玉米品種快速鑒定技術(shù)研究發(fā)展及應(yīng)用

國(guó)以農(nóng)為本，農(nóng)以種為先，培育和生產(chǎn)優(yōu)良種子是種業(yè)核心任務(wù)。目前玉米種子生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)環(huán)節(jié)存在品種間同質(zhì)化、套牌侵權(quán)等問(wèn)題，快速準(zhǔn)確的品種鑒定技術(shù)顯得尤為重要，是保護(hù)種子生產(chǎn)者和用種者合法權(quán)益的關(guān)鍵。

玉米品種鑒定技術(shù)大致可分兩類(lèi)：大田形態(tài)鑒定和室內(nèi)快速鑒定。傳統(tǒng)大田形態(tài)鑒定是以植株和葉、花、果實(shí)、花粉等器官的農(nóng)藝性狀作為觀測(cè)指標(biāo)進(jìn)行鑒別，看似簡(jiǎn)單明了，但在種植過(guò)程中對(duì)栽培技術(shù)、環(huán)境因素有著限制性要求，而且鑒定者的觀測(cè)經(jīng)驗(yàn)也制約著鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。近幾年，大量玉米新品種不斷涌現(xiàn)，相應(yīng)增加了鑒定難度。另外，最難以解決的是這種方法周期長(zhǎng)，沒(méi)有時(shí)效性，往往鑒定結(jié)果出來(lái)了，種子也賣(mài)到了老百姓的手中，甚至有時(shí)生長(zhǎng)季也基本結(jié)束，對(duì)玉米種子質(zhì)量起不到監(jiān)控效果。

室內(nèi)快速鑒定分為品種生化標(biāo)記和分子標(biāo)記兩種技術(shù)。分別在蛋白質(zhì)和分子水平上對(duì)不同遺傳特性的品種予以鑒別?，F(xiàn)就這兩種快速鑒定技術(shù)的基本原理及其在品種真實(shí)性和純度分析上的應(yīng)用概況予以簡(jiǎn)述。

一、生化標(biāo)記鑒定技術(shù)

此項(xiàng)技術(shù)是以品種間生化差異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是蛋白質(zhì)分子水平上的多態(tài)性的直接反映。包括蛋白質(zhì)電泳、同工酶電泳、高效液相色譜和抗體反應(yīng)等方法。其中同工酶電泳、蛋白質(zhì)電泳在玉米品種鑒定和純度檢測(cè)中得到了非常廣泛的應(yīng)用。這種技術(shù)共同的優(yōu)點(diǎn)就是操作簡(jiǎn)單、快速、費(fèi)用低，不需要高精度儀器設(shè)備，便于大規(guī)模的推廣使用。

1.同工酶電泳技術(shù)

不同玉米品種其同工酶的種類(lèi)、數(shù)量、大小有差異，通過(guò)電泳能夠形成不同的酶譜，從而鑒定玉米品種的真實(shí)性和純度。最常用、多態(tài)性較強(qiáng)的是酯酶同工酶和過(guò)氧化物同工酶，這是目前應(yīng)用較多的一種方法，但也有不足之處：一是由于同工酶是基因表達(dá)的最后產(chǎn)物，它不能完全顯示品種間的多態(tài)性，對(duì)于親緣關(guān)系比較密切的自交系及其雜交種難以鑒定。二是技術(shù)有一定的難度，從酶提取到電泳的整個(gè)過(guò)程必須保持較低的環(huán)境溫度，防止酶失去活性。

2.蛋白質(zhì)電泳技術(shù)

不同玉米品種由于遺傳組成不同，其蛋白質(zhì)在種類(lèi)、數(shù)量、大小及結(jié)構(gòu)等方面也不同，這樣就可以通過(guò)電泳形成不同的蛋白質(zhì)譜帶，從而鑒別品種的真實(shí)性和純度，這種方法主要是指聚丙烯酰胺凝膠電泳法，非常成熟而且應(yīng)用廣泛，已經(jīng)在1999年山東省地方標(biāo)準(zhǔn)、2001年農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行推廣。

