吳召坤 鞏雪英 劉粉紅/陜西省丹鳳縣畜牧獸醫(yī)中心

ELISA試驗(yàn)中常出現(xiàn)的問題及解決方法

吳召坤 鞏雪英 劉粉紅/陜西省丹鳳縣畜牧獸醫(yī)中心

ELISA試驗(yàn)，即酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，具有敏感性高的特點(diǎn)，獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)實(shí)常用ELISA試驗(yàn)檢測(cè)樣品的抗原或抗體，ELISA試驗(yàn)中很多因素都會(huì)影響試驗(yàn)的結(jié)果，試驗(yàn)中常出現(xiàn)的有顯色淡，靈敏度偏低、樣品重復(fù)試驗(yàn)差異大、假陽性和假陰性等。這些都會(huì)使我們對(duì)樣品的真實(shí)結(jié)果做出誤判，現(xiàn)就ELISA試驗(yàn)中非正常檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生的原因進(jìn)行分析，尋討其解決的辦法，以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

一、顯色淡，靈敏度低

1.查看試劑盒是否在有效期內(nèi)，是否按照保存溫度保存。試劑盒過期或保存溫度過高（正常保存溫度2℃～8℃）都會(huì)影響顯色。

2.試劑盒從2℃～8℃冰箱取出后在室溫平衡至少20～30 min。

3.溫育時(shí)間不足或培養(yǎng)箱溫度不足37℃，在ELISA試驗(yàn)中一定要注意溫育時(shí)間和溫度的重要性，在溫育的過程中盡量不要打開溫箱，僻免溫度忽上忽下。溫育時(shí)間不足，溫度過低都會(huì)影響顯色。

4.嚴(yán)格按照試劑說明書要求的洗滌方法洗滌，洗滌時(shí)加洗滌液不能沖擊過大，浸泡時(shí)間過長，要按照說明書上要求的洗滌次數(shù)洗滌。

5.加樣不足，加樣時(shí)要按照加樣量調(diào)整好移液器的刻度，使用配套，內(nèi)壁光滑清潔的吸頭，吸頭不能交叉使用，同時(shí)要對(duì)移液器進(jìn)行校準(zhǔn)，僻免加樣不足使顯色不足。

6.配制洗滌液的水要用純水機(jī)過濾的水，水質(zhì)應(yīng)清潔無異常，不能用酸性過大或堿性過大的水，最好用新鮮合格的蒸餾水。

二、樣品重復(fù)試驗(yàn)差異較大

在檢測(cè)過程中有時(shí)同一樣品兩次檢測(cè)結(jié)果不一樣，差異較大，這種情況可能存在以下幾種原因。

1.兩次檢測(cè)樣品數(shù)量可能不同，加樣時(shí)間長短不一，反應(yīng)時(shí)間長短不一，所以重復(fù)檢測(cè)某一樣品時(shí)，盡量與第一次加樣時(shí)間一致。

2.加樣量不一致，樣品稀釋倍數(shù)要準(zhǔn)確，充分混勻，兩次加樣要使用同一個(gè)移液器。

3.溫育時(shí)間和溫度不一致，洗滌及操作人員不一致。重復(fù)檢測(cè)樣品，操作條件，人員等檢測(cè)過程應(yīng)與上次保持一致。

三、假陽性和假陰性

（一）樣品的采集和保存

1.樣品應(yīng)清亮、透明、新鮮、無溶血，樣品溶血后血清樣品中的血紅蛋白可造成假陽性。

2.樣品被細(xì)菌污染，菌體中的某些物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。

3.僻免樣品反復(fù)凍融。

4.樣品不清亮，樣品里有可見的纖維蛋白絮狀物，易造成假陽性。因而分離血清時(shí)應(yīng)待血液完全凝固，血清自然析出，在分離出合格血清。

（二）加樣

1.樣品的稀釋要按照試劑說明書上規(guī)定的稀釋倍數(shù)稀釋血清，避免血清中的非特異性IgG過多，這些非特異性IgG與酶標(biāo)二抗反應(yīng)極易出現(xiàn)假陽性

2.如果加入的酶結(jié)合物過多或加在較高的孔壁上或孔口，也會(huì)引起本底升高或假陽性。

（三）溫育

在做ELISA試驗(yàn)時(shí)，一定要按照溫育的時(shí)間和溫度進(jìn)行，溫育的時(shí)間和溫度的改變都會(huì)對(duì)反應(yīng)有影響，因而：

1.溫育時(shí)間過短，溫度過低，易致顯色不全。溫育時(shí)間過長，溫度過高，易致非特異結(jié)合物緊附于反應(yīng)孔周圍，難以清洗徹底，產(chǎn)生陰性高值或假陽性反應(yīng)，因而在溫育時(shí)要嚴(yán)格按照規(guī)定的溫度和時(shí)間進(jìn)行溫育。

2.將反應(yīng)板放入恒溫箱時(shí)，反應(yīng)板不能疊放，以保證反應(yīng)板受熱均勻，溫度能迅速達(dá)到平衡。

四、洗板

1.要按照試劑說明書上的說明配制好洗滌液，配制洗滌液用水最好為新鮮的蒸餾水，配制倍數(shù)準(zhǔn)確。

2.洗板時(shí)要按照試劑說明書上的洗滌方法洗滌，不能隨意改變洗滌方法，洗滌時(shí)間，洗滌次數(shù)。

3.不同廠家，不同批次試劑的洗滌液不能混用。

4.配制洗滌液用水的質(zhì)量很重要，關(guān)系試驗(yàn)成敗，準(zhǔn)確與否，洗滌用水最好用新鮮合格的蒸餾水。

五、OD值測(cè)定

顯色完成，加終止液后將反應(yīng)板放入酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值。

1.在反應(yīng)結(jié)束前應(yīng)將酶標(biāo)儀開啟，預(yù)熱10～20 min，儀器放置應(yīng)平穩(wěn)，保證儀器運(yùn)轉(zhuǎn)正常。

2.按照試劑說明書要求調(diào)整好酶標(biāo)儀的檢測(cè)波長。

3.顯色結(jié)束加終止液后，應(yīng)盡快測(cè)定OD值，一般在10 min內(nèi)測(cè)定。

4.酶標(biāo)儀不用時(shí)應(yīng)放置在干燥、干凈的儀器室，加蓋防塵罩，同時(shí)應(yīng)定期對(duì)酶標(biāo)儀進(jìn)行效驗(yàn)，確保儀器運(yùn)轉(zhuǎn)正常，精確。