周 瑩, 孫梨宗, 劉志紅, 臺培東, 李玥瑩

(1. 沈陽師范大學 生命科學學院, 沈陽 110034;2. 中國科學院 沈陽應用生態(tài)研究所, 沈陽 110034)

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氨氮對斑馬魚3種酶活性和基因表達的影響

周 瑩1, 孫梨宗2, 劉志紅2, 臺培東2, 李玥瑩1

(1. 沈陽師范大學 生命科學學院, 沈陽 110034;2. 中國科學院 沈陽應用生態(tài)研究所, 沈陽 110034)

目的:從酶活性測定和酶基因表達兩方面探討氨氮對斑馬魚的毒性效應,為快速準確評價氨氮水環(huán)境質(zhì)量提供理論依據(jù)。方法:以斑馬魚為受試生物,研究氨氮對其毒性效應,分別在第3 d和第14 d測定斑馬魚肝臟組織SOD和AChE酶活性變化,進一步運用半定量RT-PCR測定AChE、SOD以及CYP450基因相對轉(zhuǎn)錄量。結(jié)論:氨氮對斑馬魚96 h-LC50為86.36 mg·L-1;SOD和AChE酶活性在暴露3 d時變化均不顯著,暴露14 d時前者表現(xiàn)為低濃度促進高濃度抑制的趨勢,后者始終處于抑制狀態(tài),且具明顯的劑量-效應關(guān)系;與酶活性測定相比,相應基因(SOD、CYP450和AChE)在轉(zhuǎn)錄水平上的變化出現(xiàn)更早,更靈敏,用于氨氮污染檢測更具有時效性。

氨氮; 斑馬魚; SOD; AChE; CYP450

0 引 言

《2014年中國環(huán)境狀況公報》顯示,我國廢水中氨氮排放總量達238.5萬噸,被列為廢水第2大污染物。水中氨氮嚴重超標導致水質(zhì)惡化,對魚類等水生生物造成損傷[1],甚至還會給人體健康帶來威脅[2]。

生物體在面對環(huán)境污染物刺激時會做出相應調(diào)控,這種調(diào)控首先體現(xiàn)在核酸水平。近年來,國內(nèi)外學者就氨氮對魚類的影響進行了大量的報道[3-5],然這些研究主要集中在生長和成活等一般綜合性指標,對短時間低濃度氨氮暴露下魚體內(nèi)一些重要酶的活性,尤其是在轉(zhuǎn)錄水平上的研究仍較少[6]。

斑馬魚(Danio rerio),鯉科短魚丹屬淡水魚,作為一種模式生物,其在基因、胚胎等研究領(lǐng)域得到了廣泛的應用[7-8]。本研究以斑馬魚為實驗動物,研究不同濃度氨氮暴露下斑馬魚肝臟組織SOD和AChE酶活性的變化,進一步運用半定量RT-PCR測定AChE、SOD以及CYP450基因的相對轉(zhuǎn)錄量,探討氨氮對斑馬魚的毒性效應,為制定氨氮水環(huán)境監(jiān)測標準提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

斑馬魚(Danio rerio)購于上海佳譽水族館,雌雄兼有,平均體長(2.4±0.18)cm,平均體重(0.18±0.03)g,實驗前在實驗室馴養(yǎng)7 d,采用曝氣自來水,水溫(25±2)℃,水質(zhì)條件:pH=7.5±0.3,溶解氧高于7.0 mg·L-1,每日光照12～14 h,早晚定時投喂飼料,及時處理排泄物,自然死亡率<3%。實驗前24 h停止喂食,挑選強壯個體用于毒性實驗。

氨氮儲備液:稱取38.19 g氯化銨(分析純)用曝氣純凈水稀釋至1 L,制成10 g·L-1的儲備液。

1.2 實驗方法

1.2.1 急性毒性實驗

試驗方法參照國標GB/T 13267—91。

1.2.2 慢性毒性實驗

以96 h-LC50為基準,設(shè)置0.1×LC50、0.4×LC50和0.8×LC50這3個處理組濃度,每個濃度3個平行,并設(shè)置空白對照(曝氣純凈水),進行慢性毒性實驗。在暴露初期(第3 d)和暴露后期(第14 d)分別從每個處理中取10條活魚冰凍處死、解剖,取其肝臟組織,提取RNA,通過RT-PCR后半定量測定。