蛋白質(zhì)電泳技術(shù)是目前玉米品種純度室內(nèi)檢測(cè)使用最普遍的方法。蛋白質(zhì)提取容易，無(wú)須低溫，需時(shí)較短，成分?jǐn)?shù)量穩(wěn)定，不受外界環(huán)境條件影響，不受種植區(qū)域、地力水平的影響，具有較高的準(zhǔn)確性和廣泛的適應(yīng)性。同時(shí)也應(yīng)該注意到，蛋白質(zhì)也是基因分子表達(dá)的產(chǎn)物，并不能完全顯示品種間的多態(tài)性，對(duì)一些親緣關(guān)系近的親本材料和雜交種之間不容易鑒別，限制了部分玉米品種真實(shí)性和純度鑒定，是這種鑒定技術(shù)最大的局限性。

二、品種分子標(biāo)記鑒定技術(shù)

分子標(biāo)記又稱(chēng)DNA指紋鑒定。不同品種的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)不同，其堿基組分、排列序列以及長(zhǎng)度也不相同。它們就像人類(lèi)的指紋一樣，具有專(zhuān)一性和特異性，被形象地稱(chēng)為品種指紋。在玉米品種真實(shí)性、純度鑒定領(lǐng)域，將品種特異性基因片段組合（基因組）作為識(shí)別該品種的指紋，可以鑒別不同的玉米品種。

這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展使得玉米品種真實(shí)性和純度檢測(cè)由大田形態(tài)種植鑒定、生化標(biāo)記鑒定邁入了分子標(biāo)記水平。與前兩種方法相比，品種指紋鑒定不受環(huán)境影響、快速高效，能夠鑒別表型難于區(qū)別的品種。其他特點(diǎn)還包括：（1）可以標(biāo)記的片段數(shù)量極多，遍及整個(gè)基因組，這是同工酶和蛋白質(zhì)電泳技術(shù)無(wú)法比擬的。（2）是直接以基因組形式表現(xiàn)，無(wú)器官的特異性，各個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段均可鑒定。（3）是不受任何客觀因素的影響，有很高的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

品種指紋鑒定技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了三個(gè)重要的階段：20世紀(jì)90年代的第一代標(biāo)記技術(shù)：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記；21世紀(jì)初興起的第二代標(biāo)記技術(shù)：簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記；近幾年啟動(dòng)研究的第三代標(biāo)記技術(shù)：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)標(biāo)記。每種標(biāo)記技術(shù)都在特定時(shí)期內(nèi)對(duì)玉米品種鑒定工作發(fā)揮了一定的作用。

1.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記

這種技術(shù)是利用一種或幾種限制性?xún)?nèi)切酶消化基因分子，通過(guò)合成探針進(jìn)行分子雜交，揭示基因多態(tài)性，能夠區(qū)分不同生物個(gè)體間基因的細(xì)微差異。由于玉米作物不同品種間能夠找到很多標(biāo)記，利用某一品種特定基因可以準(zhǔn)確地標(biāo)記該品種，因而成為玉米品種檢測(cè)有效的手段和方法。其優(yōu)點(diǎn)是多態(tài)性穩(wěn)定，重復(fù)性好，準(zhǔn)確性高，但操作程序煩瑣、周期長(zhǎng)、成本高，且一般的種子檢驗(yàn)部門(mén)不具有放射性同位素標(biāo)記，所以此法不宜在種子生產(chǎn)部門(mén)、經(jīng)營(yíng)部門(mén)普及推廣。

2.隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記

利用隨機(jī)引物對(duì)不同品種的基因組進(jìn)行擴(kuò)增，再經(jīng)電泳得到多態(tài)性的譜帶，從而鑒別不同的品種。具有操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)快捷、基因分子需要量少、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。但由于擴(kuò)增的隨機(jī)性，一個(gè)引物只能檢測(cè)基因組的有限區(qū)域，有些引物不能分開(kāi)親緣關(guān)系很近品種，必須擴(kuò)充引物進(jìn)行區(qū)分。因此，引物的篩選是一個(gè)非常煩瑣而漫長(zhǎng)的操作過(guò)程，在方法推廣使用方面有很大的局限性。

