李洋　肖婧姍　張忠秋　李亞

【摘 要】目的：研究慢性應(yīng)激對小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響及機(jī)制。方法：慢性應(yīng)激模型的建立采用的是持續(xù)21天的7種不同應(yīng)激方式，通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，免疫組織化學(xué)方法檢驗(yàn)小鼠腦內(nèi)各腦區(qū)wnt3a的表達(dá)。結(jié)果：慢性應(yīng)激組小鼠與對照組小鼠相比，在定位航行試驗(yàn)中，小鼠尋找平臺(tái)的逃避潛伏期明顯提高（P<0.05），空間搜索實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)激組小鼠在目標(biāo)象限的游泳時(shí)間明顯減少（P<0.05）。在小鼠腦內(nèi)PFC區(qū)wnt3a表達(dá)顯著減少（P<0.01）。結(jié)論：慢性應(yīng)激對小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的能力具有損傷作用，這與wnt3a在腦內(nèi)的表達(dá)關(guān)系密切。

【關(guān)鍵詞】慢性應(yīng)激；學(xué)習(xí)記憶；Wnt3a；海馬；前腦皮層

【Abstract】Objective To study the effects of chronic stress on the spatial learning-memory function of mice and its mechanism. Method The chronic stress model of mice was induced by stimulation of multiple stressors for 21 days. The ability of spatial learning-memory of mice were determined by Morris Water maze task， and the expression of Wnt3a in the hippocampus and prefrontal cortex were detected by immunohistochemical method .Result After chronic stress， the stress groups escape latency in the place navigation test were significantly higher than control group mice（P<0.05）. In the spatial search test， after chronic stress ，respectively compared with control group mice， in first quadrant （i.e. platform quadrant） the swimming time of stress group mice were obviously shortened（P<0.05）. TheWnt3a expression in PFC were significantly shortened in stress group mice（P<0.01）. Conclusion The ability of chronic stress on spatial learning and memory in mice has the function of damage， which is closely related to the expression of Wnt3a in brain.

【Key words】Chronic stress； Learning and memory； Wnt3a； Hippocampus； Prefrontal cortex

研究表明，長期強(qiáng)烈身心應(yīng)激嚴(yán)重影響著人類的身心健康，使機(jī)體出現(xiàn)抑郁癥、學(xué)習(xí)記憶障礙、應(yīng)激性精神紊亂、免疫力低下等多系統(tǒng)疾病[1]。慢性應(yīng)激可以誘導(dǎo)抑郁癥已成為公認(rèn)事實(shí)，有抑郁癥史的自殺病人的行為表現(xiàn)與慢性應(yīng)激引發(fā)癥狀非常一致[2， 3]。慢性應(yīng)激可造成機(jī)體大腦器質(zhì)性損壞，尤其是海馬結(jié)構(gòu)和功能的損害，最終引發(fā)抑郁癥[4]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在正常成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）中Wnt3a可以促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生來進(jìn)行自我更新與組織修復(fù)，在蛛網(wǎng)膜下腔出血后的早期腦損傷研究中，Wnt3a可能通過經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)與保護(hù)發(fā)揮積極作用[5]。本實(shí)驗(yàn)研究慢性應(yīng)激模型小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的變化以及海馬和前額葉皮層Wnt3a 表達(dá)的變化，探討慢性應(yīng)激對小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組與建立慢性應(yīng)激動(dòng)物模型

2月齡的昆明品系小白鼠，體重20±2g，雌雄各半，購于山東濟(jì)寧魯抗醫(yī)藥公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。小鼠適應(yīng)一周。飲水，進(jìn)食自由，隨機(jī)分為對照組和應(yīng)激組，每組12 只。

應(yīng)激組采用多因素的慢性不可預(yù)知應(yīng)激動(dòng)物模型進(jìn)行研究。其中應(yīng)激組為：小鼠在21天內(nèi)接受7應(yīng)激源刺激包括高臺(tái)（1 h，高臺(tái)呈圓柱體高1.6m，直徑0.05m）、通宵照明（10h）、冰水游泳（8℃冷水中游泳3min）、禁食（36h）、禁水（24h）、斜籠擁擠（36h）、足底電擊（電壓36V，1min/次，每次持續(xù)10s，共30次）。每天給予一種刺激（采用無規(guī)則的交替刺激）使小鼠無法預(yù)知應(yīng)激源的變化以及刺激的發(fā)生；對照組小鼠在相同飼養(yǎng)環(huán)境中正常飼養(yǎng)21天，不接受任何實(shí)驗(yàn)應(yīng)激源。對照組不接受應(yīng)激，正常狀態(tài)飼養(yǎng)。

