李冰，陳一強(qiáng)，孔晉亮，羅勁，董必英

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

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黃芩素聯(lián)合兩性霉素B對(duì)煙曲霉菌生物被膜的體外作用

李冰，陳一強(qiáng)，孔晉亮，羅勁，董必英

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

摘要：目的探討黃芩素聯(lián)合兩性霉素B(AMB)對(duì)煙曲霉菌生物被膜的破壞作用和殺菌效果。方法采用微量液基稀釋法測(cè)定黃芩素及AMB對(duì)煙曲霉菌的最低抑菌濃度(MIC)及最低殺菌濃度(MFC)；構(gòu)建煙曲霉菌菌株生物被膜模型,將模型分為空白組、黃芩素組、AMB組、黃芩素+AMB組。成模24 h加入黃芩素組、AMB組、黃芩素+AMB組分別加入相應(yīng)藥物干預(yù)(黃芩素濃度128 μg/mL，AMB濃度8 g/mL)，空白組不干預(yù)。藥物干預(yù)48 h后，結(jié)晶紫染色法行生物被膜半定量觀察，胞外基質(zhì)染色法熒光顯微鏡下觀察生物被膜形態(tài)。結(jié)果生物被膜半定量結(jié)果：AMB組與空白組比較，P>0.05；黃芩素組低于AMB組和空白組，P均<0.05；黃芩素+AMB組低于黃芩素組，P<0.05。熒光顯微鏡下空白組和AMB組可見(jiàn)菌絲密集交叉纏繞，胞外基質(zhì)豐富；黃芩素組菌絲仍密集交叉在一起，但菌絲細(xì)長(zhǎng)、光滑，無(wú)明顯胞外基質(zhì)；黃芩素+AMB組菌絲明顯減少，無(wú)明顯胞外基質(zhì)。結(jié)論黃芩素可以破壞煙曲霉生物被膜胞外基質(zhì)。黃芩素與AMB聯(lián)合應(yīng)用可增加AMB對(duì)煙曲霉菌絲的滲透作用，提高其殺菌效果。

關(guān)鍵詞：煙曲霉；生物被膜；黃芩素；兩性霉素B

煙曲霉菌是一種常見(jiàn)的條件致病真菌，當(dāng)宿主免疫力低下或者肺部的防御機(jī)制下降時(shí)，可引起侵襲性曲霉病、曲霉瘤或過(guò)敏性支氣管肺曲霉病[1]。煙曲霉菌感染在血液科、重癥監(jiān)護(hù)室及呼吸科等科室最為常見(jiàn)，其治療難度大，病死率高。研究發(fā)現(xiàn)，煙曲霉菌可在感染部位分泌大量胞外基質(zhì)并緊密包繞菌絲形成具有三維結(jié)構(gòu)的生物被膜，使得藥物難以達(dá)到菌絲表面的靶位，可增加真菌的耐藥性[2]，使治療難度加大[3]。黃芩素、兩性霉素B(AMB)均為治療煙曲霉菌感染的常用藥物，二者聯(lián)用是否有協(xié)同作用相關(guān)報(bào)道較少。2014年12月~2015年5月，我們觀察了二者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)煙曲霉菌生物被膜的體外破壞作用，現(xiàn)分析結(jié)果，旨在為臨床治療煙曲霉菌感染提供參考。

1材料與方法

1.1材料菌株及載體：受試菌株為臨床株，由廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室提供，經(jīng)本課題組前期試驗(yàn)研究鑒定為成膜能力最強(qiáng)的4號(hào)煙曲霉菌株。醫(yī)用聚氯乙烯薄片(上海景年醫(yī)療器械有限公司)，裁成1 cm×1 cm，作為真菌生物被膜載體，“84”消毒液浸泡過(guò)夜后75%乙醇浸泡15 min，50 ℃烘干備用。主要試劑：黃芩素(陜西慈緣生物技術(shù)有限公司)，AMB(Amresco，USA)，藥物均以粉劑形式提供，用100% DMSO溶解，儲(chǔ)存濃度分別為102.4 mg/mL和3.2 mg/mL，-80 ℃保存；RPMI 1640粉(Gibco，USA)，MOPS(Sigma，USA)，結(jié)晶紫(Sigma，USA)，馬鈴薯葡萄糖瓊脂(中國(guó)陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司)，F(xiàn)ITC-ConA染液(Vector Laboratories，USA)。主要儀器：96、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning，USA)，智能生化培養(yǎng)箱(SPX型，寧波江南儀器廠)，漩渦混合儀(廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司)，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Multiskan GO，USA)，倒置熒光相差顯微鏡(Olympus IX71+DP73+cellSens，日本)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1黃芩素及AMB的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MFC)測(cè)定根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)頒布的M38-A2標(biāo)準(zhǔn)用微量液基稀釋法[4]分別測(cè)定黃芩素、兩性霉素B對(duì)4號(hào)煙曲霉菌株的MIC和MFC，ATCC22019近平滑念珠菌作為質(zhì)控菌株。測(cè)定結(jié)果為黃芩素對(duì)4號(hào)煙曲霉菌株的MIC>128 μg/mL；AMB對(duì)4號(hào)煙曲霉菌株的MIC為1 μg/mL，MFC為8 μg/mL。

