王 敬，張金波，2，3，4*，蔡祖聰，2，3，4（ 南京師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院，南京 20023；2 虛擬地理環(huán)境教育部重點實驗室（南京師范大學(xué)），南京 20023；3 江蘇省地理環(huán)境演化國家重點實驗室培育建設(shè)點，南京 20023；4 江蘇省地理信息資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 20023）

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應(yīng)用15N稀釋法測定土壤氮素初級轉(zhuǎn)化速率的一些關(guān)鍵技術(shù)①

王 敬1，張金波1，2，3，4*，蔡祖聰1，2，3，4
（1 南京師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院，南京 210023；2 虛擬地理環(huán)境教育部重點實驗室（南京師范大學(xué)），南京 210023；3 江蘇省地理環(huán)境演化國家重點實驗室培育建設(shè)點，南京 210023；4 江蘇省地理信息資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210023）

摘 要：本文綜合評述了應(yīng)用15N庫稀釋法測定土壤氮素初級轉(zhuǎn)化速率的一些關(guān)鍵技術(shù)，即15N標(biāo)記土壤氮庫的方法、15N的加入量、豐度和標(biāo)記物種類的選擇，以及初始取樣時間的確定。只有合理地運用這些關(guān)鍵技術(shù)，才能更準確地測定土壤氮素初級轉(zhuǎn)化速率，進而更真實地表征土壤氮素的實際周轉(zhuǎn)狀況。

關(guān)鍵詞：15N稀釋法；15N均勻分布；15N加入量；15N豐度

自20世紀50年代Kirkham 和 Bartholomew［1］提出15N稀釋法測定土壤氮素初級轉(zhuǎn)化速率以來，隨著計算機分析技術(shù)的發(fā)展，一些數(shù)值模型被廣泛用來測定氮素初級轉(zhuǎn)化速率，使得氮轉(zhuǎn)化概念模型更加接近于真實過程。然而，運用15N標(biāo)記土壤氮庫的方法來研究土壤中氮初級轉(zhuǎn)化速率仍然存在較大的不確定因素。該法有3個重要假設(shè)：①15N和14N具有相同的被微生物利用的機會；②15N均勻地標(biāo)記于土壤；③15N和本底14N的平衡［2］。在實際操作中只有盡量滿足這3個假設(shè)，才能更準確地測定土壤氮初級轉(zhuǎn)化速率。本文綜合評述了應(yīng)用15N庫稀釋法測定土壤氮素初級轉(zhuǎn)化速率的一些關(guān)鍵技術(shù)，即15N標(biāo)記土壤氮庫的方法、15N的加入量、豐度和標(biāo)記物種類的選擇，以及初始取樣時間的確定，以期推動對土壤氮素初級轉(zhuǎn)化速率的研究。

115N標(biāo)記土壤氮庫的方法

如何將15N均勻地標(biāo)記于土壤氮庫是應(yīng)用同位素稀釋法測定土壤氮素初級轉(zhuǎn)化速率的主要技術(shù)問題［2］。15N的不均勻分布會使測定的初級轉(zhuǎn)化速率高于真實值［3］。目前把15N標(biāo)記到土壤氮庫中可行的方法有3種：①溶液混合方法（加入15N標(biāo)記的NH4+-N 或NO3--N溶液到土壤中） ；②氣室方法（將15N標(biāo)記的氣體，NH3或NO，注射到培養(yǎng)容器上部氣體空間中）或氣體注射方法（將15N標(biāo)記氣體直接注入到土壤中）；③干粉末方法（加入15N標(biāo)記的銨鹽或者硝酸鹽與惰性粉末的混合物）。

1.1 溶液混合方法

在室內(nèi)培養(yǎng)條件下，通常是在土壤中加入15N標(biāo)記的鹽類溶液，調(diào)節(jié)土壤達到最佳的含水量［4-6］。雖然該方法能夠盡可能地保證15N的均勻分布，但是會改變土壤的水分狀況及其他土壤條件，進而影響微生物的活性，導(dǎo)致測定的初級轉(zhuǎn)化速率偏離真實值［7-8］。研究表明，以表層少于2 cm深度的土壤為研究對象，把適量的15N標(biāo)記溶液均勻地滴到土壤表面，15N能夠在土壤均勻分布［9-11］，這種方法可以減少因15N標(biāo)記溶液加入引起的土壤水分狀況及其他土壤條件改變，進而減少對土壤微生物活性的影響［12］。當(dāng)對原狀土進行標(biāo)記時，用注射器把15N標(biāo)記溶液注入到原狀土柱中能夠最小限度地改變土壤環(huán)境，從而準確測得原位氮素初級轉(zhuǎn)化速率［13-15］，然而每個土柱要多孔注射才能使15N均勻分布，這樣留下的針孔，亦會使土壤的通氣性發(fā)生變化［14，16］。

