提供了一個(gè)新的思路。

2.3內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)重要的膜性細(xì)胞器，缺氧、缺血再灌注、藥物、中毒、感染、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏等生理病理因素均可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[15]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激傳導(dǎo)通路中，最為重要的通路為UPR。Wang等[16]發(fā)現(xiàn)，UPR中PERK通路的轉(zhuǎn)錄活化因子4(ATF4)和C/EBP同源蛋白(CHOP)可以上調(diào)自噬相關(guān)基因微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B(MAP1LC3B)和ATG12，可誘導(dǎo)自噬發(fā)生。有文獻(xiàn)[17]報(bào)道，抑制UPR 中的重要分子肌醇依賴酶1(IRE-1)可以顯著抑制自噬，X-盒結(jié)合蛋白1(XBP1)對(duì)細(xì)胞自噬也有重要影響[18]。Hp0175是Hp的一種肽基脯氨酰異構(gòu)酶，屬于分泌型抗原。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Hp0175可以在胃上皮細(xì)胞和單核細(xì)胞系中調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的信號(hào)通路和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19，20]。Halder 等[21]首先發(fā)現(xiàn)，Hp0175能夠上調(diào)自噬相關(guān)基因如MAP1LC3B、ULK1、ATG5和BECLIN1，通過蛋白印記檢測(cè)LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化的量，發(fā)現(xiàn)敲除Hp0175的突變株感染AGS比野生株處理的細(xì)胞自噬減弱；用野生株與敲除了Hp0175的細(xì)菌分別處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)野生株誘導(dǎo)UPR相關(guān)基因ATF4、CHOP、PERK的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，敲除ATF4使得MAP1LC3B、ULK1、CHOP 和 ATG5表達(dá)減少，而敲除了CHOP使得ATG5表達(dá)減少，這提示了Hp0175在UPR介導(dǎo)的自噬中發(fā)揮了重要作用。

2.4LRP1LRP1是低密度脂蛋白受體家族的成員，它首先在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被合成一個(gè)600 kD的單鏈前體，而后在高爾基體中經(jīng)過剪切，加工成雙鏈異二聚體成熟形式，包括胞外含有配體結(jié)合位點(diǎn)的515 kD肽鏈和胞內(nèi)85 kD單次跨膜肽鏈[22]。當(dāng)前一系列研究結(jié)果表明,LRP1能夠啟動(dòng)和調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路，如MAPK、胰島素受體、Akt、ERK以及JNK信號(hào)通路[23]。Yahiro等[24]發(fā)現(xiàn)LRP1在胃上皮細(xì)胞系A(chǔ)Z-521毒素誘導(dǎo)自噬的過程中充當(dāng)了VacA的受體，VacA內(nèi)化通過和LRP1結(jié)合調(diào)節(jié)自噬途徑包括LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的生成，通過siRNA敲除LRP1結(jié)果顯示VacA介導(dǎo)的LC3-Ⅱ的產(chǎn)生被抑制，同時(shí)使細(xì)胞調(diào)亡的標(biāo)志物PARP分解；作為對(duì)VacA的回應(yīng)，半胱天冬酶抑制劑(Z-VAD-fmk)和凋亡抑制劑(Necrostatin-1)并不能抑制VacA誘導(dǎo)的自噬，提示了VacA通過和LRP1結(jié)合誘導(dǎo)的自噬先于細(xì)胞凋亡，其他VacA受體例如RPTPα、RPTPβ和纖維連接蛋白并不能影響VacA誘導(dǎo)的自噬或細(xì)胞凋亡。以上研究結(jié)果說明, VacA可以通過LRP1途徑介導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生自噬和凋亡, 但是其詳細(xì)分子機(jī)制尚不明確, 需要進(jìn)一步深入研究。

2.5PI3K/Akt信號(hào)通路PI3K/Akt是一條經(jīng)典的存活信號(hào)通路， 能被多種細(xì)胞外的刺激因素激活。目前認(rèn)為，PI3K/Akt主要通過調(diào)控下游分子mTOR 來調(diào)節(jié)自噬[25]。另有文獻(xiàn)[26]報(bào)道，CagA可以激活 PI3K/Akt 信號(hào)通路，進(jìn)一步下調(diào)胃癌細(xì)胞抑癌基因 p21 和 p27 的表達(dá)，該機(jī)制可能與 CagA 相關(guān)性胃癌密切相關(guān)。Nakayama等[27]發(fā)現(xiàn)，VacA通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路致使3β 糖原合成酶激酶(GSK3β)磷酸化，然而Hp是否通過PI3K/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)自噬仍需進(jìn)一步研究。

