孫園園蔡怡聰謝黎虹焦桂愛魏祥進(jìn)圣忠華唐紹清胡培松*

（1杭州師范大學(xué)，杭州310000；2中國水稻研究所，杭州310006；*

通訊作者：hupeisong@cass.cn）

近紅外光譜分析技術(shù)在稻米品質(zhì)測定和遺傳分析中應(yīng)用研究概述

孫園園1，2蔡怡聰2謝黎虹2焦桂愛2魏祥進(jìn)2圣忠華2唐紹清2胡培松2*

（1杭州師范大學(xué)，杭州310000；2中國水稻研究所，杭州310006；*

通訊作者：hupeisong@cass.cn）

近紅外光譜定量分析技術(shù)是一項高效、快速檢測樣品中化學(xué)成分的方法，在米質(zhì)組分檢測、快速篩選育種材料等方面得到廣泛應(yīng)用。文章簡要介紹了該技術(shù)的基本原理、定量分析的步驟及其在稻米品質(zhì)改良中的應(yīng)用。近紅外技術(shù)不僅能提高育種材料選擇效率，而且還有助于品質(zhì)遺傳機(jī)理研究的深入，加速稻米品質(zhì)改良進(jìn)程。

近紅外光譜；關(guān)聯(lián)分析；稻米品質(zhì)；改良育種

水稻是世界主要糧食作物之一，隨著生活水平和健康意識的提高，人們對水稻品質(zhì)越來越重視。稻米品質(zhì)主要包括碾磨品質(zhì)、外觀品質(zhì)、蒸煮品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)。目前普遍采用農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T 83-1988來測定分析稻米品質(zhì)，此方法適用于水稻品質(zhì)組分的精確測定，但并不適合在育種中進(jìn)行大批量樣品多組分的快速篩選。因此，需要一種高效、快速、準(zhǔn)確的稻米品質(zhì)檢測分析方法，為水稻品質(zhì)改良育種提供技術(shù)支持。近幾年，我國越來越多的學(xué)者開始重視近紅外光譜計量學(xué)方法的研究，這是近紅外光譜分析技術(shù)發(fā)展到較高程度的標(biāo)志。近紅外光譜技術(shù)（NIRS）具有快速、無損傷、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)[1]，現(xiàn)已廣泛用于水稻品質(zhì)組分研究上。直鏈淀粉含量（Amylose Content）、堿消值（Alkali Spreading Value）、膠稠度（Gel Consistency）、蛋白質(zhì)含量（Protein Content）和氨基酸含量（Amino Acid Content）是評價稻米蒸煮和營養(yǎng)品質(zhì)的重要理化指標(biāo)，關(guān)系到稻米品質(zhì)的優(yōu)劣[2]，這促使國內(nèi)外學(xué)者對其進(jìn)行近紅外定標(biāo)模型研究，為水稻育種的品種資源鑒定、中間材料的篩選提供參考。由于水稻全基因組測序的完成，使得越來越多DNA數(shù)據(jù)得到積累。關(guān)聯(lián)分析技術(shù)可以將水稻全基因組的DNA數(shù)據(jù)與近紅外模型預(yù)測的品質(zhì)組分定量數(shù)據(jù)相結(jié)合來研究品質(zhì)的遺傳機(jī)理。

1 近紅外光譜分析技術(shù)概況

1.1 構(gòu)建近紅外模型的理論基礎(chǔ)

19世紀(jì)初，英國的William Herschel發(fā)現(xiàn)非可見光譜區(qū)，波長在780～2 526 nm范圍內(nèi)，具有“波”和“?！钡亩匦裕饕菍瑲浠鶊F(tuán)X-H（X：C，N，S，O）的吸收，它由分子振動產(chǎn)生能級躍遷，表現(xiàn)出基態(tài)能向高態(tài)能能級的變化。因而，光譜呈現(xiàn)的是樣品化學(xué)鍵基團(tuán)振動產(chǎn)生的倍頻和合頻信息[3]。

