曲環(huán)汝　曹左媛　王東建

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 (上海200032)

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不同體質(zhì)MRL/lpr狼瘡鼠RORγt、Foxp3 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)*

曲環(huán)汝曹左媛王東建△

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 (上海200032)

摘要目的：觀察不同體質(zhì)MRL/lpr雌性狼瘡鼠RORγt、Foxp3 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，證實(shí)狼瘡鼠體質(zhì)差異的物質(zhì)基礎(chǔ)。方法：將3月齡狼瘡鼠按體質(zhì)分為常體、熱體、寒體，飼養(yǎng)1月后，采用RT-PCT、Western Blot方法檢測不同組別狼瘡鼠血清ds-DNA，腎臟RORγt、Foxp3 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)。結(jié)果：不同體質(zhì)MRL/lpr雌性狼瘡鼠間RORγt mRNA的表達(dá)無明顯差異，RORγt蛋白質(zhì)的表達(dá)、Foxp3 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)存在明顯差異。MRL/lpr熱體組小鼠RORγt、Foxp3 mRNA及蛋白水平均偏低。結(jié)論：MRL/lpr狼瘡鼠體質(zhì)差異與RORγt、Foxp3基因及蛋白質(zhì)的表達(dá)有關(guān)。

主題詞紅斑狼瘡系統(tǒng)性動物，實(shí)驗(yàn)體質(zhì) RORγt Foxp3

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus, SLE)屬于慢性自身免疫性結(jié)締組織疾病。SLE病因不明，可能與遺傳、免疫功能紊亂、環(huán)境因素、激素水平等相關(guān)。既往研究顯示，不同體質(zhì)NZB/W F1狼瘡鼠間24小時(shí)尿蛋白總量、肌酐、腎臟組織的纖維化及腎組織CTGF基因表達(dá)存在差異[1-2]。MRL/lpr狼瘡鼠也具有體質(zhì)差別，其在卵巢激素水平的變化、B淋巴細(xì)胞刺激因子及其受體基因及蛋白質(zhì)的表達(dá)存在一定差異，再次證明不同體質(zhì)狼瘡鼠病變程度不同且各自具有相應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)[3-4]。

本研究初步觀察不同體質(zhì)MRL/Lpr狼瘡鼠視黃酸受體相關(guān)孤束核激素受體(Retinoic acid-related orphan nuclear receptor, RORγt)、叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子P3 (Forkhead/winged helix transcription factor, Foxp3)基因及蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。進(jìn)一步研究狼瘡鼠體質(zhì)存在的客觀依據(jù)及差異，為中醫(yī)學(xué)辨證論治基礎(chǔ)研究提供理論依據(jù)，指導(dǎo)臨床實(shí)驗(yàn)，對于觀察中藥方劑的作用靶點(diǎn)及療效具有重要意義。

1材料1.1動物3月齡MRL/Lpr雌性小鼠60只，體重27～38g，上海靈暢生物科技有限公司提供，許可證號 SCXK(滬)：2013-0018，上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心封閉SPF級飼養(yǎng)。

1.2主要試劑SYBR@Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)試劑盒、PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒，TaKaRa公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；Anti-ROR gamma T(批號MABF81)、Anti-FOXP3(批號ABE75)、HRP-ECL發(fā)光檢測試劑盒，Millipore公司。

1.3儀器采用上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中醫(yī)學(xué)教研室方肇勤教授課題組建立的“實(shí)驗(yàn)小鼠四診工作站”方法。主要儀器包括SQF-EA 體視顯微鏡、數(shù)碼相機(jī)接口、Nikon 4500 數(shù)碼相機(jī)、3200K(色溫150W 攝像專業(yè)鎢絲燈，LS-600 三腳架，WMY-01 數(shù)字溫度計(jì)，曠場實(shí)驗(yàn)籠具，YLS-13A 型大小鼠抓力測定儀等。