2.6JNK信號(hào)通路JNK信號(hào)通路激活可促進(jìn)Bcl-2/Bcl-XL磷酸化，促使Beclin-1從Beclin-1/Bcl-2/Bcl-XL復(fù)合體中分離從而介導(dǎo)自噬[28]。此外還有文獻(xiàn)[29]報(bào)道，JNK通過損傷調(diào)節(jié)自噬調(diào)制器和Sestrin 2誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。Wandler等[30]發(fā)現(xiàn)，CagA可通過激活JNK信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。凋亡與自噬為細(xì)胞死亡的兩種方式，兩者之間存在復(fù)雜的交互調(diào)控，能被多種應(yīng)激共同激活，共享多個(gè)調(diào)節(jié)分子，故關(guān)于CagA是否通過JNK激活自噬也可進(jìn)行深入研究。

3　小結(jié)

近年來，Hp與細(xì)胞自噬的關(guān)系受到了廣泛關(guān)注。目前研究表明，Hp誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬活性與時(shí)間有關(guān)，短期感染細(xì)胞自噬增強(qiáng)，而長期的慢性感染導(dǎo)致細(xì)胞自噬活性減弱，這一機(jī)制可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。運(yùn)用自噬增強(qiáng)劑可使胞內(nèi)Hp減少，然而Hp介導(dǎo)細(xì)胞的分子機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，目前仍未有研究確切闡明。自噬在Hp感染中的免疫作用也不清楚，這些問題仍有待進(jìn)一步解決。是否可利用自噬這種細(xì)胞機(jī)制清除細(xì)胞內(nèi)Hp而不損傷細(xì)胞本身，這為制定Hp感染的預(yù)防和治療提供了新思路。

[1] Terebiznik MR, Raju D, Vázquez CL, et al. Effect ofHelicobacter pylori′s vacuolating cytotoxin on the autophagy pathway in gastric epithelial cells[J]. Autophagy, 2014,5(3):370-379.

[2] Raju D, Hussey S, Ang M, et al. Vacuolating cytotoxin and variants in atg16L1 that disrupt autophagy promote helicobacter pylori infection in humans[J]. Gastroenterology, 2012,142(5):1160-1171.

[3] Chu YT, Wang YH, Wu JJ, et al. Invasion and multiplication of Helicobacter pylori in gastric epithelial cells and implications for antibiotic resistance[J]. Infect Immun, 2010,78(10):4157-4165.

[4] Tang B, Li N, Gu J, et al. Compromised autophagy by MIR30B benefits the intracellular survival of Helicobacter pylori[J]. Autophagy, 2014,8(7):1045-1057.

[5] Yang JC, Chien CT. A new approach for the prevention and treatment of Helicobacter pylori infection via upregulation of autophagy and downregulation of apoptosis[J]. Autophagy, 2009,5(3):413-414.

[6] Greenfield LK, Jones NL. Modulation of autophagy by Helicobacter pylori and its role in gastric carcinogenesis[J]. Trends Microbiol, 2013,21(11):602-612.

[7] Calvino-Fernández M, Benito-Martínez S, Parra-Cid T. Oxidative stress by Helicobacter pylori causes apoptosis through mitochondrial pathway in gastric epithelial cells[J]. Apoptosis, 2008,13(10):1267-1280.

[8] Xu YN, Cui XS, Sun SC, et al. Mitochondrial dysfunction influences apoptosis and autophagy in porcine parthenotes developing in vitro[J]. J Rep Dev, 2011,57(1):143-150.

[9] Tsugawa H, Suzuki H, Saya H, et al. Reactive Oxygen species-induced autophagic degradation of Helicobacter pylori CagA is specifically suppressed in cancer stem-like cells[J]. Cell Host Microbe, 2012,12(6):764-777.

[10] Ishimoto T, Nagano O, Yae T, et al. CD44 variant regulates redox status in cancer cells by stabilizing the xCT subunit of system xc-and thereby promotes tumor growth[J]. Cancer cell, 2011,19(3):387-400.

[11] Pan BS, Wang YK, Lai MS, et al. Cordycepin induced MA-10 mouse Leydig tumor cell apoptosis by regulating p38 MAPKs and PI3K/AKT signaling pathways[J]. Sci Rep, 2015(5):13372.

[12] Hsieh MJ, Tsai TL, Hsieh YS, et al. Dioscin-induced autophagy mitigates cell apoptosis through modulation of PI3K/Akt and ERK and JNK signaling pathways in human lung cancer cell lines[J]. Arch Toxicol, 2013,87(11):1927-1937.

[13] Kim JH, Hong SK, Wu PK, et al. Raf/MEK/ERK can regulate cellular levels of LC3B and SQSTM1/p62 at expression levels[J]. Exp Cell Res, 2014,327(2):340-352.

