李天芝，于新友，王金良，沈志強(qiáng)

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

禽呼腸孤病毒分子生物學(xué)診斷技術(shù)及基因工程疫苗的研究進(jìn)展*

李天芝1，于新友1，王金良2，沈志強(qiáng)2

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

本文綜述了禽呼腸孤病毒分子生物學(xué)診斷方法，主要包括核酸探針、RT-PCR方法、套式RT-PCR方法、多重RT-PCR方法、熒光定量RT-PCR方法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法等6種方法，并就其基因工程疫苗方面的研究進(jìn)行了著重闡述，對(duì)禽呼腸孤病毒病的診斷和防控有一定的參考價(jià)值。

禽呼腸孤病毒；分子生物學(xué)診斷；基因工程疫苗

禽呼腸孤病是由呼腸孤病毒引起的一類禽類傳染病，其臨床表現(xiàn)因毒株和感染宿主的不同而不同[1]。雞感染禽呼腸孤病毒臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎、腱鞘炎、呼吸道病、腸道病、矮小綜合征和吸收障礙綜合征等[2]。引起鴨發(fā)病的呼腸孤病毒有新型鴨呼腸孤病毒(Noval duck reovirus，NDRV)和番鴨呼腸孤病毒(Muscovy duck reovirus，MDRV)，鴨感染后主要臨床表現(xiàn)為軟腳、腹瀉等，有的能夠引起高達(dá)98%的死亡率，病理變化則主要以肝、脾灰白色局灶性壞死為特征[3]。引起鵝發(fā)病的呼腸孤病毒為鵝呼腸孤病毒(Goose reovirus，GRV)，雛鵝感染后也可表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎，病理變化主要是肝、脾壞死和心內(nèi)膜部分出血等，該病給世界養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。1954年，F(xiàn)ahey和Craloley首次從慢性呼吸道疾病的雞呼吸道內(nèi)分離到禽呼腸孤病毒[5]，此后，英國(guó)、美國(guó)、意大利等相繼報(bào)道了禽呼腸孤病毒感染引起的疾病，20世紀(jì)80年代我國(guó)出現(xiàn)禽呼腸孤病毒引起的疾病相關(guān)報(bào)道。本文就近年來(lái)禽呼腸孤病毒的分子生物學(xué)診斷方法及基因工程疫苗研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為禽呼腸孤病的快速診斷和防控提供參考。

1 分子生物學(xué)診斷

1.1 核酸探針 核酸探針是定性或定量檢測(cè)特異RNA或DNA序列的技術(shù)，它具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果易于判定等優(yōu)點(diǎn)，適合在基層推廣使用。Liu等[6]通過(guò)地高辛標(biāo)記建立的cDNA探針技術(shù)，最低可檢測(cè)0.78ng的禽呼腸孤病毒RNA，該法不僅能定位感染組織中的禽呼腸孤病毒，還能在臨床癥狀出現(xiàn)前檢測(cè)到禽呼腸孤病毒，具有較高的靈敏性。謝芝勛等[7]用地高辛標(biāo)記的禽呼腸孤病毒S1 cDNA制備探針，建立了檢測(cè)禽呼腸孤病毒的方法，結(jié)果顯示，該探針能與禽呼腸孤病毒不同毒株核酸抽提物起特異性雜交反應(yīng)，而與對(duì)雞傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒、新城疫病毒、大腸桿菌、正常雞胚尿囊液抽提的核酸及載體PBluescript空質(zhì)粒DNA的雜交反應(yīng)均為陰性，該探針對(duì)禽呼腸孤病毒RNA的最低檢出量為0.45ng。

1.2 RT-PCR方法 RT-PCR是以病毒的RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再以PCR進(jìn)行核酸擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)病毒的方法，以其簡(jiǎn)便、迅速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)在動(dòng)物疾病診斷上得到了廣泛的應(yīng)用。Lee等[8]根據(jù)禽呼腸孤病毒S3基因，設(shè)計(jì)引物，建立了檢測(cè)禽呼腸孤病毒的RT-PCR方法，該法可擴(kuò)增大小為672bp目的片段，最低能檢測(cè)到0.2pg禽呼腸孤病毒RNA模板，通過(guò)印跡轉(zhuǎn)移后雜交還可將靈敏度提高到0.04pg?？棕S等[9]參考GenBank上登錄的NDRV S3基因保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，建立了檢測(cè)NDRV的RT-PCR方法，結(jié)果顯示，該方法僅能從NDRV分離毒中擴(kuò)增到與預(yù)期大小相符、長(zhǎng)度為298bp的特異性目的片段，檢測(cè)靈敏度達(dá)到83.4pg病毒RNA，而對(duì)番鴨呼腸孤病毒、禽呼腸孤病毒、鴨病毒性肝炎病毒、鴨瘟病毒、鴨新城疫病毒和禽流感病毒等樣品的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。葉偉成等[10]根據(jù)經(jīng)典和新型水禽呼腸孤病毒σA基因的保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，建立了番鴨呼腸孤病毒通用RT-PCR檢測(cè)方法，可擴(kuò)增出大小為436bp目的條帶，其最低病毒檢出量為3.6TCID50，對(duì)鴨甲肝病毒、鴨瘟病毒、新城疫病毒、坦布蘇病毒、番鴨細(xì)小病毒、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒和H9N2亞型禽流感病毒擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。于新友等[11]根據(jù)禽呼腸病毒P10基因保守序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，建立了檢測(cè)禽呼腸病毒的一步法RTPCR方法，并對(duì)其特異性、敏感性進(jìn)行了研究，該一步法RT-PCR對(duì)禽呼腸病毒擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性，對(duì)照毒株擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，對(duì)禽呼腸病毒檢測(cè)的靈敏性為10pg總RNA。