3.擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記

這是基于限制性酶切和擴(kuò)增技術(shù)的標(biāo)記，結(jié)合了兩者的特點(diǎn)，具有很高的可靠性和高效性，適合玉米基因型的指紋鑒定。具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、重復(fù)性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)，但需放射性同位素和高精密的儀器設(shè)備，實(shí)驗(yàn)人員必須具備較高的實(shí)驗(yàn)技能，難以推廣使用。

4.簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記

第二代分子標(biāo)記技術(shù)，又稱(chēng)微衛(wèi)星基因分子標(biāo)記，是一類(lèi)由1～5個(gè)核苷酸組成的短序列首尾相連重復(fù)多次構(gòu)成的一段基因組。基因組經(jīng)特定引物進(jìn)行擴(kuò)增后，不同大小的微衛(wèi)星基因分子在高分辨力的測(cè)序凝膠或特殊瓊脂糖凝膠上電泳，獲得多位點(diǎn)、高分辨率的基因指紋圖譜。

2001年我國(guó)就啟動(dòng)了這項(xiàng)技術(shù)在玉米品種鑒定的研發(fā)工作，隨著技術(shù)成熟，2007年頒布了玉米品種指紋鑒定的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，確定40對(duì)玉米核心引物，同時(shí)建立了有近1.8萬(wàn)個(gè)玉米品種指紋圖譜組成的數(shù)據(jù)庫(kù)，為玉米種子生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)和監(jiān)督管理提供了極大的方便。這種標(biāo)記技術(shù)與其他標(biāo)記技術(shù)相比，使用范圍最廣，其多態(tài)性豐富、信息含量高、分辨率好，具有較高的重復(fù)性；技術(shù)非常成熟，方法簡(jiǎn)便易行，無(wú)須昂貴儀器設(shè)備，利于推廣。但這種標(biāo)記技術(shù)，需要對(duì)位點(diǎn)進(jìn)行分子克隆和分子序列分析，不同平臺(tái)間數(shù)據(jù)不能直接整合比較，需要設(shè)立參照樣品，這也給這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用帶來(lái)了一定的困難。

5.單核苷酸多態(tài)標(biāo)記

第三代分子標(biāo)記技術(shù)，主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的序列多態(tài)性分析，所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及單個(gè)堿基的變異。這種標(biāo)記技術(shù)作為最新的分子標(biāo)記檢測(cè)方法，已被眾多國(guó)際組織，如國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)、國(guó)際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟、國(guó)際種子聯(lián)盟等推薦使用。杜邦先鋒、孟山都和先正達(dá)等國(guó)際一流農(nóng)業(yè)公司也都采用了此標(biāo)記對(duì)內(nèi)部的育種材料和不同品種進(jìn)行分類(lèi)鑒定。2015年農(nóng)業(yè)部印發(fā)《農(nóng)作物品種DNA身份鑒定體系構(gòu)建實(shí)施方案》，標(biāo)志著我國(guó)品種鑒定將采用此項(xiàng)技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)基本可以全程自動(dòng)化操作，但儀器設(shè)備所用資金較大，不利于推廣使用。

三、展望

總體來(lái)看，我國(guó)玉米品種鑒定技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了由田間地頭到實(shí)驗(yàn)臺(tái)、所需時(shí)間由一個(gè)生長(zhǎng)季縮短為幾個(gè)工作日，鑒定對(duì)象由整個(gè)植株微觀到基因分子，技術(shù)的使用也由科研院校普及到廣大種子生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)者，這是了不起的進(jìn)步。上述幾種方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，但是分子標(biāo)記技術(shù)是發(fā)展的大方向，可供選擇多，準(zhǔn)確性高，不受環(huán)境影響等；它也有各種各樣的不足，如所需儀器精密、設(shè)備昂貴、費(fèi)用較高、程序復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員也有很高的技術(shù)要求等。不過(guò)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，隨著品種指紋標(biāo)記技術(shù)的不斷完善，這種先進(jìn)的技術(shù)手段最終會(huì)直接服務(wù)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的各個(gè)方面，為我國(guó)現(xiàn)代種業(yè)發(fā)展保駕護(hù)航。

（胡昕山東省種子管理總站）