尼 悅 （山東省煙臺(tái)市飼料監(jiān)察所　264003）　黨安坤　（山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心）田召芳　王曉玲　（山東省煙臺(tái)市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心）

?

高新技術(shù)疫苗研究的現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)

尼 悅 （山東省煙臺(tái)市飼料監(jiān)察所264003）黨安坤（山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心）
田召芳王曉玲（山東省煙臺(tái)市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心）

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展高新技術(shù)疫苗已成為研究的前沿領(lǐng)域。目前，基因工程苗、合成肽疫苗、重組活載體疫苗、基因工程亞單位疫苗、基因缺失苗、核酸疫苗等許多高新技術(shù)疫苗逐漸應(yīng)用到疫苗生產(chǎn)中。以分子生物學(xué)技術(shù)的基本方法研究開(kāi)發(fā)獸用新型疫苗是21世紀(jì)的主導(dǎo)方向，本文主要對(duì)高新技術(shù)疫苗研制過(guò)程中發(fā)揮的作用及存在問(wèn)題做以綜述。

隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，分子生物學(xué)、分子免疫學(xué)等研究取得進(jìn)展與基因工程技術(shù)的應(yīng)用，疫苗的研究將會(huì)發(fā)生革命性變化，新一代的高新技術(shù)疫苗也將會(huì)大范圍投放到市場(chǎng)。馮濤和馮秀麗（2001）也認(rèn)為高新技術(shù)疫苗將會(huì)很有市場(chǎng)，因?yàn)椴粌H能改善機(jī)體的免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)，而且為有效地預(yù)防和控制新的傳染病提供了新途徑［1］。

1　高新技術(shù)疫苗研究現(xiàn)狀

1.1基因工程疫苗基因工程苗是使用DNA重組生物技術(shù)，把天然的或人工合成的遺傳物質(zhì)定向插入細(xì)菌、酵母菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，使之充分表達(dá)，經(jīng)純化后而制得的疫苗?；蚬こ桃呙缇哂袕V泛的應(yīng)用前景，不僅能夠預(yù)防疾病的發(fā)生而且能夠有效治療一些疾病。例如，向目標(biāo)細(xì)胞中引入正常功能的基因，以糾正或補(bǔ)償基因的缺陷，達(dá)到治療的目的。

1.2重組活載體疫苗重組活載體疫苗是將編碼病原體的有效免疫原的基因插入載體基因組中，接種后疫苗株在體內(nèi)增殖使大量所需的抗原得以表達(dá)。重組活載體疫苗的載體可以選擇細(xì)菌和病毒。病毒載體的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)生外源蛋白接近翻譯后水平的成熟蛋白質(zhì)。細(xì)菌載體的優(yōu)點(diǎn)是能表達(dá)多種不同的外源抗原。所有理想活載體具有安全、有效、免疫應(yīng)答等效用，提高重組載體活疫苗的免疫能力［2、3］。 蔣桃珍和寧宜寶（2000）認(rèn)為活載體疫苗可同時(shí)表達(dá)多種抗原，制成多價(jià)或多聯(lián)疫苗，可一針?lè)蓝嗖。?］。例如以雞痘病毒為載體的雞馬立克氏病+雞新城疫+雞痘三聯(lián)疫苗等，既能降低生產(chǎn)成本又能簡(jiǎn)化免疫程序，還能克服不同病毒弱毒疫苗間產(chǎn)生的干擾現(xiàn)象。

1.3基因工程亞單位疫苗基因工程亞單位疫苗又稱(chēng)生物合成亞單位疫苗或重組亞單位疫苗。陸承平（2001）用基因工程DNA重組技術(shù)將保護(hù)性抗原基因在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)基因產(chǎn)物—蛋白質(zhì)或多肽制成疫苗［5］。該疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比較具有安全性高、純度高，穩(wěn)定性好以及產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)而且SVDV已經(jīng)對(duì)引起中和抗體產(chǎn)生的衣殼蛋白VP1、VP2進(jìn)行了表達(dá)（周鵬程等，1998；周永國(guó)，2003），可望將來(lái)不就問(wèn)世［5］。

1.4基因缺失疫苗基因缺失疫苗是指缺失主要毒力基因（TK）和非必須糖蛋白基因（gG和gE），使臨床上實(shí)現(xiàn)區(qū)分自然感染野毒和疫苗免疫成為可能。基因工程缺失疫苗是利用基因工程技術(shù)在基因組中插入活缺失一段序列致使某些基因不能夠表達(dá)，從而使致弱病毒同時(shí)又保持其較強(qiáng)的免疫原性，而其中缺失的主要是其毒力基因胸苷激酶（TK），蛋白激酶（PK），核酸還原酶（RR）和脫氧尿苷三磷酸激酶（dUTPase）以及一些具有免疫原性的糖蛋白gG、gE、gC、gD等。目前據(jù)此已構(gòu)建了許多種單基因、雙基因及多基因缺失疫苗。