1.2.3 超氧化物歧化酶、乙酰膽堿酯酶活性測定

蘇州科銘生物技術(shù)有限公司超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)(GY1)和乙酰膽堿酯酶(Acetylcholine Esterase, AChE)(KW1)試劑盒。

1.2.4 半定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應

使用RNA提取試劑盒(BS88133,生工生物)進行RNA提取,蛋白核酸測定儀(Eppendorf)測定RNA的濃度和純度,cDNA合成試劑盒(6110A,TaKaRa)合成cDNA。PCR擴增所用的基因序列來源于GeneBank,引物序列如下:β-actin(內(nèi)參基因):F-cctgatgaagatcctgaccg,R-atccagacggagtatttgcg;SOD:F-ggccttactccaggaaaac,R-gagatgtaattgtcagcgg;AChE:F-ttgctcttgcccactgtgctacta,R-cttcactcatcactctgttggggttc;CYP450:F-cgaaaatcccagacgggctac,R-ccctcattactgatgtgctcctct。PCR反應程序:94 ℃變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,32個循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物電泳檢測,Image Lab軟件分析條帶熒光強度。

1.3 統(tǒng)計分析

急性毒性數(shù)據(jù)采用Probit法分析,慢性毒性數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以上分析由統(tǒng)計軟件SPSS19.0完成(各圖中*:p<0.05、**:p<0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性實驗

通過急性毒性實驗得到氨氮對斑馬魚24,48,72和96 h的LC50分別為126.22、104.74、102.87和86.36 mg·L-1(見表1)。觀察發(fā)現(xiàn),高濃度氨氮脅迫下,斑馬魚個體行動明顯遲緩,且排泄物較多。

表1 氨氮對斑馬魚的半致死濃度

2.2 氨氮暴露對斑馬魚SOD、AChE酶活性影響

氨氮對斑馬魚SOD和AChE酶活性的影響結(jié)果見圖1。由圖1(a),氨氮暴露初期(第3 d),各實驗組SOD活性與對照組無顯著差異,暴露后期(第14 d),各濃度組差異顯著:與對照組相比,低(0.1LC50)和中濃度組(0.4LC50)SOD酶活性增加了12.23%和16.47%,而高濃度組(0.8LC50)SOD酶活性降低了19.30%;由圖1(b),氨氮暴露初期和暴露后期,AChE酶活性均受到抑制,隨暴露時間的增加,暴露濃度越高,AChE活性被抑制的效果越明顯,與對照組相比酶活降低分別達12.32%,22.45%和25.36%。

2.3 氨氮對斑馬魚基因相對轉(zhuǎn)錄量的影響

圖2(a)是β-actin(內(nèi)參基因)、SOD、CYP450和AChE基因RT-PCR電泳結(jié)果,可知,SOD和CYP450條帶亮度差異顯著。經(jīng)掃描分析,氨氮脅迫第3 d,SOD基因相對轉(zhuǎn)錄量隨氨氮濃度表現(xiàn)為先降低后升高的趨勢,各處理間差異顯著,與酶活測定相比,氨氮對基因轉(zhuǎn)錄的影響更早;染毒第14 d,高濃度組(0.8LC50)表現(xiàn)出明顯的抑制作用,其整體變化趨勢為先升高后降低,與酶活測定結(jié)果基本一致。CYP450基因的轉(zhuǎn)錄在初期和后期均明顯受到抑制,各處理間基因相對表達量具有顯著差異。

圖1 氨氮對斑馬魚肝臟組織SOD(a)和AChE(b)酶活性影響

3 討 論

通過急性毒性實驗得到氨氮對斑馬魚96 h-LC50為86.36 mg·L-1,與其他已有報道的魚類氨氮毒性值比較,如氨氮對白斑狗魚成魚、黃顙魚、麥穗魚的96 h-LC50分別為24.92、148.1、247.35 mg·L-1等[9],發(fā)現(xiàn)氨氮對斑馬魚的毒性與對其他不同魚類的毒性大小存在一定的差距,這說明不同生物對氨氮毒性的抵抗能力存在差異。