1.2 Morris水迷宮檢測學(xué)習(xí)記憶能力

采用Morris 水迷宮，檢測兩組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。Morris 水迷宮由圓形水池和池內(nèi)一可移動(dòng)平臺(tái)組成，直徑80cm，高50cm，水溫26±1℃。測試程序包括定位航行和空間搜索兩個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟。水迷宮被均分為4個(gè)象限，平臺(tái)置放于第一象限（目標(biāo)象限），并在第三象限池壁做紅色標(biāo)記，使之于平臺(tái)連線為水池直徑。定位航行實(shí)驗(yàn)共2d，每只小鼠每天兩個(gè)訓(xùn)練周期，每個(gè)周期內(nèi)接受4 次找平臺(tái)訓(xùn)練，小鼠分別對應(yīng)一個(gè)象限入水，每次訓(xùn)練120s。記錄小鼠入水至找到水下平臺(tái)的逃避潛伏期（escape latency）。第3d 進(jìn)行空間搜索試驗(yàn)，撤除平臺(tái)，小鼠由第三象限入水點(diǎn)入水， 記錄小鼠120s 內(nèi)在4 個(gè)象限的游泳時(shí)間，以檢測小鼠對平臺(tái)（目標(biāo)象限）的記憶能力。

1.3 小鼠海馬和前腦皮層Wnt3a的表達(dá)

在完成水迷宮空間試驗(yàn)后，戊巴比妥鈉注射麻醉小鼠，取出心臟，快速灌注37℃生理鹽水50ml 及4℃的4%多聚甲醛溶液50ml，開顱取腦，后固定2h，酒精梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后進(jìn)行冠狀切片（厚約5μm）。免疫組化實(shí)驗(yàn)一抗及試劑盒均購自武漢博士德生物公司，按照試劑盒的要求操作。陰性對照選擇PBS（磷酸緩沖液）代替一抗。選擇每只小鼠相應(yīng)海馬部位和前腦皮層（PFC）切片3 張，每張隨機(jī)選取兩個(gè)不相重疊的視野，用Motic Images Advanced 3.2 圖像處理系統(tǒng)對海馬和前腦皮層的Wnt3a陽性細(xì)胞平均目標(biāo)灰度值進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（M±s）來表示，逃避潛伏期采用重復(fù)測量方差分析（repeated-measures ANOVA）；各象限游泳時(shí)間采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間比較以Newman-Keuls 法分析。其他數(shù)據(jù)組間比較用非配對t 檢驗(yàn)分析。P<0.05 時(shí)說明有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的變化

定位航行試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示（表1）：慢性應(yīng)激后，對照組和應(yīng)激組兩組小鼠隨訓(xùn)練其逃避潛伏期均顯著降低（F= 4.958，P<0.01；F= 7.225，P<0.01）。在4個(gè)訓(xùn)練周期中，應(yīng)激組小鼠的逃避潛伏期均長于對照組小鼠（P<0.05）。結(jié)果表明，慢性應(yīng)激對小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能造成損傷。

空間搜索實(shí)驗(yàn)中各組小鼠實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下（表2）：慢性應(yīng)激后，各組小鼠的游泳停留時(shí)間均在第一象限（即平臺(tái)象限）最長。對照組小鼠在慢性應(yīng)激后，與其余三個(gè)象限比較，在第一象限的游泳時(shí)間顯著延長（F= 5.452，P<0.01）；與其它三個(gè)象限比較，而應(yīng)激組小鼠在慢性應(yīng)激后在第一象限的停留時(shí)間差異不顯著（F= 0.6124，P>0.05）。在第一象限的組間比較：慢性應(yīng)激后，相較于對照組，應(yīng)激組的游泳時(shí)間明顯延長（P<0.05）。

2.2 各組小鼠海馬和前腦皮層wnt3a表達(dá)

小鼠免疫組化結(jié)果（表3）：在對照組小鼠海馬CA1、CA3椎體細(xì)胞層和DG區(qū)顆粒細(xì)胞神經(jīng)元中均未明顯表達(dá)Wnt3a且差異不明顯；但在前腦皮層中，與對照組比較，應(yīng)激組小鼠在應(yīng)激即刻Wnt3a陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少（P<0.01）。

