陳兆龍

(黑龍江省蘿北縣畜牧獸醫(yī)局,黑龍江蘿北 154200)

應用間接炭粉凝集試驗診斷豬副傷寒

陳兆龍

(黑龍江省蘿北縣畜牧獸醫(yī)局,黑龍江蘿北 154200)

間接炭粉凝集試驗是以極細的炭粉(活性炭)為載體,將已知的豬霍亂沙門氏菌抗體吸附在炭粉的表面,制成抗體致敏炭粉,成為診斷未知豬副傷寒抗原的診斷液;反之,也可將已知的豬霍亂沙門氏菌懸液(抗原)吸附在炭粉的表面,制成抗原致敏炭粉,成為檢查未知豬副傷寒抗體的診斷液。豬副傷寒炭粉診斷液與相應抗原(或抗體)相遇時,在電解質(zhì)的參與下,二者發(fā)生特異性結(jié)合,使形成肉眼可見的炭粉凝集塊,液體變得清亮透明,即為陽性反應;如果二者不相應,炭粉則聚集于液滴的中央,成為一個搖而不散的炭粉團,即為陰性。

副傷寒;豬;試驗診斷

1 試驗器材

96孔V型血清反應板1塊，刻度吸管數(shù)支，微量混合器1臺，臺式離心機1臺。

2 試驗試劑

（1）活性炭。商品活性炭的顆粒大小不勻，多數(shù)呈不規(guī)則的針狀。而致敏用的炭粉粒度要求在0.125～0.15mm之間。

（2）豬霍亂沙門氏菌高免疫血清。以仔豬副傷寒C500強度免疫家兔制成，效價不低于1：5600。以pH 6.4 PBS稀釋成1：400倍，56℃ 30min滅活后，置4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）稀釋液。pH6.4 PBS液98ml，加硼酸1.0g，加正常兔血清1.0ml，56℃30min滅活。

（4）pH6.4磷酸緩沖（PBS）液。

（5）豬副傷寒抗體致敏炭粉診斷液。取上述濕炭粉0.25g，加豬霍亂沙門氏菌高免疫血清（1：400）3.0ml，混勻后于37℃水浴中致敏10min，其間不斷振搖，取出后以3000轉(zhuǎn)/min離心10min，棄去上清液。按同樣方法洗滌2次后，往沉淀物中加1%正常兔血清5.0ml，搖勻，以3000轉(zhuǎn)/min離心10min，棄去上清液。最后向沉淀物中加1%正常兔血清3.0m，1%硫柳汞溶液0.03ml，充分混勻后即成豬副傷寒抗體致敏炭粉診斷液。

豬副傷寒抗體致敏炭粉診斷液的鑒定：在96孔V型血清反應板的第1、2孔內(nèi)分別加入相應菌懸液0.1ml；第3孔加稀釋液0.1ml，作對照。更換刻度吸管向第1、3孔中滴加豬副傷寒抗體致敏炭粉診斷液0.1ml；第2孔中滴加稀釋液0.1m，充分振蕩3分鐘，至見不到炭粒沉淀為止。放置于濕盒內(nèi)，靜止5～7min，取出觀察結(jié)果。如第1孔出現(xiàn)明顯凝集，第2、3孔不出現(xiàn)凝集，則制備的豬副傷寒抗體致敏炭粉診斷液為合格；如第1孔不出現(xiàn)明顯凝集，為不合格，應重作。