1.5核酸疫苗核酸疫苗是指將含有編碼的蛋白基因序列的質(zhì)粒載體，經(jīng)肌肉注射或微彈轟擊等方法將外源基因注入宿主細(xì)胞，從而使外源基因在肌肉細(xì)胞內(nèi)表達(dá)、加工為成熟多肽，成熟多肽與宿主MHCⅠ和MHCⅡ類(lèi)結(jié)合，再將抗原決定簇提呈給免疫相關(guān)細(xì)胞，因此，核酸疫苗可產(chǎn)生廣譜的免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體、輔助性T細(xì)胞（Th）、細(xì)胞毒T細(xì)胞（Tc）。核酸疫苗在構(gòu)建時(shí)可根據(jù)需要選擇Th 1或Th 2應(yīng)答。Th 1亞群分泌的細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生IgG2a和促進(jìn)產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，Th2亞群所分泌的細(xì)胞因子主要促進(jìn)產(chǎn)生IgG，誘導(dǎo)體液免疫。Raz等（1994）將含NP基因的質(zhì)粒皮下接種小鼠后，采集接種部位組織免疫組化法細(xì)胞染色，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞有角質(zhì)化細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞，說(shuō)明這些細(xì)胞在免疫應(yīng)答中的作用。在肌肉細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)樹(shù)突狀細(xì)胞，但尚無(wú)其抗原提呈的證據(jù)［7］。

1.6合成肽疫苗合成肽疫苗是一種僅含免疫決定簇組分的小肽，即用人工方法按天然蛋白質(zhì)的氨基酸順序合成保護(hù)性短肽，與載體連接后加佐劑所制成的疫苗，是最為理想的安全新型疫苗。合成肽疫苗分子是由多個(gè)B細(xì)胞抗原表位和T細(xì)胞抗原表位共同組成的，大多需與一個(gè)載體骨架分子相耦聯(lián)。合成肽疫苗的研究最早始于口蹄疫病毒（FMDV）合成肽疫苗，主要集中在FMDV的單獨(dú)B細(xì)胞抗原表位（VPI環(huán)）或與T細(xì)胞抗原表位結(jié)合而制備的合成肽疫苗研究。雖然取得了一定的進(jìn)展，但仍未獲得一種具有理想保護(hù)作用的合成肽疫苗。姜平（2003）報(bào)導(dǎo)，其特點(diǎn)是純度高、穩(wěn)定。在動(dòng)物病原方面，研究較為成熟的是合成口蹄疫病毒（FMDV）VPl的第141～160位氨基酸片段，將其連接在不同輔助T細(xì)胞（Th）表位上，在豬體內(nèi)有較好的保護(hù)效果［8］。這種合成肽是利用B細(xì)胞與豬體能識(shí)別的Th細(xì)胞表位相結(jié)合的原理合成的可以大大提高其免疫原性，并不需偶聯(lián)到載體蛋白即可產(chǎn)生中和抗體。邢釗和張?。?000）報(bào)導(dǎo)，應(yīng)用同一原理有可能發(fā)展合成其他多肽疫苗，也可用人工合成基因（含B細(xì)胞，Th細(xì)胞和Tc細(xì)胞表位）來(lái)表達(dá)比天然抗原更強(qiáng)的人工抗原，這在腫瘤疫苗和寄生蟲(chóng)疫苗的研究開(kāi)發(fā)中可能有特別重要的意義［9］。

1.7抗獨(dú)特型抗體疫苗抗獨(dú)特型抗體疫苗是20世紀(jì)70年代后期發(fā)展起來(lái)的一種新型免疫生物制劑。該疫苗是以抗病原微生物的抗體（Ab1）作為抗原來(lái)免疫動(dòng)物，抗體的獨(dú)特型決定簇可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體（簡(jiǎn)稱(chēng)抗Id抗體，或Ab2），抗獨(dú)特型抗體是始動(dòng)抗原的內(nèi)影像，可刺激機(jī)體產(chǎn)生對(duì)始動(dòng)抗原的免疫應(yīng)答，從而產(chǎn)生保護(hù)作用。根據(jù)Schick等人的報(bào)道，不僅β型抗獨(dú)特型抗體可以替代抗原有效的激發(fā)動(dòng)物的免疫反應(yīng)，α型抗獨(dú)特型抗體也有相似的作用［10］。而李保全，彭軍等對(duì)抗H9亞型AIV獨(dú)特型的單克隆抗體和多克隆抗體疫苗進(jìn)行了研究，為現(xiàn)有的防治低致病性禽流感的方法作了補(bǔ)充，特別是為防制危害嚴(yán)重的高致病性禽流感提供參考［11］。

