楊曉莉　李　輝　繩金房

陜西省食品藥品檢驗(yàn)所(西安 710065)

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12種中藥飲片耐熱菌污染狀況調(diào)查及風(fēng)險(xiǎn)評估*

楊曉莉李輝繩金房△

陜西省食品藥品檢驗(yàn)所(西安 710065)

摘要目的：調(diào)查陜西省12種常見中藥飲片的耐熱菌污染狀況，評估安全風(fēng)險(xiǎn)，為中藥飲片的用藥安全及微生物質(zhì)量控制提供支持。方法：按照《中國藥典》2015年版需氧菌總數(shù)(TAMC)檢驗(yàn)方法，100℃水浴30min熱處理后，對金銀花等12種中藥飲片進(jìn)行耐熱菌數(shù)測定及分離、鑒別。結(jié)果:熱處理后，中藥飲片耐熱菌平均較TAMC下降低2.6個(gè)對數(shù)單位。耐熱菌數(shù)>10cfu/g的(97/120)為80.84%，分別檢出緩慢葡萄球菌、地衣芽孢桿菌、放射根瘤菌、少動鞘氨醇桿菌、阪崎腸桿菌、泛菌屬、巴斯德菌屬等多種耐熱菌。結(jié)論:中藥飲片耐熱菌污染情況嚴(yán)重，應(yīng)結(jié)合耐熱菌的污染種類和數(shù)量，建立合理的耐熱菌質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，保障中藥飲片的用藥安全。

主題詞飲片耐熱菌安全

中藥飲片是中醫(yī)藥的重要特色和優(yōu)勢之一，目前其質(zhì)量控制是中藥質(zhì)量控制的薄弱環(huán)節(jié)，在每年國家食品藥品監(jiān)管局組織的藥品質(zhì)量抽查中，中藥飲片的合格率都是最低的[1-2]。中藥飲片常經(jīng)過煎煮或泡服而用于患者，某些污染微生物經(jīng)過高溫處理后可能依然能夠存活，會對用藥安全性造成威脅。目前中國藥典2015年版，美國藥典(USP38)、歐洲藥典(EP8.0)、日本藥局方(JP16)等標(biāo)準(zhǔn)雖收載了中藥飲片的微生物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)[3-6]，但對中藥飲片耐熱菌尚未做出規(guī)定，中藥飲片耐熱菌污染狀況鮮有報(bào)道。本文對金銀花、百合、龍骨、合歡皮、白術(shù)、煅牡蠣、夏枯草、鴉膽子、重樓、姜黃、穿心蓮、海螵蛸等12種常用口服兼外用的品種，包括花類、根莖類、皮類、種子類、動物類等120批中藥飲片進(jìn)行耐熱菌污染狀況的調(diào)查研究，評估安全風(fēng)險(xiǎn)，為中藥飲片的用藥安全及微生物質(zhì)量控制提供支持。

1儀器和材料1.1試驗(yàn)菌株金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26 003]；枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63 501]；大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B) 44 102]；白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98 001]；黑曲霉( Aspergillus niger)[CMCC(F) 98 003]均來自中國食品藥品檢定研究院，工作用菌株為第3代。

1.2樣品信息為使樣品更具代表性，樣品采集覆蓋陜西省區(qū)域內(nèi)的西安、榆林、商洛、銅川、漢中等5地，涉及生產(chǎn)企業(yè)、零售藥店、醫(yī)院藥房和藥材批發(fā)市場，每個(gè)品種10批，共120批。

1.3培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA)，沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(SDB)，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)，以上培養(yǎng)基,均購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，批號依次為1302222、140505、130806、130821，培養(yǎng)基適用性檢查均符合《中國藥典》2015年版和《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》的規(guī)定[3,7]。

1.4儀器設(shè)備HFsafe-1200LC型生物安全柜，上海力申科學(xué)儀器有限公司；SHA-C型水浴恒溫振蕩器，天津鑫博得有限公司；LRH-250F生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LRH-250F霉菌培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LRH-150B生化培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠；DK-98-1恒溫水浴鍋，天津奉斯特儀器公司；VITEK2全自動微生物鑒定系統(tǒng)，法國梅里埃有限公司；OLYMPUS.CH型三目顯微鏡，日本奧林巴斯公司；渦旋混合器，德國IKA公司。