2方法2.1分組采用上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中醫(yī)學(xué)教研室方肇勤教授課題組所建立的“實(shí)驗(yàn)小鼠四診工作站”方法[5]，對60只MRL/Lpr小鼠進(jìn)行檢測，檢測指標(biāo)與方法主要包括小鼠體重、爪r值、尾r值、腋溫、35秒內(nèi)跨格數(shù)(水平跨格與前肢離地次數(shù))、小鼠肢體抓力等。將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，參考既往小鼠寒熱體質(zhì)辨證文獻(xiàn)，按以下公式計(jì)算：寒熱權(quán)重值=個(gè)體腋溫/腋溫均數(shù)×0.2+個(gè)體爪r/爪r均數(shù)×0.2+個(gè)體尾r/尾r均數(shù)×0.1+個(gè)體抓力/抓力均數(shù)×0.1+個(gè)體水平/水平均數(shù)×0.2+個(gè)體直立/直立均數(shù)×0.2。按照權(quán)重的降序排序，經(jīng)權(quán)重總值大小排序，根據(jù)權(quán)重大，體現(xiàn)熱體；權(quán)重小，體現(xiàn)寒體的原則，參考正態(tài)分布數(shù)據(jù)，中間約60%為正常體質(zhì)，兩側(cè)各各約20%為寒熱體質(zhì)(或偏寒熱體質(zhì))的原則，對60只MRL/Lpr狼瘡鼠進(jìn)行寒、熱、常體質(zhì)判定，從而得到寒、熱和常三種體質(zhì)小鼠各12只。

2.2狼瘡鼠抗ds-DNA抗體測定不同體質(zhì)狼瘡鼠16周時(shí)眼球采血后斷頸處死，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，檢測血清抗ds-DNA抗體(按試劑盒說明書操作)。

2.3腎臟RORγt mRNA、Foxp3 mRNA測定采用RT-PCR法，常規(guī)抽提腎臟組織總RNA，用核算蛋白定量分析儀進(jìn)行RNA定量。在Genebank中查找目的基因的mRNA序列，應(yīng)用primer軟件設(shè)計(jì)引物。FOXP3-F：5’-CACCCAGGAAAGACAGCAACC-3’；FOXP3-R：5’-CTGCTTGGCAGTGCTTGAGAAAC-3’；RORγt-F：5’-CAATGCCAACCGTCCTGGGCTCC-3’；RORγt-R：5’-GGGTGGCAGCTTGGCTAGGAGGC-3’。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)，相對mRNA水平用actin為內(nèi)參采用-Ct算法，結(jié)果以2^(-Ct)顯示。

2.4腎臟RORγt、Foxp3蛋白質(zhì)測定采用Western Blot法，腎組織標(biāo)本經(jīng)勻漿充分淹沒，裂解液裂解提取蛋白后，BCA法測定蛋白濃度。配置12%分離膠，加TEMED、10%過硫酸銨，混勻后立即灌膠，在凝膠中電泳分離，完畢后將蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，加入一抗、二抗孵育。膜與化學(xué)發(fā)光檢測劑反應(yīng)2min，發(fā)光后掃膜。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法檢測數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，如差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則行LSD-t(Least significant difference)檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。多樣本均數(shù)不滿足證態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)，P<0.05表示差異為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果3.1狼瘡鼠一般情況實(shí)驗(yàn)前各組別狼瘡鼠均毛色光滑，活動靈敏，各組間未見明顯差異；隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間推移各組出現(xiàn)活動遲鈍，皮毛稀疏、欠光澤，相對消瘦。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中常體組自然死亡2只，熱體組自然死亡3只，寒體組自然死亡2只。

3.2血清中抗ds-DNA抗體水平MRL/Lpr狼瘡鼠平均抗ds-DNA抗體水平101.73±30.52IU/mL，其中常體組小鼠抗ds-DNA抗體為89.52±26.34 IU/mL，低于寒體組小鼠109.45±34.81 IU/mL和熱體組小鼠106.72±28.78 IU/mL，但三組間差異尚未顯示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.263，P=0.299)。

3.3腎臟RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的表達(dá)不同體質(zhì)MRL/lpr狼瘡鼠間RORγt mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.515)，F(xiàn)oxp3 mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中常體組Foxp3 mRNA表達(dá)水平高于寒體組、熱體組(P<0.05)，見表1。

3.4腎臟RORγt、Foxp3蛋白水平的表達(dá)不同體質(zhì)MRL/lpr狼瘡鼠RORγt、Foxp3蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中對于RORγt蛋白水平表達(dá)，寒體組明顯高于常體組、熱體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而Foxp3蛋白水平表達(dá)，寒體組高于常體組、熱體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2、圖1、圖2)。