（6）豬副傷寒抗原致敏炭粉診斷液。①洗滌抗原：將豬副傷寒沙門氏菌培養(yǎng)物用無菌生理鹽水制成懸液，加入0.2%福爾馬林殺菌。以3000～5000轉(zhuǎn)/min離心沉淀30min集菌。沉淀菌以生理鹽水洗滌2次，并用生理鹽水制成2%菌懸液。②抗原擊碎：將2%菌懸液置小三角瓶內(nèi)，放入超聲波清水槽內(nèi)擊碎15min（輸出功率250W，水深3cm，頻率320～340mA），采樣放顯微鏡下檢查有無完整菌體，如有未擊碎菌體，可繼續(xù)擊碎5min。全部擊碎后，以1000轉(zhuǎn)/min離心5min，收集上層液體，即為抗原液，棄去沉淀。③豬副傷寒抗原致敏炭粉：取上述濕炭粉0.25g，加抗原液4.0ml，于20℃以上條件下，在超聲波清水槽內(nèi)作用15min（條件與抗原擊碎時相同）。取出后以3000轉(zhuǎn)/min離心5min（上層液可作為抗原回收）。沉淀物加正常兔血清0.25ml，充分振蕩，使自凝炭粉分散，再加稀釋液10ml，充分混勻后，以3000轉(zhuǎn)/min離心10min。沉淀物再以稀釋液洗滌3次。最后，將沉淀物懸浮于2.0ml稀釋液中，即為豬副傷寒抗原致敏炭粉診斷液。④豬副傷寒抗原致敏炭粉診斷液的鑒定：取豬霍亂沙門氏菌高免疫血清在96孔V型血清反應板，用稀釋液作倍比稀釋，最后1孔為稀釋液作對照。每孔中各加豬副傷寒抗原致敏炭粉診斷液1白金耳，輕輕混勻至見不到炭粒沉淀為止。放置于濕盒內(nèi)，靜止5～7分鐘，取出觀察結(jié)果。如在免疫血清稀釋至含有1：200～1：400滴度，出現(xiàn)“＋＋”凝集者為合格，例如1：12800滴度免疫血清稀釋至32～64倍時能出現(xiàn)“＋＋”凝集者。

（7）正常炭粉。用以56℃30分鐘滅活后的正常家兔血清代替豬霍亂沙門氏菌高免疫血清，按上法處理炭粉即可。

（8）待檢測抗原。以血液瓊脂或麥康凱瓊脂從病豬肝、脾或肺分離豬霍亂沙門氏菌。將培養(yǎng)物用無菌生理鹽水制成豬霍亂沙門氏菌懸液，以3000～5000轉(zhuǎn)/min離心沉淀30min集菌。沉淀菌以生理鹽水做成1：50豬霍亂沙門氏菌懸液，供試驗用。如為豬的臟器標本，可以乳缽研碎后，加入1：10～1：20生理鹽水做成混懸液，以脫脂棉過濾，取過濾液，供檢驗用。

3 試驗方法

試驗方法有玻板凝集法和反應板凝集法兩種?，F(xiàn)以反應板凝集法為例介紹如下。

（1）血清反應板的第1、2孔滴加待檢抗原液0.1ml；更換刻度吸管，向第3、4孔，分別各加生理鹽水0.1ml。

（2）更換刻度吸管，向血清反應板的第1、2、3孔分別各滴加豬副傷寒抗體致敏炭粉診斷液0.1ml；更換刻度吸管，向第4孔滴加正常炭粉0.1ml；置微量混合器上（或手持旋轉(zhuǎn)）混合3min，使豬副傷寒抗體致敏炭粉均勻分散于液體中，置濕盒內(nèi)，室溫下反應5min后觀察結(jié)果。

4 判定標準

“＋＋＋＋”：100%凝集。炭粉在數(shù)秒鐘迅速凝聚，液體透明?！埃保?5%凝集。大部分炭粉呈微粒凝聚，液體基本透明?！埃保?0%凝集。一半的炭粉凝集，其余的炭粒團聚呈較大的球形，搖而不散，液體呈半透明狀?！埃保?5%凝集。炭粉很少凝集，液體呈不透明狀。振蕩時，膠粘的炭粉牢固團聚在一起?！埃保簾o凝集。炭粉顆粒均勻分布于液體中不發(fā)生凝集，液體呈均勻混濁的不透明狀。振蕩后沒有凝聚的細小炭粒聚集于液滴中央。以“＋＋”為判定終點。如第2～4孔均呈現(xiàn)為陰性；第1孔呈現(xiàn)“＋＋”以上者（包括“＋＋”），被檢樣品為陽性。如第1孔呈現(xiàn)“＋”為可疑；呈“－”為陰性。

[1] 周利岳.豬副傷寒的診治[J].畜禽業(yè)，2009，（9）：82.