1.2.2煙曲霉菌菌株生物被膜模型制備將4號(hào)煙曲霉菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上活化3~5 d，含0.025% Tween20的PBS沖洗斜面收集孢子，經(jīng)MOPS緩沖后調(diào)節(jié)pH為6.9～7.1的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸孢子，血細(xì)胞板計(jì)數(shù)調(diào)整其終濃度為1×105/mL[5]。取無(wú)菌載體置于24孔板中，加入1 mL配置好的孢子懸液，37 ℃培養(yǎng)，間隔24 h更換RPMI 1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h得到早期生物被膜模型[6]。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)將生物被膜模型分為空白組(不加藥)、黃芩素組、AMB組、黃芩素+AMB組。黃芩素的MIC測(cè)量范圍為0.25~128 μg/mL，AMB的MIC測(cè)量范圍為0.062 5~32 μg/mL，本試驗(yàn)使用的藥物濃度為黃芩素128 μg/mL，AMB 8 g/mL。于建模24 h按上述濃度加入藥物，每孔1 mL，加入藥物前用PBS輕輕漂洗載體1次，37 ℃孵育，每間隔24 h換藥1次，藥物作用48 h后取出載體。

1.2.4生物被膜半定量采用結(jié)晶紫染色法。各組藥物作用48 h后分別取出載體，用滅菌PBS輕輕漂洗載體表面浮游菌3次，加入2.5%戊二醛2 mL固定2 h，加入1%結(jié)晶紫染色15 min，用滅菌的生理鹽水洗脫未結(jié)合的結(jié)晶紫，將載體移至新的24孔板，室溫干燥后用1 mL 95%乙醇脫色10 min，將洗脫液混勻后轉(zhuǎn)移至96孔板，100 μL/孔，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD570[7]。每組重復(fù)3次取平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5生物被膜形態(tài)觀察各組藥物作用48 h后，分別取出載體，用滅菌PBS輕輕漂洗載體表面浮游菌3次，每孔加入100 μL以滅菌，雙蒸水配制的25 μg/mL的FITC-ConA染液沒(méi)過(guò)載體，避光染色90 min，滅菌生理鹽水輕輕漂洗去除多余的染料，倒置相差熒光顯微鏡下觀察生物被膜形態(tài)[8]。

2結(jié)果

2.1生物被膜半定量結(jié)果空白組、AMB組、黃芩素組、黃芩素+AMB組煙曲霉生物被膜定量OD570分別為1.997±0.262、1.830±0.263、1.093±0.145和0.679±0.147；AMB組與空白對(duì)照組比較，P>0.05；黃芩素組低于空白組及AMB組，P均<0.05；黃芩素+AMB組低于黃芩素組，P<0.05。

2.2生物被膜形態(tài)變化空白組和AMB組可見(jiàn)菌絲密集交叉纏繞，胞外基質(zhì)豐富；黃芩素組菌絲仍密集交叉在一起，但菌絲細(xì)長(zhǎng)、光滑，無(wú)明顯胞外基質(zhì)；黃芩素+AMB組菌絲明顯減少，無(wú)明顯胞外基質(zhì)。見(jiàn)插頁(yè)Ⅰ圖1。

