惠　勇

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白首烏C21甾苷對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌的保護(hù)作用

惠勇

【摘要】目的探討白首烏C21甾苷對(duì)慢性心力衰竭（CHF）大鼠心肌的保護(hù)作用。方法采用Wistar大鼠建立CHF模型，隨機(jī)分為4組：CHF模型組，給予等體積0.9%氯化鈉注射液灌胃；小劑量組，給予白首烏C21甾苷（0.5 g/kg）；中劑量組，給予白首烏C21甾苷（1.0 g/kg）；大劑量組，給予白首烏C21甾苷（2.0 g/kg） ；另設(shè)假手術(shù)組，給予等體積0.9%氯化鈉注射液。3周后進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)、心臟指數(shù)、微血管密度（MVD）測(cè)量，分別采用Western blot和Real-Time PCR分析檢測(cè)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）蛋白和SDF-1mRNA的表達(dá)。結(jié)果白首烏C21甾苷中、大劑量組大鼠的左心室收縮壓（LVSP）、平均左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率（±dp/dtmax）明顯高于CHF模型組，左心室舒張期末壓（LVEDP）明顯低于CHF模型組，左心室松弛時(shí)間常數(shù)（Tau）明顯短于CHF模型組，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；白首烏C21甾苷劑量組大鼠的SDF-1蛋白及mRNA表達(dá)均明顯高于CHF模型組，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論白首烏C21甾苷能有效改善CHF大鼠心功能，同時(shí)可促進(jìn)新生血管形成，其機(jī)制可能與促進(jìn)SDF-1表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】白首烏C21甾苷；慢性心力衰竭；基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1

牡丹江市第二人民醫(yī)院，黑龍江牡丹江157013

慢性心力衰竭（chronic heart failure,CHF）是一種復(fù)雜而常見的嚴(yán)重心臟功能障礙性疾病，具有發(fā)病率高、臨床治療困難、預(yù)后差和病死率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅人類的生命健康[1]。世界范圍內(nèi)大約有15 億CHF患者，每年新增病例400萬[2]。目前，CHF 是65歲以上老人住院的主要原因[3]。因此，尋找CHF安全有效的治療方法或藥物顯得尤為重要。現(xiàn)代研究表明，白首烏中含有磷脂類、C21酯苷、黃酮類化合物、多糖類及微量元素等多種成分，具有明顯的抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫和抗衰老等多種藥理作用。白首烏C21甾苷能夠清除超氧陰離子自由基和羥自由基，是白首烏中的主要活性成分[4]，但是其對(duì)CHF的影響鮮見報(bào)道。本研究就白首烏C21甾苷對(duì)CHF大鼠心肌的保護(hù)作用進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康清潔級(jí)Wistar系大鼠70只，體重200～250 g，購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為：P00102012，使用許可證號(hào)：SYXK（黑）2012-033。飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境，自由飲食，12 h光照周期。所有實(shí)驗(yàn)操作均遵守《中國動(dòng)物實(shí)用指南》。

1.2提取白首烏C21甾苷采用95%乙醇回流提取白首烏粗粉，減壓回收溶劑得萃取物。萃取物稀釋后使用大孔樹脂（D101）進(jìn)行層析，水和95%乙醇洗脫、收集95%乙醇部分洗脫液；選用薄層色譜法進(jìn)行定性分析；采用紫外-分光光度法測(cè)定C21甾體總苷含量。經(jīng)分析，C21甾苷的可測(cè)成分含量達(dá)65%左右（按孕甾烯醇酮計(jì)）[5]。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1心肌梗死后CHF模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組給予60只Wistar大鼠腹腔注射1.0%戊巴比妥鈉（40 mg/kg），麻醉5～10 min后固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，氣管插管連接呼吸機(jī)行機(jī)械通氣（呼吸頻率每分鐘70次，潮氣量每次6～7 ml），分離右側(cè)頸動(dòng)脈，經(jīng)頸動(dòng)脈行左心室置管，記錄大鼠左心功能變化，選用標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)連接心電圖，并記錄波形。經(jīng)左前胸第3、4肋間開胸，打開心包，擠出大部分心臟，暴露心臟及左心耳[6-7]。于左心耳下方2～3 mm處結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，結(jié)扎后心電圖顯示R波振幅明顯升高，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、avL、avF和V3導(dǎo)聯(lián)ST段弓背向上抬高＞0.2 mV。1周后復(fù)查心電圖出現(xiàn)病理性Q波表示心肌梗死模型制作成功，心肌梗死4周后，超聲心動(dòng)圖檢測(cè)顯示左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）≤45%，說明CHF模型成功建立[8]。術(shù)后常規(guī)抗感染治療。共成功建立CHF模型34只，隨機(jī)分為4組：CHF模型組（n=8），給予等體積0.9%氯化鈉注射液；白首烏C21甾苷小劑量組（n=8），給予白首烏C21甾苷（0.5 g/kg）；白首烏C21甾苷中劑量組（n=9），給予白首烏C21甾苷（1.0 g/kg）；白首烏C21甾苷大劑量組（n=9），給予白首烏C21甾苷（2.0 g/kg）；另設(shè)假手術(shù)組（n=10），開胸后在左冠狀動(dòng)脈前降支下方只穿線不結(jié)扎，其余方法與模型建立相同，給予等體積0.9%氯化鈉注射液灌胃。各組均為每天1次灌胃，共3周。