1.2 近紅外定標(biāo)模型構(gòu)建的關(guān)鍵步驟

利用winsin軟件對定標(biāo)數(shù)據(jù)的處理，建立定標(biāo)模型，通過近紅外模型可以對未知樣本組分進(jìn)行定性定量分析，因而校正分析模型需要較高的精準(zhǔn)度。具體分析過程由以下幾個步驟組成：首先掃描具有代表性的定標(biāo)集，得到光譜分析值；接著采用實(shí)驗室測定組分的標(biāo)準(zhǔn)方法測定實(shí)驗室樣品的參比值；然后再通過合適的化學(xué)計量學(xué)中的光譜處理算法將掃描的光譜分析值和實(shí)驗室測定的參比值關(guān)聯(lián)建立近紅外校正模型；最后利用構(gòu)建好的近紅外模型對未知樣本組分進(jìn)行測定。測定的結(jié)果必須符合模型允許的誤差要求，否則需要重新收集代表性的樣品對原有模型進(jìn)行擴(kuò)充，用來優(yōu)化模型的結(jié)構(gòu)。

1.3 近紅外分析的現(xiàn)代化

隨著計算機(jī)技術(shù)、光纖技術(shù)與化學(xué)計量學(xué)等多學(xué)科技術(shù)的發(fā)展，近紅外光譜可以呈現(xiàn)出樣品官能團(tuán)的化學(xué)鍵強(qiáng)度變化、成分多少、電負(fù)性強(qiáng)弱及其氫鍵信息折射、投射、漫反射、散射、表面光澤、反射光的偏度等信息[4]，也解決了近紅外光譜信息雜亂的現(xiàn)象，剔除干擾無用信息，區(qū)分特征樣品的有用信息。

2 近紅外光譜分析技術(shù)在稻米品質(zhì)研究中的應(yīng)用

2.1 在稻米蒸煮品質(zhì)檢測中的應(yīng)用

稻米蒸煮品質(zhì)的主要指標(biāo)為直鏈淀粉含量、膠稠度、堿消值，關(guān)系到米飯的口感。目前測定蒸煮品質(zhì)的方法主要是NY/T 83-1988，費(fèi)時費(fèi)力，因而需要一種快速測定方法。舒慶堯等[5]利用MPLS結(jié)合光譜分組法建立了相關(guān)系數(shù)達(dá)0.98的表觀直鏈淀粉定標(biāo)模型，提高了近紅外分析技術(shù)對直鏈淀粉含量預(yù)測精度，同時用SELECT程序證明改變H距離可以剔除相似樣本，減少需測定的樣本數(shù)，這表明了在近紅外分析技術(shù)中二階導(dǎo)數(shù)可以消除不同粒度的樣品對分析技術(shù)精準(zhǔn)度的影響和近紅外分析技術(shù)在快速測定直鏈淀粉含量上具有成熟的實(shí)際操作性。劉建學(xué)等[6]用PLS回歸方法對60個樣品建立了相關(guān)系數(shù)達(dá)0.95的大米膠稠度模型，表明近紅外分析技術(shù)對膠稠度可以進(jìn)行快速檢測；隨后謝新華等[7]用多種計量數(shù)學(xué)方法和不同回歸方法對195份樣品進(jìn)行定標(biāo)，得到相關(guān)系數(shù)0.83的膠稠度定標(biāo)模型，與劉建學(xué)建立的膠稠度定標(biāo)模型相比，效果不理想，這表明近紅外分析技術(shù)在膠稠度精準(zhǔn)度測定上還處于探索階段。此外還發(fā)現(xiàn)，樣本是否具有代表性和處理方法的不同會影響近紅外分析技術(shù)的精準(zhǔn)度。稻米的糊化特性也是影響稻米蒸煮品質(zhì)的關(guān)鍵因素，Bao 等[8]采用MPLS建立了定標(biāo)系數(shù)達(dá)0.947的消堿值定標(biāo)模型，表明近紅外光譜分析技術(shù)已可以快速準(zhǔn)確測定糊化溫度。