許多研究已經(jīng)表明，以溶液形式把15N加入到土壤中會高估氮的初級轉(zhuǎn)化速率［9，13-14，17-18］，主要原因在于改變了土壤水分狀況，提高了微生物的活性，因此含水量較低的土壤不適合使用溶液混合方法［13，19］。Davidson 等［13］也報道，當(dāng)土壤水勢高于-1.5MPa時，使用該方法是不可取的。Sparling 等［14］認為質(zhì)地黏重的土壤不適合使用該方法。因此，溶液混合方法必須限制在質(zhì)地不黏重且濕潤的土壤，這樣測定的氮素初級轉(zhuǎn)化速率才能真實反映原位情況。當(dāng)然，在室內(nèi)培養(yǎng)中由于不是很注重氮初級轉(zhuǎn)化速率的實際大小，并且只是通過15N庫稀釋技術(shù)進一步理解各個處理間氮素轉(zhuǎn)化的不同，15N標(biāo)記溶液仍然有很廣泛的應(yīng)用范圍［20-22］?？傮w而言，無論是室內(nèi)培養(yǎng)，還是野外原位試驗，加入15N標(biāo)記液的體積范圍應(yīng)既能保證15N的均勻分布，又能避免對土壤造成更多的擾動。在室內(nèi)培養(yǎng)中，可以用滴管、移液管和移液槍逐滴加入的方式，盡量使溶液均勻分布在土壤表層；在原位土柱試驗中，可以使用注射器多孔注射的方法。

1.2 氣體注射方法或氣室方法

早在1995年，Stark 和 Firestone［19］就發(fā)現(xiàn)把土壤暴露于15NH3也可以標(biāo)記土壤NH-N庫，且不會改變土壤的水分狀況，但是他們并沒有解決如何把低濃度的15NH3均勻地標(biāo)記于土壤中這一難題。Murphy等［18］首次使用了多針孔注射15NH3氣體的氣體注射方法，并證實該方法能夠均勻地標(biāo)記NH-N庫，且避免了對土壤的擾動，尤其是不改變土壤的含水量。該方法適用于原位測定質(zhì)地黏重土壤的氮素初級轉(zhuǎn)化速率［23］。氣體注射方法被廣泛應(yīng)用于標(biāo)記土壤氮庫，測定土壤氮素初級轉(zhuǎn)化速率［24-25］，如Osler 等［24］用氣體注射方法成功驗證了氮初級轉(zhuǎn)化速率與螨蟲群落結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。

此外，氣室方法也是用含15N的氣體標(biāo)記土壤氮庫的一種方法，就是將15N標(biāo)記的氣體（NH3或NO），注射到培養(yǎng)容器上部氣體空間中，用15NO標(biāo)記土壤NO-N庫［19］，用15NH3標(biāo)記NH-N庫［12］。這種方法比氣體注射法簡單，但是氣體擴散到土柱中是一個被動的過程，因而存在15N能否均勻分布的問題。Murphy 等［12］發(fā)現(xiàn)與氣體注射方法和溶液混合方法相比，氣室方法低估了氮的初級礦化速率。

1.3 干粉末方法

Willison 等［26］提出了一種新的標(biāo)記方法，用硅粉和15N標(biāo)記的NO-N混合物干粉末標(biāo)記土壤NO-N庫，測定土壤的初級硝化速率。該方法尤其適用于氮是限制因素的土壤，因為在此類土壤中加水很可能提高微生物活性和礦化能力，從而增加有效態(tài)氮的數(shù)量。與干粉末方法相比，溶液混合方法能夠使初級總硝化速率提高13% ～ 155%（平均84%）。