2實(shí)驗(yàn)方法2.1供試液制備稱取25g樣品加入pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液225mL，振蕩10min，制成1∶10供試液。

2.2需氧菌總數(shù)(TAMC)和耐熱菌測定方法取1∶10供試液及連續(xù)5個(gè)10倍稀釋級以TSA傾注法(1mL/皿)測定TAMC，另取1∶10供試液經(jīng)100℃水浴30min處理后，取1∶10供試液及連續(xù)3個(gè)10倍稀釋級，以TSA傾注法(1mL/皿)測定耐熱菌數(shù)。

2.3菌落鑒定對2.2中分離到的典型菌落、疑似菌落，接種于TSA平板上，于55℃培養(yǎng)24h分離純化、革蘭染色鏡撿，并進(jìn)行VITEK2全自動微生物系統(tǒng)的分析、鑒定，以確證污染菌的種屬。

2.4分析方法實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)對數(shù)轉(zhuǎn)換，規(guī)定計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)中TAMC或耐熱菌 >107cfu/g對數(shù)值計(jì)為7.0，TAMC或耐熱菌數(shù)<10cfu/g對數(shù)值計(jì)為0.5，定量結(jié)果采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，對定性結(jié)果歸納分析。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1耐熱菌計(jì)數(shù)耐熱菌>10cfu/g的樣本(97/120)為80.8%，耐熱菌數(shù)>105cfu/g的樣本(8/120)為6.7%，耐熱菌>102cfu/g的樣本(59/120)為49.2%，12種中藥飲片平均染菌量對數(shù)轉(zhuǎn)換結(jié)果見表1，耐熱菌平均染菌量鴉膽子最高，金銀花最低。耐熱菌數(shù)較TAMC平均下降低2.6個(gè)對數(shù)單位。鴉膽子、穿心蓮、海螵蛸、夏枯草等品種耐熱菌檢出率仍較高，在102～103CFU/g。

3.2聚類分析按品種計(jì)算出轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)的各檢測指標(biāo)的均值，然后以品種對指標(biāo)進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖1，TAMC、耐熱菌聚類分析結(jié)果表明花類的金銀花、百合等，根莖類的白術(shù)、姜黃等因其抑菌作用，微生物負(fù)荷相對較低，而其他根莖類、全草類、種子類及動物藥的微生物負(fù)荷較高。從性狀角度看，微生物的種類和數(shù)量的分布具有不均一性，不同品種差異較大。

3.3耐熱菌鑒定結(jié)果參照《中國藥典》2015年版9204微生物鑒定指導(dǎo)原則，結(jié)合部分生化反應(yīng)及VITEK2全自動微生物鑒定系統(tǒng)，對樣本中的疑似菌落進(jìn)行鑒定，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，12種中藥飲片普遍存在耐熱菌污染，以革蘭陰性芽孢桿菌為主，檢出放射根瘤菌等10種耐熱菌，以緩慢葡萄球菌、放射根瘤菌，少動鞘氨醇桿菌較為常見。