1.3.2血流動(dòng)力學(xué)測(cè)量用藥3周后采用BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）測(cè)量大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)。大鼠腹腔注射1.0%戊巴比妥鈉40 mg/kg，麻醉5～10 min后固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，分離右頸總動(dòng)脈1.5 cm，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，經(jīng)頸動(dòng)脈插入導(dǎo)管至左心室，通過壓力感受器與軟件相連，5 min后，將導(dǎo)管插入左心室腔。主要參數(shù)包括：心率（HR）、左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張期末壓（LVEDP）、平均左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率（±dp/dtmax）；以Weiss公式計(jì)算左心室松弛時(shí)間常數(shù)（Tau）。

1.3.3心臟指數(shù)測(cè)量檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)和超聲心動(dòng)圖后，稱取大鼠體重（BW），斷頸處死，取出心臟。4℃ 0.9%氯化鈉注射液沖洗，濾紙吸干。剪去心房和血管組織，稱取全心質(zhì)量（HW），從心室處沿室間隔剪開，稱取左心室質(zhì)量（LVM），計(jì)算心臟指數(shù)：全心質(zhì)量指數(shù)=HW/BW；左心室質(zhì)量指數(shù)=LVW/BW；左心室心重比=LVW/HW。

1.3.4微血管密度（MVD）測(cè)量心室肌組織標(biāo)本4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、HE染色，顯微鏡觀察。首先選擇低倍視野下觀察微血管最為豐富處，以管腔內(nèi)見紅細(xì)胞為判斷標(biāo)準(zhǔn)，然后隨機(jī)選擇3個(gè)高倍視野進(jìn)行拍照。Image-pro Plus 6.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)，取其平均值。MVD=血管數(shù)/mm2。

1.3.5Western blot分析心室肌組織標(biāo)本在蛋白酶抑制劑存在下勻漿，以獲得蛋白提取物，Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。取20 μg蛋白質(zhì)加入等體積2×上樣緩沖液，95 ℃變性5 min。隨后進(jìn)行7.5% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。電泳后，電轉(zhuǎn)至0.45 μm硝酸纖維素膜，用5%脫脂奶粉PBST（25 mM Tris pH=7.5,150 mM NaCl,0.1% Tween 20）封閉1 h，分別加入抗基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1,SDF-1）抗體（1:2000稀釋）4℃孵育過夜，PBST洗滌3次，每次5 min。加入HRP標(biāo)記的2抗（1:2000稀釋）室溫孵育2 h，PBST洗滌3次，每次5 min。按同樣的方法與GAPDH抗體孵育。ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，通過Bio-Rad凝膠成像法檢測(cè)SDF-1的表達(dá)。蛋白的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度=目標(biāo)蛋白表達(dá)強(qiáng)度三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）蛋白表達(dá)強(qiáng)度。

1.3.6Real-Time PCR分析按照TRIzol試劑盒說明書抽提總RNA，采用Nanodrop2000檢測(cè)RNA純度。使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Reverse Transcriptase kit promega,Japan）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)成單鏈cDNA，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。利用Pubmed查找相關(guān)基因序列，并利用引物合成軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。使用Quant SYBR Green PCR kit按照PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，用Applied Biosystems 7500型定量PCR儀測(cè)出ΔC值及熔解曲線，計(jì)算出相對(duì)基因表達(dá)量。每份樣品檢測(cè)3次。

表1　Real-Time PCR序列

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果與假手術(shù)組大鼠比較，CHF模型組大鼠的LVSP、+LVdP/dtmax、-LVdP/dtmax均明顯低于假手術(shù)組，LVEDP明顯高于假手術(shù)組，Tau明顯長于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而CHF模型組和假手術(shù)組大鼠的HR差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；白首烏C21甾苷中、大劑量組大鼠的LVSP、+LVdP/dtmax、-LVdP/dtmax明顯高于CHF模型組，LVEDP明顯低于CHF模型組，Tau明顯短于CHF模型組，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

表2　白首烏C21甾苷對(duì)CHF大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響(±s)

表2　白首烏C21甾苷對(duì)CHF大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響(±s)