1.4 各種標(biāo)記方法比較

Luxhoi 等［27］在比較了不同標(biāo)記方法測定粗質(zhì)地土壤氮初級轉(zhuǎn)化速率后，發(fā)現(xiàn)溶液混合方法和氣體注射方法測定的氮初級礦化速率很接近，表明了標(biāo)記方法不同不影響土壤中 NH4+的產(chǎn)生。但是，溶液混合方法測得的微生物同化速率是氣體注射方法的兩倍，其可能原因是由于溶液混合方法使15N分布更均勻，有利于微生物對氮的利用。Murphy 等［12］對不同質(zhì)地土壤研究發(fā)現(xiàn)溶液混合方法和氣體注射方法測得的氮初級礦化速率和初級 NH4+消耗速率相似，而氣室方法測定的氮初級礦化速率和 NH4+消耗速率是最低的。但是目前還沒有關(guān)于土壤水分不同對氣體注射方法和溶液混合方法測定土壤氮初級轉(zhuǎn)化速率的影響研究。如果溶液混合方法帶入的溶液會刺激土壤的微生物活性，進而顯著改變土壤氮初級轉(zhuǎn)化速率，那么氣體注射方法就可以代替溶液混合方法測定氮初級轉(zhuǎn)化速率。總體而言，由于液體比氣體更容易定量，比固體粉末容易擴散，因此溶液混合方法是15N標(biāo)記首選的方法。然而，土壤中加入水溶液會刺激微生物活性，改變氮初級轉(zhuǎn)化速率，從這方面看氣體注射方法和干粉末方法也有它們各自的優(yōu)勢［2］。

215N的加入量、豐度和標(biāo)記物種類

2.115N加入量

應(yīng)用15N同位素稀釋法測定土壤氮初級轉(zhuǎn)化速率的另一個重要條件，是被標(biāo)記氮庫濃度和豐度既要發(fā)生明顯的變化，又不能下降過快，從而保證儀器對氮濃度和豐度的準確測定。同時，如果加入的氮量過多又會明顯改變土壤氮素轉(zhuǎn)化速率，使測定結(jié)果偏離實際情況。因此，15N的使用量和豐度也是一個重要的技術(shù)問題。

15N的加入量取決于土壤中被標(biāo)記氮庫的濃度。Tietema 和 Wessel［28］認為加入的15N量不應(yīng)超過土樣中初始無機氮庫（NH-N+NO-N）的5%。像森林土壤和一些牧草地土壤，它們的初始NHN庫含量比較高，需加入的15N標(biāo)記液應(yīng)是高豐度的且濃度應(yīng)為初始無機氮庫（NH-N+NO-N）的5% ～ 25%［29］。然而，許多耕作土壤的本底NH-N庫含量比較低（N ＜ 2 mg/kg），且NH-N庫的周轉(zhuǎn)非常迅速，常常在2天之內(nèi)［12，23］，因此在耕作土壤中，為了滿足儀器測定所需要的豐度范圍，應(yīng)用15N量為1 ～ 10 mg/kg （15N豐度 ＞10%）［10，12，30］。事實上，目前對加入15N量及豐度的選擇隨意性很大，其準則是在滿足同位素質(zhì)譜儀對濃度和豐度的測定要求下，盡可能地選擇高豐度低濃度的15N加入方法。當(dāng)土壤中氮含量相對較高，甚至接近或處于基質(zhì)飽和狀態(tài)時，可加入高濃度的15N標(biāo)記，有利于15N的均勻混合；反之，對于硝化作用和反硝化作用速率受基質(zhì)控制的土壤，加入氮有可能促進硝化作用或反硝化作用，應(yīng)加入低量的15N標(biāo)記，盡量減少對氮轉(zhuǎn)化速率的影響［6］。Watson 等［3］用溶液混合法將15NH溶液均勻滴到土壤表面，設(shè)置兩個處理的氮加入量分別為N 2和15 mg/kg（15N豐度99.8%），發(fā)現(xiàn)與2 mg/kg的加入量處理相比，15 mg/kg的加入量處理的初級礦化速率較低，而初級硝化速率相對較高。然而，Luxh?i等［31］采用溶液混合方法分別在土壤中加入 NH-N 1 mg/kg （15N豐度99.8%），5 mg/kg（15N豐度18.9%）和10 mg/kg （15N豐度 9.4%），培養(yǎng)了24 h，結(jié)果表明3種處理間的氮初級轉(zhuǎn)化速率沒有顯著的差異?？傮w而言，施用15N的量應(yīng)盡可能得少，避免發(fā)生因加入底物而產(chǎn)生的激發(fā)效應(yīng)，但是又要保證樣品中有足夠的氮量滿足同位素質(zhì)譜儀測定15N豐度的要求。已有學(xué)者采用在樣品前處理的最后步驟——濃縮之前加入未標(biāo)記的NH-N或者NO-N的方法，滿足同位素質(zhì)譜儀測定15N豐度時對氮量的需求［32］。