1.8病毒—抗體復(fù)合物疫苗病毒-抗體復(fù)合物疫苗又稱(chēng)免疫復(fù)合物疫苗，是一種新興疫苗［12］。由特異性高免血清（抗體）按照恰當(dāng)?shù)谋壤c抗體（如傳染性病毒）混合而成。目前此項(xiàng)技術(shù)已成功用于雞傳染性法氏囊病，新城疫的免疫同時(shí)對(duì)呼腸孤病毒也進(jìn)行了類(lèi)似實(shí)驗(yàn)［13］。

2　高新技術(shù)疫苗有待解決的問(wèn)題

高新技術(shù)在疫苗生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，顯示出了新技術(shù)疫苗的巨大潛力和應(yīng)用前景。但是由于其發(fā)展時(shí)間有限所以仍存在很多的不足，想要真正應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)當(dāng)中需要高度敏感的PCR技術(shù)等確證所注射的DNA疫苗的安全性，還需要長(zhǎng)期的臨床試驗(yàn)以明確其毒副作用和免疫效果［14］。

2.1安全性問(wèn)題高新技術(shù)疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比同樣存在安全性問(wèn)題。雖然目前也未發(fā)現(xiàn)插入突變的證據(jù)，但不能完全排除少數(shù)質(zhì)粒DNA插入到染色體上引起突變的可能性［15］。一旦整合到基因組中就可能使細(xì)胞癌基因激活或抑癌基因失活。

2.2保護(hù)效率問(wèn)題目前為止，基因疫苗的免疫效率很難達(dá)到百分之百的免疫保護(hù)，且存在明顯的種屬個(gè)體差異，這可能與不同動(dòng)物細(xì)胞需要不同啟動(dòng)子、抗原基因、給藥方法途徑、給藥量有關(guān)［17］。

2.3免疫耐受問(wèn)題基因疫苗體內(nèi)持續(xù)表達(dá)產(chǎn)生抗原蛋白，可能打破機(jī)體本身的免疫平衡，引發(fā)免疫耐受。

3　高新技術(shù)疫苗未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)

（1）高新技術(shù)疫苗作為第3代疫苗，尤其在人類(lèi)尚未攻克的疑難病癥的預(yù)防和治療方面顯示出了良好的應(yīng)用前景。大量的臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)動(dòng)物并沒(méi)有出現(xiàn)令人擔(dān)憂(yōu)的不良癥狀。目前，高新技術(shù)疫苗面臨的主要問(wèn)題是有時(shí)其引發(fā)的體液和細(xì)胞免疫達(dá)不到理想的狀態(tài)和人們對(duì)其安全性的擔(dān)憂(yōu)［18］。因此在提高高新技術(shù)疫苗免疫效果的同時(shí)還需運(yùn)用高效靈敏的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行長(zhǎng)期的安全性評(píng)價(jià)。（2）由于傳統(tǒng)疫苗的法規(guī)并不完全適用于高新技術(shù)疫苗，涉及到高新技術(shù)疫苗安全性的諸多因素還處于研究探索階段，從疫苗設(shè)計(jì)、工程菌的選擇、生產(chǎn)工藝、質(zhì)量檢驗(yàn)、使用劑量、免疫途徑到免疫程序都沒(méi)有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)和成型的法規(guī)［19］。此外，在高新技術(shù)核酸疫苗設(shè)計(jì)上可運(yùn)用生物信息學(xué)合成安全有效的真核表達(dá)質(zhì)粒骨架；選用無(wú)抗生素抗性的選擇標(biāo)簽，如營(yíng)養(yǎng)缺陷型和平衡致死系統(tǒng)選擇標(biāo)志既可保證質(zhì)粒的穩(wěn)定表達(dá)，又可消除因抗性基因引發(fā)的疫苗安全性問(wèn)題；盡可能選擇宿主范圍窄的質(zhì)粒復(fù)制功能區(qū)和縮小質(zhì)粒也是增加安全性的方法之一，還可采取生物遏制的方法在保證質(zhì)粒穩(wěn)定復(fù)制的情況下抑制工程菌的過(guò)量增殖，以減少細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)機(jī)體的傷害；或是選用食品級(jí)的工程菌如乳酸乳球菌來(lái)增加疫苗的安全性［20］。尤其要在適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型中進(jìn)行細(xì)致的臨床前研究，積累大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為高新技術(shù)疫苗法規(guī)的早日成型奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

［1］ 馮濤， 馮秀麗， 刁有祥. 抗病毒高新技術(shù)研究進(jìn)展［J］. 遼寧畜牧獸醫(yī)， 2001， 1∶30-33.