注：與假手術(shù)組比較，＊P＜0.05；與CHF模型組比較，＃P＜0.05；與中劑量組比較，$P＜0.05

組別 　例數(shù) HR(次/min) LVSP(mmHg) LVEDP(mmHg)假手術(shù)組 　10 　427±87 　150±41 　2.9±0.7 CHF模型組 　8 　410±85 　121±33＊　9.4±2.1＊小劑量 　8 　424±87 　123±32 　8.9±1.7中劑量 　9 　426±87 　142±36?！?.7±1.5＃大劑量 　9 　420±86 　148±37＃$　3.6±1.1＃$組別 　例數(shù) +LVdP/dtmax(mmHg/s) -LVdP/dtmax(mmHg/s) 　Tau(ms)假手術(shù)組 　10 　4717±868 　-4281±531 　5.6±1.7 CHF模型組 　8 　2913±446＊　-2534±381＊17.3±4.2＊小劑量 　8 　3021±579 　-2775±396 　16.3±4.0中劑量 　9 　4056±717?！?3876±503＃10.8±3.4＃大劑量 　9 　4172±726＃$　-4035±521＃$　8.2±2.6＃$

2.2心臟指數(shù)測(cè)量結(jié)果CHF模型組大鼠的HW/BW、LVW/BW、LVW/HW均明顯高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；白首烏C21甾苷中、大劑量組大鼠的HW/BW、LVW/BW、LVW/HW均明顯低于CHF模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），但白首烏C21甾苷中、大劑量組大鼠的HW/BW、LVW/BW、LVW/HW差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3　白首烏C21甾苷對(duì)CHF大鼠心臟指數(shù)的影響(±s)

表3　白首烏C21甾苷對(duì)CHF大鼠心臟指數(shù)的影響(±s)

注：與假手術(shù)組比較，＊P＜0.05；與CHF模型組比較，＃P＜0.05

組別 　　例數(shù)　HW/BW 　LVW/BW LVW/HW(g/g)假手術(shù)組 　10 　0.69±0.19 　0.26±0.071 0.18±0.043 CHF模型組　 8 　0.74±0.20＊0.29±0.078＊0.21±0.058＊小劑量 　 8 0.73±0.20 　0.29±0.072 0.21±0.055中劑量 　 9 　0.71±0.19＃0.27±0.068＃0.18±0.044＃大劑量 　 9 　0.70±0.181＃0.27±0.063＃0.18±0.040＃

2.3MVD測(cè)量結(jié)果CHF模型組大鼠的MVD明顯低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；白首烏C21甾苷中、大劑量組大鼠的MVD明顯高于CHF模型組，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表4。

表4　白首烏C21甾苷對(duì)CHF大鼠MVD的影響(±s)

表4　白首烏C21甾苷對(duì)CHF大鼠MVD的影響(±s)

注：與假手術(shù)組比較，＊P＜0.05；與CHF模型組比較，＃P＜0.05；與中劑量組比較，$P＜0.05

組別 　　例數(shù) 　MVD(血管數(shù)/mm2)假手術(shù)組 　10 　0.170±0.042 CHF模型組 　 8 　0.018±0.005＊小劑量 　 8 　0.027±0.006中劑量 　 9 　0.150±0.037＃大劑量 　 9 　0.170±0.040＃$

2.4Western blot結(jié)果CHF模型組大鼠的SDF-1蛋白表達(dá)略微升高；白首烏C21甾苷劑量組大鼠的SDF-1蛋白表達(dá)均明顯高于CHF模型組，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖1。

圖1　白首烏C21甾苷對(duì)CHF大鼠SDF-1蛋白的影響

2.5Real-Time PCR結(jié)果CHF模型組大鼠的SDF-1mRNA表達(dá)略微升高；白首烏C21甾苷各劑量組大鼠的SDF-1 mRNA表達(dá)均明顯高于CHF模型組，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖2。

圖2　白首烏C21甾苷對(duì)CHF大鼠SDF-1 mRNA的影響

3　討論

CHF是各種心臟疾病的終末階段，此時(shí)心臟功能變化主要表現(xiàn)為心臟收縮功能明顯下降，心室舒張功能及心室順應(yīng)性發(fā)生改變，心臟泵血功能與泵功能儲(chǔ)備均降低，血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)出現(xiàn)異常，進(jìn)而使心功能降低[9]。本研究結(jié)果表明，白首烏C21甾苷可明顯升高CHF模型組大鼠LVSP、+LVdP/dtmax、-LVdP/dtmax，降低LVEDP，縮短Tau，說明其可明顯改善CHF大鼠的心功能；心臟指數(shù)測(cè)量結(jié)果表明，白首烏C21甾苷可明顯降低CHF模型組大鼠的HW/BW、LVW/BW、LVW/HW，說明其可減輕CHF大鼠心肌肥厚。