3討論

黃芩素是黃芩的提取物之一，具有清熱、抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、止血安胎等功效。體外研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素對(duì)綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌等微生物的生物被膜均有抑制作用[9~11]。目前黃芩在臨床廣泛用于上呼吸道感染、泌尿系統(tǒng)感染等的治療。AMB作為殺真菌劑，其作用機(jī)制是與真菌細(xì)胞膜上的重要成分麥角甾醇結(jié)合，形成“小孔”，導(dǎo)致細(xì)胞膜的屏障功能受損，細(xì)胞質(zhì)重要成分外漏、流失，有毒物質(zhì)或無(wú)用物質(zhì)內(nèi)滲，真菌生命力下降，直至死亡[12]。目前，黃芩素對(duì)生物被膜的具體作用機(jī)制仍待進(jìn)一步研究，我們猜測(cè)黃芩素可能是通過(guò)基因和蛋白質(zhì)水平導(dǎo)致煙曲霉胞外基質(zhì)的合成減少，也可能是通過(guò)理化作用或生物酶解作用增強(qiáng)對(duì)煙曲霉胞外基質(zhì)的破壞和清除。

本研究結(jié)果顯示，AMB組被膜定量及定性指標(biāo)與空白組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示生長(zhǎng)24 h的煙曲霉已能夠分泌大量胞外基質(zhì)，保護(hù)生物被膜內(nèi)部菌絲不被AMB殺滅。黃芩素組被膜定量均明顯低于空白組和AMB組，提示亞抑菌濃度下的黃芩素可破壞煙曲霉已形成的生物被膜。黃芩素聯(lián)合AMB作用后OD570進(jìn)一步降低，熒光顯微鏡下菌絲變得清晰、稀疏、皺縮，說(shuō)明黃芩素破壞煙曲霉所產(chǎn)生的胞外基質(zhì)后，使AMB得以有效與菌絲細(xì)胞膜上的靶位結(jié)合，增加細(xì)胞膜的通透性，達(dá)到殺菌作用。以上研究表明，黃芩素可破壞煙曲霉菌生物被膜的胞外基質(zhì)，促進(jìn)AMB的滲透性，起到協(xié)同殺菌作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究黃芩素對(duì)煙曲霉生物被膜干預(yù)作用的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)，為臨床最終控制煙曲霉生物被膜相關(guān)感染提供參考。

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Effects of baicalein combined with amphotericin B on aspergillus fumigatus biofilm in vitro

LIBing,CHENYiqiang,KONGJinliang,LUOJing,DONGBiying

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the destructive effect and sterilizing effect of baicalein combined with amphotericin B (AMB) on aspergillus fumigatus biofilm. MethodsThe broth microdilution method was employed to test the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum fungicidal concentration (MFC) of baicalein and AMB, and the biofilm models of aspergillus fumigatus were established, and the models were divided into the blank group, baicalein group, AMB group and baicalein+AMB group. After modeling for 24 hours, the corresponding drugs were added to the baicalein group, AMB group and baicalein+AMB group. After 48-hour intervention, crystal violet assay was operated for the semi-quantification and extracellular matrix was used to observe the biofilm morphology under fluorescence microscopy. ResultsCrystal violet semi-quantification indicated that there was no significantly difference between AMB group and the control group (P>0.05), the biofilm of the baicalein group was significantly lower than that of either AMB group or the control group (P<0.05), and the baicalein+AMB group was lower than the baicalein group (P<0.05). Fluorescence microscopy showed that the hypha of control group and AMB group was crossed and encoded with rich extracellular matrix, the hypha of the baicalein group was still intensively crossed and became smoother and slender with less extracellular matrix, in the baicalein+AMB group, mycelium was significantly reduced with hardly extracellular matrix. ConclusionsBaicalein can destroy the extracellular matrix of aspergillus fumigatus biofilm. Baicalein combined with AMB can increase the penetration of AMB on aspergillus fumigatus and improve its sterilizing effect.

Key words:aspergillus fumigatus; biofilm; baicalein; amphotericin B

(收稿日期：2015-11-09)

中圖分類號(hào)：R974

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)04-0005-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.04.002

通信作者簡(jiǎn)介：陳一強(qiáng)(1959-)，男，教授、主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)楹粑到y(tǒng)感染性疾病、支氣管哮喘、肺栓塞。E-mail： chenyq0708@sina.com。

作者簡(jiǎn)介：第一李冰(1990-)，女，主要研究方向?yàn)楹粑到y(tǒng)感染性疾病。E-mail： 419867626@qq.com。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260002)。