SOD作為魚體中重要的抗氧化性酶,當受到外界污染環(huán)境刺激時,其自身活性發(fā)生變化[10]。本研究中,斑馬魚肝臟組織中SOD酶活性在長時間的氨氮脅迫下呈現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象,這與其他一些報道類似[11-12]。乙酰膽堿酯酶(AChE)是目前研究的最廣泛、最成熟的生物標志物(biomarker)之一,可用于對自然環(huán)境中極低濃度污染物的檢測[13]。本研究發(fā)現(xiàn),不同染毒時間和不同染毒濃度的處理下,AChE酶活性均受到抑制,然而處理之間差異卻不顯著,與AChE基因相對表達量測定結(jié)果不一致。細胞色素P450(CYP450)屬于誘導酶,其降解有毒物質(zhì)的能力受基因表達調(diào)控、翻譯后修飾等影響[14]。研究發(fā)現(xiàn)與酶活測定相比,氨氮對基因(SOD、CYP450)轉(zhuǎn)錄的影響更早,脅迫后期的變化趨勢與酶活測定結(jié)果基本一致。這充分說明斑馬魚酶活性以及相應基因轉(zhuǎn)錄水平上的變化能夠作為生物標記物有效的監(jiān)測氨氮對水體環(huán)境的污染,且后者更具時效性。

4 結(jié) 論

本研究檢測了氨氮對斑馬魚肝臟組織AChE和SOD酶活性的影響,并在基因轉(zhuǎn)錄水平分析了氨氮對相應基因相對表達的效應。結(jié)果顯示,與酶活性測定相比,相應基因(SOD和CYP450)在轉(zhuǎn)錄水平上的變化出現(xiàn)更早,更靈敏。利用污染物濃度與酶蛋白基因表達水平的定量關(guān)系能夠快速有效的診斷環(huán)境污染變化對生物體造成的損傷,以便對環(huán)境污染做出早期預警。

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Effect of activity and gene expression of three enzymes on Zebrafish(Daniorerio) stressed by ammonia nitrogen

ZHOUYing1,SUNLizong2,LIUZhihong2,TAIPeidong2,LIYueying1

(1. College of Life Science, Shenyang Normal Unicersity, Shenyang 110034, China;2. Institute of Applied Ecology, Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110034, China)

Objective: In order to provide a theoretical basis for the rapid and accurate evaluation of ammonia in water environment, the toxic effect of ammonia to zebra fish (Daniorerio) was discussed by two ways of enzyme activity determination and enzyme gene expression. Methods: The toxicity tests were conducted to determine the lethal toxic effect of ammonia to Daniorerio. Superoxide dismutase (SOD) and acetylcholinesterase (AChE) activities were measured after 3 d and 14 d. RNA from liver was extracted and transcription amounts of AChE,Cu/Zn-SOD, CYP450 were determined by semi-quantitative RT-PCR determination. Conclusion: The 96 h of half lethal concentration (LC50) value was 86.36 mg·L-1. The activity of SOD was without obvious change after 3 d, while a trend of “more active at low concentration and less active at high concentration” was shown after exposed by 14 days. The activity of AChE was inactive all the time and a significant “dose-response” relationship was observed. Compared with enzyme’s activity, the corresponding of gene expression was more sensitive, making it more time-sensitive in the detection of ammonia pollution.

ammonia nitrogen; Daniorerio; SOD; AChE; CYP450

2015-09-30。

國家重大專項資助項目(2012ZX07505-001); 沈陽市科技局計劃項目(F15-199-1-22)。

周 瑩(1990-),女,河南南陽人,沈陽師范大學碩士研究生; 通信作者:李玥瑩(1966-),女,遼寧沈陽人,沈陽師范大學教授,博士。

1673-5862(2016)01-0088-04

X-1

A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2016.01.020