2.2 在稻米營養(yǎng)品質(zhì)檢測中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)和氨基酸是稻米重要的營養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)，其含量影響籽料飽滿度與口感。蛋白質(zhì)含量測定常用凱氏定氮法，其周期較長，消化樣品繁瑣、費(fèi)時。而氨基酸含量測定常用的液相色譜法對樣品破壞性大，且很難確保各種氨基酸的水解。具有成本低、分析速度快、不消耗樣品、重現(xiàn)性好、在線分析等特點(diǎn)的近紅外分析技術(shù)，對于快速測定營養(yǎng)品質(zhì)顯得尤為重要。畢京翠等[9]采用PLS法對稻谷、米粒、米粉建立了6個稻米蛋白質(zhì)的近紅外模型，米粉模型的準(zhǔn)確性大于米粒模型，稻谷蛋白定標(biāo)系數(shù)相對較低，表明近紅外分析技術(shù)可以根據(jù)材料的樣品狀態(tài)快速建立相應(yīng)狀態(tài)的定標(biāo)模型。吳金紅等[10]采用PLS法對59個株系和76份品種建立3個不同的樣品集蛋白質(zhì)模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離的群體蛋白質(zhì)含量范圍較窄，樣品來源單一，模型局限于本群體，而樣本混合建立的模型具有好的適應(yīng)能力，表明樣品種類覆蓋廣度對近紅外分析技術(shù)有效果。陸艷婷等[11]用PLS建立了秈稻稻谷、糙米、精米和精米粉的蛋白質(zhì)含量定標(biāo)模型，定標(biāo)系數(shù)分別為0.77、0.88、0.91、0.95，結(jié)果表明，若樣本范圍足夠全面，近紅外分析技術(shù)的預(yù)測準(zhǔn)確性好。而氨基酸含量的近紅外分析技術(shù)研究報道很少，Zhang等[12]構(gòu)建了天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸和精氨酸含量的4種氨基酸近紅外模型。吳建國等[13]報道的3種必需氨基酸模型相關(guān)系數(shù)大于0.9。而同時構(gòu)建出17種氨基酸的近紅外模型少之又少，表明近紅外光譜分析技術(shù)需要樣品含量大于0.1%的組分。因此，對于稻谷中的其他痕量組分如維生素、礦物質(zhì)等，目前尚不能較好的測定，但對大部分組分都取得了較好的定標(biāo)效果，模型預(yù)測精度可以用于日常分析。近紅外技術(shù)可以根據(jù)樣品不同狀態(tài)建立模型，則能保證種子無損分析檢測，在稻米品質(zhì)改良中得以應(yīng)用，促進(jìn)育種材料的快速篩選，縮短育種時間限制，減小育種的工作量，表現(xiàn)出快速測定的優(yōu)勢。