1.3 套式RT-PCR方法 套式RT-PCR是使用兩對(duì)PCR引物擴(kuò)增完整的片段，以第一對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪擴(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)的特異性更好，敏感性也更高。Liu等[12]發(fā)明了一種用套式RT-PCR擴(kuò)增σC編碼基因，然后進(jìn)行限制性內(nèi)切酶分析的診斷禽呼腸孤病毒感染的方法，普通RT-PCR可檢測(cè)到100-10-1TCID50的病毒核酸，而用Southern雜交法可檢測(cè)到 10-1-10-2TCID50的病毒核酸，當(dāng)使用套式PCR引物時(shí)，敏感性可增加大約103～104倍。畢研麗等[13]根據(jù)GenBank中登錄的ARV基因組序列，設(shè)計(jì)合成了2對(duì)引物，建立了適合禽呼腸孤病毒快速檢測(cè)的套式RT-PCR方法，外部引物的擴(kuò)增片段大小為478bp，內(nèi)部引物的擴(kuò)增片段大小為247bp。采用該方法對(duì)禽呼腸孤病毒株進(jìn)行了檢測(cè)，均能擴(kuò)增到247bp的條帶，而禽流感病毒(H9亞型)、新城疫病毒、傳染性腔上囊病病毒、減蛋綜合征病毒、禽白血病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒、馬立克病病毒和鴨瘟病毒的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。該方法第1次擴(kuò)增的敏感性是100pg，第2次擴(kuò)增的敏感性是1fg，第2次比第1次擴(kuò)增的敏感性高105倍。

1.4 多重RT-PCR方法 多重RT-PCR是在常規(guī)RT-PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，在同一PCR體系中，加入多對(duì)引物，同時(shí)檢測(cè)2種或多種病原核酸，它具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于各種臨床疾病的快速診斷。張琳等[14]禽呼腸孤病毒、禽流感病毒、新城疫病毒和雞傳染性支氣管炎病毒的基因保守區(qū)設(shè)計(jì)了4對(duì)特異性引物，建立了針對(duì)四種病毒的多重PCR檢測(cè)體系，該體系擴(kuò)增的禽呼腸孤病毒、禽流感病毒、新城疫病毒和雞傳染性支氣管炎病毒四種病毒基因片斷大小分別為199、264、362和459bp，且特異性、敏感性良好，最低可分別檢測(cè)1pg、10pg、10pg和10pg的RNA量。孫曉軍等[15]據(jù)鴨甲肝病毒的3D基因序列和NDRV的S3基因序列，分別設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，通過(guò)條件優(yōu)化建立了鑒別鴨甲肝病毒和NDRV的復(fù)合RT-PCR方法。該方法對(duì)鴨甲肝病毒和NDRV的最低檢出量均為100copies，而對(duì)番鴨呼腸孤病毒、鴨瘟病毒、鴨坦布蘇病毒和鴨副粘病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

1.5 熒光定量RT-PCR方法 實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種高度靈敏的核酸定量技術(shù)，它融匯了傳統(tǒng)PCR技術(shù)靈敏、快速、特異的特點(diǎn)以及光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量的優(yōu)點(diǎn)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。韓宏宇等[16]建立了NDRV基于SYBR GreenⅠ的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。該方法最低可檢出15個(gè)拷貝的病毒cDNA，其病毒最低檢出量為0.5TCID50。該方法具有良好的特異性，對(duì)鴨坦布蘇病毒、A型鴨甲肝病毒、C型鴨甲肝病毒、番鴨呼腸孤病毒、減蛋綜合征病毒、鴨新城疫病毒、鴨瘟病毒、鴨疫里默氏桿菌的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。該方法重復(fù)性好，組內(nèi)變異系數(shù)為0.32%～0.91%，組間變異系數(shù)為1.03%～1.51%。李天芝等[17]利用RTPCR技術(shù)擴(kuò)增出禽呼腸孤病毒 S1基因中 298bp的保守序列，并克隆到pMD18-T載體中作為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立了ARV的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測(cè)方法。該方法檢測(cè)靈敏度可達(dá)4.8×101拷貝，與NDV、AIV、IBV、IBDV、ALV、REV均不發(fā)生交叉反應(yīng)，具有良好的特異性和重復(fù)性。

