葉崇軍 耿 齊 李 冰 陳復生

(1安徽省農業(yè)科學院蠶桑研究所，安徽合肥 230061; 2南京蘇豪絲綢文化發(fā)展有限公司，江蘇南京 210005)

綠色絲膠蛋白質功能特性研究

葉崇軍1耿 齊2李 冰1陳復生1

(1安徽省農業(yè)科學院蠶桑研究所，安徽合肥 230061;2南京蘇豪絲綢文化發(fā)展有限公司，江蘇南京 210005)

以選配的純絲膠蠶品種組合(綠S、白S)生產(chǎn)的全天然綠色純絲膠蠶繭、白色純絲膠蠶繭以及現(xiàn)行蠶品種菁松×皓月(JS)生產(chǎn)的白色普通蠶繭、遠緣雜交的蠶品種生產(chǎn)的黃色普通蠶繭、遠緣雜交的蠶品種生產(chǎn)的白色普通蠶繭為材料，對綠色絲膠蛋白質的部分功能特性進行了研究。試驗結果表明，綠S蠶繭的絲膠蛋白質抗氧化能力最強;在絲膠蛋白濃度為1 mg/mL時，綠S蠶繭的絲膠蛋白質比JS蠶繭的絲膠蛋白質對大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌、米曲霉、黑曲霉的抑菌圈直徑分別大2.5、3.1、1.5、1.7、2.3、1.5 mm;在315～500 nm的波域內，綠S蠶繭的絲膠蛋白質仍然具有較強的紫外吸收能力，表明其具有更為優(yōu)異的抗氧化、抗菌、紫外線遮蔽等功能特性，該結果為綠色絲膠蛋白在化妝品、保健品、醫(yī)藥等領域的創(chuàng)新產(chǎn)品研發(fā)提供了依據(jù)。

絲膠蛋白質;純絲膠蠶繭;抗氧化性;抗菌性能;紫外吸收光譜;功能特性

絲膠蛋白質為水溶性球狀蛋白質，是化妝、保健、醫(yī)藥等領域的創(chuàng)新產(chǎn)品研發(fā)的優(yōu)良材料，其利用的價值在于具有諸多獨特的、有用的功能特性［1］。

蠶繭顏色由桑葉中的胡蘿卜色素和類黃酮色素決定［2］。桑葉中含有的類黃酮色素在蠶體內透過腸壁并運輸?shù)侥c腔細胞、體液、絲腺細胞，在絲腺中分泌合成有色絲膠蛋白質，形成彩色蠶繭，家蠶繭絲的色澤多由絲膠蛋白質的色澤決定［3］。我們以選配的純絲膠蠶品種組合所生產(chǎn)的天然綠色純絲膠蠶繭為材料，對有色絲膠蛋白質的部分功能特性開展研究，旨在為應用有色絲膠蛋白質在化妝、保健、醫(yī)藥等領域的創(chuàng)新產(chǎn)品研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗儀器 LGJ－12型冷凍真空干燥儀，北京松源華興科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品;氨基酸自動分析檢測儀，德國SYKAM公司產(chǎn)品;UV－1201型紫外熒光光度計，北京北分瑞利分析儀器公司產(chǎn)品;Re－52型旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品;SYQ· STX－280型手提式高壓蒸汽消毒鍋，杭州華創(chuàng)科學儀器有限公司產(chǎn)品;HG101－2型電熱鼓風干燥箱，蘇州貫覺電熱設備有限公司產(chǎn)品;PYX－DHS－40× 50型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，杭州匯爾儀器有限公司產(chǎn)品;PB602N型電子天平，上海菁海儀器有限公司產(chǎn)品;ZH－WY－111B型恒溫培養(yǎng)搖床，金壇市精達儀器制造有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 試驗試劑 鄰苯三酚、水楊酸乙醇，均為分析純(AR)，國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品;風味蛋白酶，分析純(AR)，上海生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 供試蠶繭 從日本引進的純絲膠種質資源與綠色蠶繭蠶品種組配的品種組合(綠S)生產(chǎn)的綠色純絲膠蠶繭，從日本引進的純絲膠種質資源與白色蠶繭蠶品種組配的品種組合(白S)生產(chǎn)的白色純絲膠蠶繭，現(xiàn)行生產(chǎn)用蠶品種菁松×皓月(JS)生產(chǎn)的白色普通蠶繭，遠緣雜交的蠶品種生產(chǎn)的黃色普通蠶繭，遠緣雜交的蠶品種生產(chǎn)的白色普通蠶繭(遠緣雜交普通黃色繭、遠緣雜交普通白色繭是以安徽省農業(yè)科學院蠶桑研究所桑園野蠶與家蠶品種“若玉”雜交所選育品系生產(chǎn)的蠶繭)，均由安徽省農業(yè)科學院蠶桑研究所提供。