3 近紅外光譜分析技術(shù)與關(guān)聯(lián)分析技術(shù)在稻米品質(zhì)遺傳研究中的應(yīng)用

近紅外光譜分析技術(shù)可以快速篩選出稻米品質(zhì)優(yōu)良的育種材料，預(yù)測稻米品質(zhì)的優(yōu)良表型，如果某種標(biāo)記在個體中分布十分明顯，就可以與品質(zhì)優(yōu)良的表型相關(guān)聯(lián)。關(guān)聯(lián)分析主要以連鎖不平衡為基礎(chǔ)，研究群體中分子變異與表型變異之間的關(guān)系，是發(fā)現(xiàn)定位基因、對基因功能進(jìn)行分析的育種技術(shù)，也是對分子遺傳育種中的QTL分析進(jìn)行了補(bǔ)充。目前，國內(nèi)外已有研究人員利用關(guān)聯(lián)分析技術(shù)研究了有關(guān)稻米品質(zhì)基因位點(diǎn)；利用關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)與淀粉合成途徑有關(guān)的18個基因，闡明影響蒸煮品質(zhì)的3個因素（直鏈淀粉含量、膠稠度和糊化溫度）間的關(guān)聯(lián)[14]；利用36個分子標(biāo)記對50份糯稻的18個淀粉合成基因進(jìn)一步關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，糯稻淀粉理化性狀受SSIIa、SSI控制[15]。而從另一方面利用170對SSR標(biāo)記對130份水稻核心種質(zhì)進(jìn)行品質(zhì)和有關(guān)理化性狀的關(guān)聯(lián)分析，共有101對分子標(biāo)記與性狀關(guān)聯(lián)[16]。YAN等[17]報道，在蒸煮品質(zhì)的RVA關(guān)聯(lián)位點(diǎn)中發(fā)現(xiàn)17個候選基因，10個與RVA值相關(guān)聯(lián)。利用SSR分子標(biāo)記對地方品種的氨基酸含量關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)了42個與稻米氨基酸的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，有40%的解釋率。因而，關(guān)聯(lián)分析中表型數(shù)據(jù)可基于近紅外定標(biāo)模型進(jìn)行組分含量快速預(yù)測，這將加速育種進(jìn)程中優(yōu)勢基因的挖掘。

在上述水稻品質(zhì)關(guān)聯(lián)分析中，對蒸煮品質(zhì)、營養(yǎng)品質(zhì)的分析結(jié)果與QTL相一致。邵高能等[18]利用QTL技術(shù)發(fā)現(xiàn)了直鏈淀粉、膠稠度和堿消值的基因位點(diǎn)，分布于第1、2、4、6、7和8染色體上，并且集中分布于第6染色體Wx基因和ALK基因所在區(qū)域。而研究營養(yǎng)品質(zhì)的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)稻米蒸煮品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)性狀可能具有相關(guān)性。在16種氨基酸中，4種氨基酸含量中檢測到6個具有主效應(yīng)的基因位點(diǎn)，均位于第6染色體；隨后又發(fā)現(xiàn)2個影響總淀粉含量的QTLs，位于第6染色體短臂RM508-RM511和第10染色體RM5348-RM5689標(biāo)記區(qū)間，在第6染色體的RM587-RM111區(qū)間內(nèi)有21個位點(diǎn)控制13種氨基酸含量。在第5染色體的RM305-RM178區(qū)間有11種主要氨基酸均存在QTL位點(diǎn)，第3染色體的RM168-RM143區(qū)間也檢測到9個控制主要氨基酸含量的位點(diǎn)，相鄰區(qū)間RM130-RM148存在7個具有顯著加性效應(yīng)的QTLs，因而關(guān)聯(lián)分析是對QTL手段的補(bǔ)充。

4 結(jié)論

綜上所述，近紅外光譜分析技術(shù)能快速檢測稻米的蛋白質(zhì)含量、直鏈淀粉含量、膠稠度和堿消值，能夠應(yīng)用于水稻品質(zhì)改良育種的快速分析與樣品的篩選。近紅外技術(shù)不僅能提高育種篩選效率，為水稻品質(zhì)改良提供豐富的育種材料，而且在挖掘優(yōu)勢基因位點(diǎn)、稻米品質(zhì)遺傳機(jī)理研究上具有重要的作用。

[1]祝詩平，梁晶，屠大偉，等.基于近紅外光譜與DPLS的潲水油快速鑒別方法[J].西南大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，34（5）：1-6.

[2]黃發(fā)松，孫宗修，胡培松，等.食用稻米品質(zhì)形成研究的現(xiàn)狀與展望[J].中國水稻科學(xué)，1998，12（3）：172-176.

[3] Williams P,Preston K,Norris K.Determination of amino acids in wheat and barley by near‐infrared reflectance spectroscopy[J].J Food Sci,1984,49（1）:17-20.

[4] Wu J G,Shi C H.Prediction of grain weight,brown rice weight and amylose content in single rice grains using near-infrared reflectance spectroscopy[J].Field Crop Res,2004,87（1）:13-21.