4討論近年來，國內(nèi)在不同品系的實(shí)驗(yàn)動物的體質(zhì)方面開展的研究顯示，Wistar大鼠、昆明種、Balb/c、NZB/W F1、H22肝癌荷瘤小鼠等實(shí)驗(yàn)小鼠體質(zhì)皆存在一定差異且與細(xì)胞因子、激素水平等存在一定相關(guān)性[5-7]。提示我們在實(shí)驗(yàn)中，除了考慮小鼠品系外，也應(yīng)注意到同一品系間的個(gè)體差異(體質(zhì)的不同)。本課題在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對MRL/lpr狼瘡鼠的RORγt、Foxp3 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行研究，尋找狼瘡鼠體質(zhì)差異的物質(zhì)基礎(chǔ)。T細(xì)胞在SLE病理中扮演了關(guān)鍵和多樣化角色。CD4+CD25+Treg與Th17細(xì)胞無疑是近年來T細(xì)胞參與狼瘡病變機(jī)制的研究熱點(diǎn)領(lǐng)域，正常狀態(tài)下，CD4+CD25+Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞功能上相互拮抗，保持相對平衡，維持機(jī)體的免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。Foxp3 轉(zhuǎn)錄因子在Treg上的表達(dá)有其特異性，在Treg細(xì)胞的發(fā)育的調(diào)控上起很重要的作用，同時(shí)可抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的過度生長[8]。Foxp3基因表達(dá)缺陷與突變皆可導(dǎo)致炎癥性自身免疫疾病的發(fā)生[9]。Th17細(xì)胞因子信號需要通過不同轉(zhuǎn)錄因子作用于信號分化，其中ROR家族的視黃酸受體相關(guān)孤束核激素受體(RORγt)的過度表達(dá)，可以促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化，通過對RORγt表達(dá)的抑制可以影響Th17細(xì)胞的分化與功能[10]。目前臨床研究已顯示，SLE患者其Foxp3mRNA的表達(dá)較健康對照組降低，且活動期患者Foxp3 mRNA表達(dá)更低[11]，SLE患者活動期外周RORγtmRNA表達(dá)水平高于健康組[12]。

中醫(yī)認(rèn)為陰平陽秘，精神乃至，體內(nèi)陰陽平衡，則機(jī)體免疫功能正常，一旦平衡打破，則進(jìn)入疾病狀態(tài)。體質(zhì)是疾病發(fā)生發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，從某種程度上決定了臨床證候的類型，并對證候的轉(zhuǎn)歸和疾病的預(yù)后產(chǎn)生影響。本研究通過測定16周MRL/lpr小鼠抗ds-DNA抗體發(fā)現(xiàn)，熱體組、寒體組小鼠抗ds-DNA抗體水平均高于常體組，表明有寒熱體質(zhì)偏移的MRL/lpr小鼠病情更重。

RORγt和Foxp3轉(zhuǎn)錄因子，相互制約，在分子水平介導(dǎo)Treg和Th17細(xì)胞的動態(tài)平衡。進(jìn)一步分析腎臟RORγt、Foxp3 mRNA及蛋白水平的表達(dá)可得，不同體質(zhì)間其轉(zhuǎn)錄因子的蛋白轉(zhuǎn)錄及表達(dá)翻譯存在不同，提示其可能是MRL/lpr狼瘡鼠不同體質(zhì)差異形成的因素之一。

MRL/lpr狼瘡鼠模型主要以腎臟累及，大量蛋白尿表現(xiàn)為主，臨床辨證中這一類型患者大部分常辨為脾腎陽虛證，可見抗ds-DNA升高、Foxp3 mRHA及蛋白表達(dá)降低。熱體組小鼠在陽虛基礎(chǔ)上兼有熱邪，可能是Foxp mRNA和蛋白表達(dá)較寒體組更低的原因。故本研究的結(jié)果有待更多動物模型佐證。對MRL/lpr小鼠體質(zhì)的前期研究顯示，寒體組MRL/lpr小鼠腎組織BAFF、BAFF-R蛋白質(zhì)水平較低[4]，本研究顯示MRL/lpr熱體組小鼠RORγt、Foxp3 mRNA及蛋白水平均偏低(P<0.05)，提示不同體質(zhì)類型中T、B細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)存在差異，不同體質(zhì)的細(xì)胞免疫、體液免疫可能不同，是否與疾病產(chǎn)生于與發(fā)展相關(guān)，有何聯(lián)系也有待進(jìn)一步研究。

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(收稿2016-03-07；修回2016-04-15)

【中圖分類號】R593.24

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.06.049

*上海市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(10ZR1430300)

上海市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研基金項(xiàng)目(2010L009A)

△上海市第八人民醫(yī)院中醫(yī)科(上海200235)