3 討論

慢性應(yīng)激可導(dǎo)致機(jī)體大腦器質(zhì)性損壞，尤其是海馬結(jié)構(gòu)和功能的損害，最終引發(fā)抑郁癥，而且有神經(jīng)精神系統(tǒng)損傷[6]。慢性應(yīng)激導(dǎo)致腦損傷的同時(shí)有一個(gè)與之相反的活動(dòng)保護(hù)著中樞神經(jīng)系統(tǒng)，也就是神經(jīng)發(fā)生。有研究報(bào)道，在正常成年哺乳動(dòng)物CNS中Wnt3a 可以促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生來進(jìn)行自我更新與組織修復(fù)；在早期腦損傷研究中，Wnt3a 可能通過經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生[5]，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)與保護(hù)發(fā)揮積極作用。Wnt3a 之所以能夠增強(qiáng)神經(jīng)發(fā)生作用，其機(jī)制可能與Wnt 通路有關(guān)[7]。已有研究顯示，Wnt 信號(hào)通路參與了成年期NSCs 的增殖、分化以及細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)控[8]，甚至對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育包括突觸形成、建立皮質(zhì)模式等也是至關(guān)重要的[9]。本研究中，慢性應(yīng)激后，各組小鼠的游泳停留時(shí)間均在第一象限（即平臺(tái)象限）最長，提示小鼠均獲得記憶。在第一象限的組間比較：慢性應(yīng)激后相較于對照組，應(yīng)激組的游泳時(shí)間明顯延長；提示慢性應(yīng)激使學(xué)習(xí)記憶遭受一定程度的損壞。小鼠在慢性應(yīng)激后各腦區(qū)wnt3a表達(dá)結(jié)果表明，小鼠的海馬各區(qū)均未有明顯的wnt3a表達(dá)，與部分文獻(xiàn)報(bào)道類似，推測這可能與檢測時(shí)間有一定的關(guān)系。在對照組小鼠的PFC，wnt3a廣泛表達(dá)，而應(yīng)激組小鼠PFC區(qū)的wnt3a陽性細(xì)胞數(shù)量顯著減少，陽性表達(dá)較弱，細(xì)胞著色淺。本實(shí)驗(yàn)研究說明，慢性應(yīng)激對小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的能力具有損傷作用，并且對應(yīng)激后的恢復(fù)產(chǎn)生影響，這與wnt3a在腦內(nèi)的表達(dá)關(guān)系密切；wnt3a對慢性應(yīng)激導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶能力的損傷有一定的保護(hù)作用。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Avshalom C， Karen S， Moffitt T E， et al. Influence of Life Stress on Depression： Moderation by a Polymorphism in the 5-HTT Gene[J]. Science， 2003， 301（5631）：386-389.

[2]Osvath P， Voros V， Fekete S. Life Events and Psychopathology in a Group of Suicide Attempters[J]. Psychopathology， 2004， 37（1）：36-40.

[3]李云峰， 羅質(zhì)璞. 應(yīng)激誘發(fā)抑郁癥機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 生理科學(xué)進(jìn)展， 2002， （02）：142-144.

[4]杜娜， 陳倩， 李洋，等. 中藥復(fù)方對抑郁模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦內(nèi)SDF-1的影響[J]. 科技視界， 2015， （03）：16-17.

[5]李卓， 姜惠麗， 劉殿瑋，等. Wnt3a在蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中對神經(jīng)發(fā)生的作用[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）， 2014， （5）：15-19.

[6]Mastorakos G， Pavlatou M， Diamanti-Kandarakis E， et al. Exercise and the stress system [J]. Hormones （Athens Greece）， 2005，4：73-89.

[7]Tomoko K， Jenny H， Alysson M， et al. Wnt-mediated activation of NeuroD1 and retro-elements during adult neurogenesis[J]. Nature Neurosci， 2009， 12：1097-1105.

[8]Dieter-Chichung L， Colamarino S A， Hong-Jun S， et al. Wnt signalling regulates adult hippocampal neurogenesis[J]. Nature， 2005， 437：1370-1375.

[9]Hornsby PJ. Cellular Senescence and tissue aging in vivo[J]. J. of Gerontology， 2002， 57： B251-256.

[責(zé)任編輯：張濤]