[5]舒慶堯，吳殿星，夏英武，等.用近紅外反射光譜技術(shù)測定精米粉樣品表觀直鏈淀粉含量的研究 [J].中國水稻科學(xué)，1999，13（3）：189-192.

[6]劉建學(xué)，張玉先，董鐵有，等.大米膠稠度近紅外光譜分析數(shù)學(xué)模型的建立[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2004，20（3）：176-179.

[7]謝新華，李曉方，肖昕.應(yīng)用近紅外透射光譜法測定稻米膠稠度研究[J].中國糧油學(xué)報，2009，24（2）：145-147.

[8] Bao J,Wang Y,Shen Y.Determination of apparent amylose content, pasting properties and gel texture of rice starch by near-infrared spectroscopy[J].J Sci Food Agric,2007,87（11）:2 040-2 048.

[9]畢京翠，張文偉，肖應(yīng)輝，等.應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)分析稻米蛋白質(zhì)含量[J].作物學(xué)報，2006，32（5）：709-715.

[10]吳金紅，張洪江，梅捍衛(wèi)，等.水稻蛋白質(zhì)含量NIR模型適配范圍的研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39（12）：2 435-2 440.

[11]陸艷婷，俞法明，嚴(yán)文潮，等.秈稻品質(zhì)分析的近紅外光譜模型建立及其應(yīng)用研究[J].生物數(shù)學(xué)學(xué)報，2010，25（1）：159-165.

[12]Zhang B,Rong Z Q,Wu J G.Prediction of the amino acid composition in brown rice using different sample status by near-infrared reflectance spectroscopy[J].Food Chem,2011,127（1）:275-281.

[13]吳建國，石春海，張小明，等.用近紅外反射光譜法分析稻米3種必需氨基酸含量的研究[J].作物學(xué)報，2003，29（5）：688-692.

[14]Tian Z X,Qian Q,Liu Q Q,et al.Allelic diversities in rice starch biosynthesis lead to a diverse array of rice eating and cooking qualities[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106（51）:21 760-21 765.

[15]Xu F F,Zhang G,Tong C,et al.Association mapping of starch physicochemical properties with starch biosynthesizing genes in waxy rice（Oryza sativa L） [J].J Agri Food Chem,2013,61（42）: 10 110-10 117.

[16]Zhao W G,Chung J W,Kwon S W,et al.Association analysis of physicochemical traits on eating quality in rice（Oryza sativa L）[J].Euphytica,2013,191（1）:9-21.

[17]Yan C J,TianZ X,Fang Y W,et al.Genetic analysis of starch paste viscosity parameters in glutinous rice（Oryza sativa L）[J].Theor Appl Genet，2011，122（1）：63-76.

[18]邵高能，唐紹清，焦桂愛，等.稻米蒸煮品質(zhì)性狀的QTL定位[J].中國水稻科學(xué)，2009，23（1）：94-98.

Overview of Near Infrared Spectroscopy Application in Quality Measurement and Genetic Analysis of Rice

SUN Yuanyuan1,2,CAI Yicong2,XIE Lihong2,WEI Xiangjin2,JIAO Guiai2,SHEN Zhonghua2,TANG Shaoqing2,HU Peisong2*
（1Hangzhou Normal University,Hangzhou 310000,China;2China National Rice Research Institute,Hangzhou 310006,China;*Corresponding author: hupeisong@cass.cn）

Near infrared spectroscopy technology is an efficient method for detecting chemical constituents of sample,and widely used in the quality component testing and rapid screening of breeding materials,etc.This paper briefly describes the basic principle of the technology,quantitative analysis step and its application in rice quality improvement.Near infrared spectroscopy technology can not only improve the efficiency of breeding selection,but also contributed to a better quality of genetic mechanism research,and accelerate the rice quality improvement process.

near infrared spectrum;correlation analysis;grain quality;improved breeding

O657.3；S511

A

1006-8082（2016）06-0001-03

2016－09－13