同時(shí)，本研究還證實(shí)白首烏C21甾苷可升高M(jìn)VD，說明其可增加新生血管形成。為了闡明白首烏C21甾苷促進(jìn)新生血管形成的可能機(jī)制，本研究對(duì)SDF-1的表達(dá)水平進(jìn)行了分析。SDF-1最初是從鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞中分離出來的，廣泛表達(dá)于多種組織、器官、系統(tǒng)，主要表達(dá)于心臟、腦、肝和腎臟等[10]。在胚胎發(fā)育過程、造血、血管發(fā)生、心臟發(fā)生、白細(xì)胞亞群和內(nèi)皮細(xì)胞的趨化作用中起重要的生理和病理作用。CHF發(fā)生后，SDF-1在介導(dǎo)干細(xì)胞向心臟遷移和受損心臟的修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用，如將攜帶SDF-1基因的質(zhì)粒輸送至損傷心肌附近，可誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞遷移，可明顯增強(qiáng)骨髓干細(xì)胞向梗死心肌遷移，募集干/祖細(xì)胞動(dòng)員至缺血組織，誘導(dǎo)新生血管形成[11-12]。本研究Western blot結(jié)果表明，CHF模型組大鼠較假手術(shù)組SDF-1表達(dá)水平略升高，其屬于機(jī)體對(duì)不良刺激的一種應(yīng)激調(diào)節(jié)反應(yīng)，當(dāng)這種應(yīng)激調(diào)節(jié)不能夠完全對(duì)抗外來損傷刺激時(shí)，勢(shì)必造成進(jìn)一步損傷。給予白首烏C21甾苷干預(yù)后，SDF-1表達(dá)水平明顯升高，且與劑量呈正相關(guān)，與CHF模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步采用RT-PCR分析，SDF-1mRNA表達(dá)明顯升高，結(jié)果與Western blot分析結(jié)果相似，說明白首烏C21甾苷可升高SDF-1表達(dá)水平，誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞的遷移，從而促進(jìn)CHF大鼠新生血管形成。

終上所述，白首烏C21甾苷有效改善CHF大鼠心功能。同時(shí)可促進(jìn)新生血管形成，其機(jī)制可能與促進(jìn)SDF-1表達(dá)有關(guān)。至于白首烏C21甾苷是否通過其他機(jī)制發(fā)揮防治CHF機(jī)制，如對(duì)CD34+細(xì)胞的影響，需進(jìn)一步探討。

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The Protective Effect of Baishouwu C21Steroidal Glycosides on Myocardium in Chronic Heart Failure Rats

Hui Yong

【Abstract】ObjectiveTo investigate the study of C21steroidal glycoside of cynanchum auriculatum on the myocardial protective effect and angiogenesis in chronic heart failure(CHF)rat model and discuss its possible mechanism. MethodsCHF Wistar rats models were established and rats were randomly divided into four groups:CHF model group was administered equal volume of normal saline orally;Low-dose group was administered orally C21steroidal glycoside of cynanchum auriculatum according to 0.5 g/kg;Middle-dose group was administered orally C21steroidal glycoside of cynanchum auriculatum according to 1.0 g/kg;High-dose group was administered orally C21steroidal glycoside of cynanchum auriculatum according to 2.0 g/kg;Another sham group was administered equal volume of normal saline orally.after 3 weeks,Hemodynamics,cardiac index and microvessel density(MVD) were measured. Western blot and Real-Time PCR were used to detect the expression of stromal cell derived factor-1(SDF-1)protein and mRNA.ResultsBaishouwu C21steroidal glycosides and high dose group rats left ventricular systolic pressure (LVSP),mean left ventricular pressure maximum rise and decline rate(±dp/dtmax) was significantly higher than that of the CHF model group,left ventricular diastolic end pressure(LVEDP) was significantly lower than that of the CHF model group,left ventricular relaxation time constant(Tau) was significantly shorter than that of CHF model group,and showed dose dependent,the differences were statistically significant (P＜0.05);Baishouwu C21steroidal glycosides dose group rats SDF-1 protein and mRNA expression were significantly higher than those in the CHF model group, and there was a dose dependent,differences were statistically significant(P＜0.05).ConclusionBaishouwu C21steroidal glycosides effectively improve heart function of CHF rats.At the same time,it can promote the formation of new blood vessels.The mechanism may and promote the expression of SDF-1.

【Key words】C21steroidal glycoside of cynanchum auriculatum;Chronic heart failure;Angiogenesis;Stromal cell derived factor-1

作者簡介：惠勇，副主任醫(yī)師，副教授。研究方向：心血管疾病

【中圖分類號(hào)】R285.5

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.02.003