[14] Chen S, Duan G, Zhang R, et al. Helicobacter pylori cytotoxin-associated gene A protein upregulates α-enolase expression via Src/MEK/ERK pathway: Implication for progression of gastric cancer[J]. Int J Oncol, 2014,45(2):764-770.

[15] Shi S, Tan P, Yan B, et al. ER stress and autophagy are involved in the apoptosis induced by cisplatin in human lung cancer cells[J]. Oncol Rep, 2016,35(5):2606-2614.

[16] Wang J, Kang R, Huang H, et al. Hepatitis C virus core protein activates autophagy through EIF2AK3 and ATF6 UPR pathway-mediated MAP1LC3B and ATG12 expression[J]. Autophagy, 2014,10(5):766-784.

[17] Castillo K, Rojas-Rivera D, Lisbona F, et al. BAX inhibitor-1 regulates autophagy by controlling the IRE1α branch of the unfolded protein response[J]. EMBO J, 2011,30(21):4465-4478.

[18] Vidal RL, Figueroa A, Thielen P, et al. Targeting the UPR transcription factor XBP1 protects against Huntington's disease through the regulation of FoxO1 and autophagy[J]. Hum Mol Genet, 2012,21(10):2245-2262.

[19] Basak C, Pathak SK, Bhattacharyya A, et al. The secreted peptidyl prolyl cis, trans-isomerase Hp0175 of Helicobacter pylori induces apoptosis of gastric epithelial cells in a TLR4-and apoptosis signal-regulating kinase 1-dependent manner[J]. J Immunol, 2005,174(9):5672-5680.

[20] Basu J, Kundu M. Retraction: TLR4-dependent NF-κB activation and mitogen-and stress-activated protein kinase 1-triggered phosphorylation events are central to Helicobacter pylori peptidyl prolyl cis-, trans-isomerase (Hp0175)-mediated induction of IL-6 release from macrophages[J]. J Immunol, 2015,195(4):1902-1902.

[21] Halder P, Datta C, Kumar R, et al. The secreted antigen, HP0175 ofHelicobacter pylorilinks the unfolded protein response (UPR) to autophagy in gastric epithelial cells[J]. Cell Microbiol, 2014,17(5):214-229.

[22] Boucher P, Herz J. Signaling through LRP1: Protection from atherosclerosis and beyond[J]. Biochem Pharmacol, 2011,81(1):1-5.

[23] Roura S, Cal R, Gálvez-Montón C, et al. Inverse relationship between raft LRP1 localization and non-raft ERK1,2/MMP9 activation in idiopathic dilated cardiomyopathy: Potential impact in ventricular remodeling[J]. Int J Cardiol, 2014,176(3):805-814.

[24] Yahiro K, Satoh M, Nakano M, et al. Low-density lipoprotein receptor-related potein-1 (LRP1) mediates autophagy and apoptosis caused by Helicobacter pylori VacA[J]. J Biol Chem, 2012,287(37):31104-31115.

[25] Liu B, Bao JK, Yang JM, et al. Targeting autophagic pathways for cancer drug discovery[J]. Chin J Cancer, 2013,32(3):113.

[26] Li SP, Chen XJ, Sun AH, et al. CagA+H. pylori induces Akt1 phosphorylation and inhibits transcription of p21 WAF1/CIP1 and p27 KIP1 via PI3K/Akt1 pathway[J]. Biomed Environ Sci, 2010,23(4):273-278.

[27] Nakayama M, Hisatsune J, Yamasaki E, et al. Helicobacter pylori VacA-induced inhibition of GSK3 through the PI3K/Akt signaling pathway[J]. J Biol Chem, 2009,284(3):1612-1619.

[28] Luo S, Rubinsztein DC. BCL2L11/BIM: a novel molecular link between autophagy and apoptosis[J]. Autophagy, 2013,9(1):104-105.

[29] Zhang XY, Wu XQ, Deng R, et al. Upregulation of sestrin 2 expression via JNK pathway activation contributes to autophagy induction in cancer cells[J]. Cell Signal, 2013,25(1):150-158.

[30] Wandler AM, Guillemin K. Transgenic expression of the Helicobacter pylori virulence factor CagA promotes apoptosis or tumorigenesis through JNK activation in drosophila[J]. PLoS Pathog, 2012,8(10):e1002939.

云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目(2015C010Y)；云南省高校聯(lián)合專項(xiàng)基金項(xiàng)目(2012FB027)；云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才基金項(xiàng)目(2013HB087)。

馬嵐青(E-mail: malanqing@aliyun.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.34.040

R573；R378

A

1002-266X(2016)34-0106-04

2016-07-30)