1.1.4 供試菌種 大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌、米曲霉、黑曲霉均由上海大學生命科學學院食品科學系提供。

1.1.5 供試培養(yǎng)基 大腸桿菌培養(yǎng)基、枯草桿菌培養(yǎng)基、金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基、酵母菌培養(yǎng)基、米曲霉培養(yǎng)基、黑曲霉培養(yǎng)基，均為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白樣品的制備將綠S蠶繭和白S蠶繭用手撕剝離繭殼倒出蠶蛹，JS蠶繭、遠緣雜交普通黃色繭、遠緣雜交普通白色繭用削繭刀削繭倒出蠶蛹，分別去除粘附在5種蠶繭上的贓物，然后用30℃水分別洗滌倒出蠶蛹后的5種蠶繭繭殼，洗滌后的5種蠶繭繭殼分別于60℃烘干5 min，然后分別剪成2 mm×2 mm的蠶繭繭殼碎片。分別稱取5 g綠S蠶繭、白S蠶繭和JS蠶繭、遠緣雜交普通黃色蠶繭和遠緣雜交普通白色蠶繭的繭殼碎片，分別放入500 mL容量瓶中，分別加入蒸餾水250 mL，放入SYQ·STX－280型手提式高壓蒸汽消毒鍋中在125℃高壓下蒸煮2.5 h，待5種繭殼的蒸煮液完全冷卻后取出分別用紗布過濾，過濾出的生絲再用30℃的溫水洗滌3遍，將蠶絲脫膠液和對應的洗滌液合并，然后用濾紙抽濾，分別將5種絲膠溶液在80℃旋轉蒸發(fā)至約100 mL，所得絲膠液體在冷凍干燥機的冷凍盤中自然冷卻至室溫后再轉入－40℃條件下冷凍2 h，然后放入冷凍干燥儀，在樣品溫度－33℃、1 Pa條件下干燥。獲得綠S純絲膠蠶繭絲膠蛋白粉、白S純絲膠蠶繭絲膠蛋白粉、JS普通蠶繭絲膠蛋白粉、遠緣雜交普通黃色蠶繭絲膠蛋白粉及遠緣雜交普通白色蠶繭絲膠蛋白粉樣品，在4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白質含量測定與氨基酸組成分析 按照文獻［4］的凱式定氮方法進行。以1.2.1獲得的綠S純絲膠蠶繭絲膠蛋白粉、白S純絲膠蠶繭絲膠蛋白粉及JS普通蠶繭絲膠蛋白粉，操作參照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質的測定方法》［5］進行。測定結果根據(jù)下面的公式［5］計算出蛋白質含量，用Microsoft Excel軟件制作柱式圖。

［式中X為蛋白質含量(%)，V1為樣品消耗硫酸標準溶液或HCL標準溶液的體積(mL)，V2為試劑空白消耗硫酸標準溶液或HCL標準溶液的體積(mL)，N為硫酸標準溶液或HCL標準溶液的摩爾質量濃度(mol/L)，0.014為 0.5 mol/L硫酸或1 mol/L HCL標準溶液1 mL相當于氮的克數(shù)，m為樣品的質量(g)，F(xiàn)為氮換算為蛋白質的系數(shù)。］

表1 不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白粉的蛋白質含量

1.2.3 不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白質抗氧化性的測定 利用吸光值測定，計算羥基自由基、超氧自由基的清除能力，操作按照陳復生等［6］的方法進行。在風味酶濃度4 mg/mL、pH7.0、反應溫度60℃、底物濃度10 mg/mL、反應時間120 min的條件下水解絲膠蛋白質，將絲膠蛋白質水解液在波長536 nm條件下檢測吸光度，所得結果根據(jù)下面的公式計算出羥基自由基的去除率;再將絲膠蛋白質水解液在100℃條件下滅活10 min，將滅活后的絲膠蛋白質水解液在波長536 nm條件下檢測吸光度，所得結果根據(jù)下面的公式計算出超氧自由基去除率。

羥基自由基(超氧自由基)去除率(%)=［A3－(A1－A2)］/A3×100［式中A1為對照不加樣品的吸光度;A2為某濃度時的吸光度;A3為無顯色劑時的該濃度的吸光度本底值。］