2.215N豐度

對于15N豐度的選擇沒有絕對的界限，已報道的文獻中所用15N豐度從2% ～ 99% 各不相同。選擇15N豐度有3個相對的原則：

1） 標(biāo)記氮庫的濃度。如果所標(biāo)記氮庫的濃度較大，需要使用高豐度的標(biāo)記氮化合物，以保證標(biāo)記氮庫有較高的15N豐度。特別是在野外原位試驗中要求盡可能反映土壤中氮的實際轉(zhuǎn)化速率，則加入標(biāo)記氮濃度要盡量低，而標(biāo)記氮的15N豐度要足夠得高。

2） 土壤氮轉(zhuǎn)化速率。當(dāng)供試土壤氮轉(zhuǎn)化速率比較快時，加入的15NH-N或15NO-N就會很快分別被有機氮礦化產(chǎn)生的14NH-N和14NH-N硝化產(chǎn)生的14NO-N所稀釋，導(dǎo)致15N豐度快速降低，以致同位素豐度接近氮素自然豐度，所以對氮轉(zhuǎn)化速率較快的土壤應(yīng)該選擇高豐度的15N，其加入量也稍微高一些。

3） 經(jīng)濟原則。豐度越高的15N同位素化合物，價格越高，所以費用也是昂貴的。1 g豐度為99.9% 的 （15NH4）2SO4的價格是10% （15NH4）2SO4價格的幾倍。所以在滿足試驗要求條件下，盡量選擇低豐度的15N同位素化合物，以節(jié)約經(jīng)費。

2.315N標(biāo)記物種類的選擇

早期測定土壤氮素初級轉(zhuǎn)化速率常用分析計算方法，近年來關(guān)于數(shù)值優(yōu)化方法測定土壤氮初級轉(zhuǎn)化速率的報道明顯增加，常用的如 Mary等［33］開發(fā)的FLUAZ模型和Müller等［34］開發(fā)的基于蒙特卡洛優(yōu)化計算方法的氮轉(zhuǎn)化模型［35］。分析計算方法和數(shù)值優(yōu)化方法對15N標(biāo)記物種類的選擇以及培養(yǎng)時間長短都有各自的要求。分析計算方法中標(biāo)記NH-N庫常用（15NH4）2SO4，也有些學(xué)者使用15NH4Cl。標(biāo)記NO-N庫常用 K15NO3，這樣選擇的目的就是為了避免發(fā)生底物激發(fā)效應(yīng)，從而達到準確測定氮初級礦化和硝化速率的要求。當(dāng)（15NH4）2SO4標(biāo)記NH-N庫時，15NH不是土壤礦化過程的底物，因此不會高估初級礦化速率，但是因其加入的NH-N是初級NH-N消耗過程的底物，因而不可避免地高估初級NH-N消耗速率；當(dāng)K15NO3標(biāo)記NO-N庫時，15NO亦不是土壤硝化過程的底物，不會影響對初級硝化速率的測定［36］?？梢姡治鲇嬎惴椒ㄖ惺褂?5NH4NO3和 NHNO3作為標(biāo)記物是不合適的。與此相反，數(shù)值優(yōu)化方法則大多使用15NH4NO3和 NHNO3作為標(biāo)記物，因其具有強大的計算機分析能力，可以盡可能減少底物所帶來的激發(fā)效應(yīng)。從嚴格意義上說數(shù)值優(yōu)化方法并不是15N稀釋法，而是15N示蹤法［36］。