［2］ 段鴻俊. 活病毒及細(xì)菌載體用于疫苗之潛力［J］. 微生物學(xué)免疫進(jìn)展， 1991， 20（4）∶ 45-49.

［3］ 錢(qián)健飛. 禽用重組活載體疫苗研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)獸醫(yī)雜志， 1994，20（8）：46-47.

［4］ 蔣桃珍， 寧宜寶. 21世紀(jì)我國(guó)獸醫(yī)生物制品展望［J］. 中國(guó)獸醫(yī)雜志，2000， 26（8）∶ 3-4.

［5］ 陸承平. 獸醫(yī)微生物學(xué)第3版［M］. 北京∶中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， ， 2001，192-193.

［6］ 周鵬程， 謝慶閣.豬水泡病病毒的分子生物學(xué)研究現(xiàn)狀［J］. 中國(guó)獸醫(yī)科技， 1998， 28（3）∶ 18-21.

［7］ 14Raz E. Carson DA. Park er L， et al. Pro. Natl. Acad. Sci. USA. 1994， 91∶ 9519-9523

［8］ 姜平.獸醫(yī)生物制品學(xué)（第2版）［M］. 北京∶ 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 2003.

［9］ 邢釗， 張健， 范琳. 獸醫(yī)生物制品實(shí)用技術(shù)［M］. 北京∶ 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社， 2000.

［10］ SchickM R. Dreesman.G R. Kenn edy R C. induction of an antih epatitis B surface antigen response in mice by noninternal image（Ab2a）anti-idiotypic antibodies［J］. J Immunol.1987. 138∶ 3419-3425.

［11］ 李寶全， 彭軍， 牛鐘相等. 抗H9亞型禽流感病毒獨(dú)特型抗體的制備與應(yīng)用［J］. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2006（6）∶ 603-605.

［12］ 張建遠(yuǎn)， 王紅寧， 陳錦銳等. 豬圓環(huán)病毒核酸疫苗pcDNA-PCVORP2-ISS的構(gòu)建及分子佐劑聯(lián)合免疫研究［J］. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2009，12（29）∶ 1511-1515.

［13］ Mason H Slam DM K. Amlzen CJ. Expression of hepatitis B surface antigen in transgenie plants［J］. Proc. Natl. Acad.Sci. U. S. A. 1992（89）∶11745-111749.

［14］ 胡建和， 劉湘濤， 張彥明等. 豬瘟病毒兔化弱毒株全長(zhǎng)cDNA克隆的感染性鑒定［J］. 病毒學(xué)報(bào)， 2004， 20（2）∶ 143-147.

［15］ Inoue T， Suzukiichi T， Sekiguchi S， et al. The complete nucleotide sequence of swine vesicular disease virus［J］. J Gen Virol， 1989， 70（Pt4）∶919-934.

［16］ 謝勇， 龔燕鋒， 周南進(jìn)等. 以殼聚糖為佐劑的Hp疫苗誘導(dǎo)的體液免疫效果的研究［J］. 生物技術(shù)， 2006， 16（2）∶ 68-71.

［17］ 王學(xué)鵬， 劉悅竹， 陳蕾等. 雞痘蜂膠佐劑滅活疫苗的研制［J］. 中國(guó)獸醫(yī)雜志， 2005， 41（4）∶ 52-53.

［18］ 何啟蓋. 豬偽狂犬病基因缺失疫苗的研究［D］. 武漢∶ 華中農(nóng)業(yè)大學(xué). 2000.

［19］ 薛景山， 趙啟祖， 謝慶閣等. 豬水泡病病毒中和性抗原多肽的研究［M］. 第一屆生命科學(xué)青年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集摘要. 北京∶ 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社， 1993. 140-141.

［20］ 吳健蘭. 新疫苗進(jìn)展.國(guó)外醫(yī)學(xué)［J］. 預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊(cè). 2003， 26（3）∶ 97-99.

中圖分類(lèi)號(hào)：S859.79+7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-1733（2016）06-0061-03

收稿日期：（2016-04-25）