1.2.4 不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白質抗菌性能的測定 操作按照李冰等［7］的方法進行，將定性濾紙于HG101－2型電熱鼓風干燥箱中在80℃下干熱滅菌4 h后，分別將滅菌后的濾紙片浸入蛋白質含量為1、10、100 mg/mL濃度的3種絲膠蛋白質溶液中泡30 min后取出晾干備用。分別將大腸桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌、酵母菌、米曲霉、黑曲霉菌菌種在超凈工作臺里無菌操作接種到盛有對應的培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(或試管)中，接種好后大腸桿菌在37℃培養(yǎng)6 h、枯草桿菌在37℃培養(yǎng)4 h、金黃色葡萄球菌在37℃培養(yǎng)24 h、酵母菌在25℃培養(yǎng)48 h、米曲霉在30℃培養(yǎng)72 h、黑曲霉在37℃培養(yǎng)5 h。用接種環(huán)將預先接種培養(yǎng)好的各種菌種的菌落輕刮下來置于盛有10 mL雙蒸水的離心管中，將盛有各種菌種的菌落刮落液置旋渦混合器中充分混勻。用200 μL規(guī)格的移液槍分別吸取0.1 mL各種菌懸液均勻涂布在預先澆制好的對應的平板培養(yǎng)基上，靜置5 min左右。將濾紙片按絲膠溶液濃度成正三角形放在涂布有各種菌懸液的各平板培養(yǎng)基表面，平板培養(yǎng)基中間以貼上浸有相應水溶液浸泡過的濾紙片作為空白對照，細菌在36℃左右，恒溫培養(yǎng)24 h，真菌在28℃左右恒溫培養(yǎng)72 h，測量抑菌圈直徑。

1.2.5 不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白質的紫外吸收光譜分析 操作按照陳復生［8］的方法進行。分別用雙蒸水將不同樣本的絲膠蛋白質配制成5 mg/mL的絲膠蛋白質溶液，室溫下磁力棒低速攪拌1 h，使溶液分散均勻，將不同樣本的絲膠蛋白質溶液(5 mg/mL)置于190～500 nm波段的紫外分光光度計下測定吸收光譜，根據(jù)吸收光譜曲線，判斷絲膠蛋白紫外吸收光譜。

2 結果與分析

2.1 不同品種蠶繭繭殼中絲膠蛋白質含量與氨基酸組成分析

由圖1可見，絲膠蛋白質含量以白S純絲膠蠶繭繭殼的最高，達到92.25%，其次是綠S純絲膠蠶繭繭殼，達到91.27%，如加上溫水洗滌蠶繭繭殼的絲膠損失部分，純絲膠繭繭殼的絲膠蛋白質含量將更高。而現(xiàn)行家蠶品種JS蠶繭繭殼的絲膠蛋白質含量僅為25.03%。表明純絲膠蠶繭蠶品種綠S和白S生產(chǎn)的為全天然純絲膠蛋白質蠶繭。

圖1 不同品種蠶繭繭殼的絲膠蛋白質含量

由表2知，3種蠶繭繭殼的絲膠蛋白質的氨基酸成分中絲氨酸(Ser)的含量分別為綠S 36.865 0%、白S 34.688 7%、JS 30.939 8%，綠 S達到36%以上;甘氨酸(Gly)的含量分別為綠S 15.021 0%、白S 15.665 5%、JS 14.574 0%，綠S達到15%以上;絲氨酸(Ser)和甘氨酸(Gly)的合計含量分別為綠 S 51.886 0%、白S 50.354 2%、JS 45.513 8%，綠S絲氨酸(Ser)和甘氨酸(Gly)的合計含量占到絲膠蛋白質的氨基酸組成的51%以上;絲氨酸(Ser)和甘氨酸(Gly)的含量以綠S含量最高。

表2 不同品種蠶繭繭殼的絲膠蛋白質的氨基酸組成 %

2.2 不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白質的抗氧化活性分析

圖2 不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白質清除羥基自由基的效果

由圖2－3可見，天然純絲膠蠶繭的絲膠蛋白質清除羥基自由基和清除超氧自由基的能力遠遠強于普通蠶繭的絲膠蛋白質;不同顏色蠶繭的絲膠蛋白質清除羥基自由基和清除超氧自由基能力的順序依次為綠S＞白S＞遠緣雜交普通黃色繭＞遠緣雜交普通白色繭＞JS;綠S的絲膠蛋白質抗氧化能力最強。

圖3 不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白質清除超氧自由基的效果

2.3 不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白質的紫外吸收光譜

由不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白質的紫外吸收光譜(圖4)可見，在絲膠蛋白質濃度為0.5%時，綠S、白S、JS在190～252 nm均出現(xiàn)2個吸收峰，都具有很強的吸收能力。但在其后白S、JS蛋白質的紫外吸收趨勢迅速降低，而綠S蛋白質的紫外吸收趨勢減緩，尤其在315～500 nm的波域內，綠S蛋白質的紫外吸收仍然具有較強的能力。

圖4 不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白質的紫外吸收光譜

2.4 不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白質的抗菌能力

由表3和圖5可看出，不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白質對大腸桿菌、曲霉菌、酵母菌均具有較強的抗菌能力，抗菌能力由強到弱的順序為綠S＞白S＞JS。