此外，15N標(biāo)記物種類的選擇與土壤施肥與否密切相關(guān)。對于長期施氮肥的農(nóng)田土壤，如果反映的是施氮肥對土壤氮素初級轉(zhuǎn)化速率的影響，那么NO-N庫的標(biāo)記可以選擇 NHNO3或者（NH4）2SO4和K15NO3，因為NH-N加入對硝化的激發(fā)作用就是研究的目的之一；對于森林土壤，因為其基本上不施肥，氮輸入量較少，都來自于大氣氮沉降以及凋落物分解，因此NO-N庫的標(biāo)記物以K15NO3最佳，同樣地，當(dāng)農(nóng)田土壤不施肥期間，NO-N 庫的標(biāo)記物選擇與不施肥的森林土壤一致，避免NH-N加入激發(fā)硝化過程，不能代表土壤實際的氮轉(zhuǎn)化狀態(tài)。

3 初始取樣時間

Murphy 等［18］把初始取樣時間（t0）定為15N標(biāo)記后2 h，這樣有足夠的時間發(fā)生15N的非生物固定和外源15N與土壤本底14N的平衡。不同的土壤所需的時間不同，所以初始取樣時間（t0）是可變的，在粗質(zhì)地土壤中加入15N后的1、2和4 h取樣，所測得的氮初級礦化速率沒有顯著的區(qū)別。在黏粒含量高且團聚體多的土壤中，為了提高15N分布的均勻性，常常要在24 h后進行初始取樣［12，18］。Willison 等［26］發(fā)現(xiàn)使用硅粉-15N標(biāo)記的NO混合物測定初級硝化速率，外源15N與土壤14N達到平衡需要48 h。可見，初始取樣時間一般在標(biāo)記物加入后0.25 ～ 24 h比較適宜。

4 小結(jié)

同位素稀釋法是測定土壤中營養(yǎng)元素初級轉(zhuǎn)化速率最重要的方法之一，已經(jīng)被廣泛地用來測定土壤氮的初級轉(zhuǎn)化速率，然而，15N標(biāo)記方法研究土壤中氮的初級轉(zhuǎn)化速率仍然存在較大的不確定因素。如何將15N均勻地標(biāo)記于土壤中仍然是一個亟待解決的問題，此外，加入的15N會影響土壤的理化性質(zhì)和微生物活性，這些都是目前該方法面臨的難題，不克服這些問題就會使測得的氮初級轉(zhuǎn)化速率偏離真實值。所以，在采用該方法研究土壤氮初級轉(zhuǎn)化速率時，需要依據(jù)土壤性質(zhì)確定合適的標(biāo)記方法、氮用量、15N豐度、氮化合物種類和合適的初始取樣時間，這樣才能更準確地測定土壤初級轉(zhuǎn)化速率，進而更真實地表征土壤氮素的實際周轉(zhuǎn)狀況。

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中圖分類號：S154.1

DOI:10.13758/j.cnki.tr.2016.03.002

基金項目：①國家自然科學(xué)基金重點項目（41330744），江蘇省普通高校學(xué)術(shù)學(xué)位研究生科研創(chuàng)新計劃項目（KYZZ15_0218）和江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項目（PAPD，164320H116）資助。

* 通訊作者（zhangjinbo@njnu.edu.cn）

作者簡介：王敬（1988—），女，河南新鄉(xiāng)人，博士研究生，主要從事土壤氮素轉(zhuǎn)化研究。E-mail: jwangcxx@126.com

Several Key Techniques in Calculating Gross N Transformation Rates by15N Dilution Methods

WANG Jing1， ZHANG Jinbo1，2，3，4*， CAI Zucong1，2，3，4
（1 School of Geography Sciences， Nanjing Normal University， Nanjing 210023， China； 2 Key Laboratory of Virtual Geographic Environment Ministry of Education （Nanjing Normal University）， Nanjing 210023， China； 3 State Key Laboratory Cultivation Base of Geographical Environment Evolution （Jiangsu Province）， Nanjing 210023， China； 4 Jiangsu Center for Collaborative Innovation in Geographical Information Resource Development and Application， Nanjing 210023， China）

Abstract:Several key techniques in calculating gross N transformation rates by15N dilution methods were reviewed in this paper.Such techniques include methods of applying15N to soil， amount， enrichment and types of15N addition， and initial sampling time.Only when these techniques were applied reasonably under particular conditions，15N dilution methods could be successfully to quantify gross N transformation rates and to understand the fundamental processes that regulate individual microbial N pathways.

Key words:15N dilution methods； Uniform distribution of15N； Amount of15N addition； Enrichment of15N