注：G+表示革蘭陽性菌，G-表示革蘭陰性菌

3.4風(fēng)險(xiǎn)評估結(jié)果對檢出的10種耐熱菌進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，檢出條件致病菌8種，致病菌和益生菌各1種。其中緩慢葡萄球菌是人類或許多動物不可忽視的致病菌，可引起人類疾病并在醫(yī)院感染中占據(jù)重要地位，尤其對于新生幼兒及存在嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病或長期接受醫(yī)院治療的病人等免疫力低下的人群更容易導(dǎo)致嚴(yán)重的后果[8]。鉛黃腸球菌在臨床上不僅可引起尿路感染、皮膚軟組織感染，還可引起危及生命的腹腔感染、敗血癥、心內(nèi)膜炎和腦膜炎等[9]。放射根瘤菌是促使植物異常增生的一類革蘭陰性需氧桿菌，此菌作為一種條件致病菌主要感染對象均存在導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降的因素，可引起菌血癥等[10]。少動鞘氨醇單胞菌可引起術(shù)后慢性蜂窩組織炎、敗血癥等少動是醫(yī)院感染條件致病菌[11]。巴斯德菌屬可以寄生在家禽或貓、狗等哺乳動物口腔及上呼吸道中的共生菌，可引起呼吸道感染，敗血癥極為少見但是最為嚴(yán)重[12]。莫拉菌屬人體呼吸道常見病原菌，可引起人體上下呼吸道感染[13-14]。泛菌屬亦為條件致病菌，枯草芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，深褐芽孢桿菌同屬枯草芽孢桿菌的近緣種群[15]。解淀粉芽孢桿菌是特殊人群的潛在致病菌[16]。阪崎腸桿菌可以引起新生兒腦膜炎、壞死性結(jié)腸炎和菌血癥, 甚至導(dǎo)致死亡或伴隨嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥、發(fā)育障礙，是常見致病菌[17-18]。地衣芽孢桿菌是我國農(nóng)業(yè)部 2003年 318 號公告批準(zhǔn)使用的飼料級菌株之一，治療下痢和腹瀉效果很好, 是制造微生態(tài)制劑的理想菌株[19]。地衣芽孢桿菌短期內(nèi)治療具有潛在保護(hù)肝硬化患者腸黏膜屏障的作用，從而降低循環(huán)血中的內(nèi)毒素和氨水平[20]。綜上所述，中藥飲片耐熱菌污染狀況不容樂觀，經(jīng)過煎煮、炮制等熱處理方式尚不足以殺滅其中的耐熱菌，使用中藥飲片的人群免疫力低，更傾向于成為致病菌和條件致病菌的易感人群。因此，加強(qiáng)中藥飲片的質(zhì)量控制，制定合理的標(biāo)準(zhǔn)是中藥飲片產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的必由之路。

4討論中藥飲片經(jīng)加熱處理后污染微生物數(shù)量顯著降低，但耐熱菌仍普遍檢出，說明即使經(jīng)過煎煮處理的中藥飲片仍然存在微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)，特別是檢出阪崎腸桿菌等致病菌和條件致病菌，威脅患者用藥安全。益生菌對患者不造成危害，反而有利于平衡菌群，可區(qū)別對待。同時(shí)，中藥飲片從種植、采集、儲存、加工炮制、運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)與土壤、水等環(huán)境和人員之間存在密切聯(lián)系[21]。這些環(huán)節(jié)都可能導(dǎo)致中藥飲片的微生物污染，耐熱菌因其對高溫有特殊的耐受性，煎煮等常規(guī)的炮制手段不足以將其殺滅，因此應(yīng)特別重視。應(yīng)結(jié)合中藥飲片耐熱菌的污染現(xiàn)狀和特點(diǎn)，對飲片用藥安全進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估，制定有針對性的微生物學(xué)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，逐步規(guī)范中藥飲片的生產(chǎn)各環(huán)節(jié)，降低微生物負(fù)荷，降低中藥飲片安全風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)中藥飲片產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

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(收稿2016-02-22；修回2016-03-15)

12 kinds of Chinese herbal medicine thermoduric bacteria contamination investigation and risk assessment

Shaanxi Institute for Food and Drug Control(Xi’an 710065)

Yang XiaoliLi HuiSheng Jinfang

KEY WORDSHerbal pieces for decoctionHeat resistant bacteriaSafety

ABSTRACTObjective: To investigate 12 kinds of Chinese herbal medicine thermoduric bacteria contamination and assess potential risk, in order to provide support for medication safety and microbial quality control. Methods: According to the methods of the determination of total aerobic microbial count (TAMC) of Chinese pharmacopoeia 2015 edition, after 100℃ water bath 30min heat treatment, checked lonicerae japonicre flos etc.12 kinds of Chinese herbal medicine total thermoduric bacteria count (TTBC), and then separated and identified. Results: After heat treatment ,Chinese herbal medicine TTBC compared to TAMC average reduce 2.6 logarithm units. TTBC> 10 cfu/g was 80.84% (97/120),such as Staphylococcus lentus , bacillus licheniformis，rhizobium radiobacter，sphingomonas paucimobilis，enterobacter sakazakii，pantoea agglomerans，pantoea spp a variety of thermoduric bacteria had been checked out. Conclusion: Thermoduric bacteria contamination situation of Chinese herbal medicine was serious, it is necessary to improve the sanitary conditions shall establish reasonable thermoduric bacteria quality control standards which based on the pollution type and quantity ,in order to Chinese herbal medicine medical security.

通訊作者△

【中圖分類號】R282

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.06.045

*陜西省中藥飲片微生物污染狀況調(diào)查及微生物限度標(biāo)準(zhǔn)的研究(S2013SF3711)