表3 不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白質對供試菌的抑菌效果

圖5 不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白質的抗菌能力

3 小結與討論

天然絲膠蛋白質作為化妝、保健、醫(yī)藥創(chuàng)新產(chǎn)品的優(yōu)質原料，已引起人們的廣泛關注，其利用價值在于其具有諸多獨特的、有用的功能特性［1］。

有色繭絲蛋白質的生成是蠶食下的桑葉中含有的胡蘿卜色素和類黃酮色素在蠶體內由一系列的遺傳基因控制，透過并運輸?shù)侥c腔細胞、體液、絲腺細胞，在絲腺中合成和分泌有色絲膠蛋白質，形成有色蠶繭［2］。有色繭絲的色澤多集中于蠶繭外層的絲膠上。

本試驗以品種組合生產(chǎn)的天然純絲膠蠶繭溶解提取的絲膠蛋白質與普通蠶繭溶解提取的絲膠蛋白質為材料，對其部分主要功能特性進行了試驗比較，純絲膠蠶繭絲膠溶解提取的絲膠蛋白質顯示出在含量、抗氧化、防紫外線、抗菌等方面具有優(yōu)良功能特性，而綠色純絲膠蠶繭的絲膠蛋白質的這些功能特性更為優(yōu)秀。試驗結果表明，綠色純絲膠品種組合生產(chǎn)的天然、純粹、無變性蠶繭可直接溶解提取的絲膠蛋白質，更具廣泛的利用價值，作為原料在化妝品、保健品、醫(yī)藥等領域的產(chǎn)品創(chuàng)新具有廣泛的應用前景。本試驗中凱式定氮方法調查的不同蠶繭的絲膠蛋白質含量，純絲膠蠶繭繭殼遠遠高于普通蠶繭繭殼，綠色純絲膠蠶繭繭殼稍低于白色純絲膠蠶繭繭殼;絲膠蛋白質的氨基酸成分中絲氨酸(Ser)和甘氨酸(Gly)的含量以綠S含量最高。推測蠶繭的絲膠蛋白質含量及絲膠蛋白質氨基酸組成對其功能特性有一定的影響，原因有待進一步的深入研究。

本試驗只對部分有色蠶繭絲膠蛋白質的功能特性作了探討，其他相當多的功能特性如化妝品的乳化性、濕潤性、吸放濕性、粘合和分散性等，保健食品的渾濁度、色澤、風味、爽滑感等，與醫(yī)藥歸納為物質的結合等功能特性有待于進一步的深入研究。

［1］董雪，盛家鏞，邢鐵玲，等.絲膠蛋白的研究與應用綜述［J］.絲綢，2011，48(12):16－21.

［2］作道隆，土田耕三.繭の色はどのようにして彩られるか［J］.日本生化學，2009，81(1):27－31.

［3］飯?zhí)铯韦曜樱Q井裕治，田中幸夫，等.実用的な緑繭蠶品種の育成［J］.蠶糸會研報，2008(55):57－63.

［4］葉崇軍，盛玉奇，魏兆軍，等.全天然絲膠蠶品種的絲膠蛋白質含量與氨基酸組成［J］.食品科技，2010，35(8):146－149.

［5］中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.食品安全國家標準食品中蛋白質的測定:GB/T 5009.5—2010［S］.北京:中華人民共和國衛(wèi)生部，2010:1－7.

［6］陳復生.全絲膠蠶品種絲膠蛋白酶的抗氧化能力［J］.中國化妝品，2010(2):36－41.

［7］李冰，葉崇軍，陳復生.全天然絲膠抗菌性研究［C］//中國蠶學會，云南省蠶學會，云南省農業(yè)科學院蠶桑蜜蜂研究所.中國蠶學會第八屆青年學術研討會論文集，昆明:［出版者不詳］，2014:283－285.

［8］陳復生，葉崇軍，魏兆軍.蠶絲天然絲膠蛋白的紫外吸收能力研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013，25(3):388－390.

S881.3

A

1007－0982(2016)04－0050－05

10.16839/j.cnki.zgcy.2016.04.012

2016－06－29;接受日期:2016－09－30

安徽省自然科學基金項目(編號1608085MC75);現(xiàn)代農業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項(編號 CARS－22);安徽省農業(yè)科學院種子工程項目(編號15B0605)。

第1作者信息:葉崇軍(1983—)，男，安徽六安，碩士，助理研究員。Tel:0551－2852900，E-mail:yechj1983@163.com

信息:陳復生(1958—)，男，安徽全椒，博士，研究員。Tel:0551－2852900，E-mail:chenfs58@163.com