1.6 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)方法是日本學(xué)者Notomi等發(fā)明的一項(xiàng)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、快速、高效、敏感、特異、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，特別適合在現(xiàn)場(chǎng)和基層部門(mén)應(yīng)用。馬利等[18]建立了一種基于熒光顯色的禽呼腸孤病毒LAMP檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法使用針對(duì)禽呼腸孤病毒的p10基因8個(gè)區(qū)域的6條LAMP引物，能夠在63℃恒溫條件下1h內(nèi)完成反應(yīng)，具有良好的敏感性和特異性，最低能夠檢出102個(gè)拷貝的病毒，敏感性比普通PCR高100倍，而對(duì)其他病毒檢測(cè)結(jié)果為陰性。在熒光顯色中分別應(yīng)用SYBR GreenⅠ和鈣黃綠素作為顯色劑，其結(jié)果與瓊脂糖凝膠電泳一致。于可響等[19]建立適于基層實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)NDRV的一步RT-LAMP方法?；谛滦网喓裟c孤病毒S3基因的6個(gè)保守區(qū)域設(shè)計(jì)了4條LAMP引物，利用Bst DNA聚合酶在63℃恒溫保持45min即可完成反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)，由此建立了RT-LAMP檢測(cè)方法。該方法具有良好的特異性，除NDRV外對(duì)其他6種常見(jiàn)鴨病的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。該方法對(duì)病毒RNA的最低檢出量為 0.1pg，是常規(guī) RT-PCR方法的 100倍。臨床應(yīng)用結(jié)果表明，該方法與病毒分離鑒定方法的符合率為98%。

2 基因工程疫苗

2.1 亞單位疫苗 只含有病原微生物的抗菌抗原成分，而不含有核酸，但能刺激機(jī)體產(chǎn)生特應(yīng)性免疫應(yīng)答的一類疫苗，稱為亞單位疫苗。凌珊珊等[20]構(gòu)建了禽呼腸孤病毒σC基因的原核表達(dá)載體pET32a-σC，成功表達(dá)了重組蛋白σC，純化后，進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，并用S1133毒株進(jìn)行攻毒，結(jié)果顯示，σC蛋白刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體同商品化S1133全病毒滅活苗的效果大致相當(dāng)。Kuntz-Simon等[21]將桿狀病毒中表達(dá)的σC蛋白，隔3周免疫2次，攻毒后發(fā)現(xiàn)可以部分甚至完全防止臨床癥狀的出現(xiàn)，而且免疫后可以減少呼腸孤病毒導(dǎo)致的腱炎和心包炎的產(chǎn)生。徐延偉等[22]根據(jù)已公布的禽呼腸孤病毒S1133毒株σC基因克隆至pPIC9K酵母表達(dá)載體當(dāng)中，成功構(gòu)建了重組酵母菌株pPIC9K-σC/GS115。將畢赤酵母表達(dá)的重組σC蛋白用法國(guó)佐劑乳化后，免疫3周齡SPF雞，并進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，該重組σC蛋白可以阻止ARV在體內(nèi)的復(fù)制，且能夠?qū)Ω腥静《具M(jìn)行清除。吳曉平等[23]將番鴨呼腸孤病毒σC與σB基因的重組大腸桿菌 pET-30a-S3/BL21和 pET-30a-S4ORF2/BL21，分別成功表達(dá)出重組蛋白σC與σB，將DRVσB蛋白、DRVσC蛋白、DRVσB+σC蛋白分別免疫雛番鴨，并設(shè)PBS對(duì)照組和攻毒對(duì)照組，攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示使用原核表達(dá)的番鴨呼腸孤病毒外殼蛋白σC與σB制備油乳劑，聯(lián)合免疫可誘導(dǎo)雛番鴨快速產(chǎn)生一定效價(jià)的抗體，并提供良好的免疫保護(hù)力。

2.2 核酸疫苗 構(gòu)建含有外源抗原基因的重組質(zhì)粒，免疫動(dòng)物后，表達(dá)的特異性抗原蛋白通過(guò)與MHC-Ⅰ類或MHC-Ⅱ類抗原分子結(jié)合，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，該類疫苗稱為核酸疫苗，又名DNA疫苗。謝志勤等[24]構(gòu)建含禽呼腸孤病毒S1133毒株的σ3基因重組質(zhì)粒pcDNA3.1-σ3，免疫7日齡SPF雛雞，同時(shí)設(shè)滅活S1133、表達(dá)σ3蛋白及生理鹽水對(duì)照，二次加強(qiáng)免疫兩周后，用S1133毒株進(jìn)行攻毒，結(jié)果表明，pcDNA3.1-σ3處理、滅活S1133處理、表達(dá)σ3蛋白處理和生理鹽水處理的病毒檢出率分別為7.4%、3.7%、11.1%和29.6%，pcDNA-σ3處理與生理鹽水處理的差異顯著(P＜0.05)，但與滅活S1133處理、表達(dá)σ3蛋白處理的差異不顯著(P＞0.05)。蔣慷慨等[25]成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒 pCIS3和 pCIS4ORF2，分別以pCIS3、pCIS4ORF2、pCIS3+pCIS4ORF2，100μg的免疫劑量分別肌肉注射免疫2日齡番鴨，對(duì)照番鴨則以PBS肌肉注射免疫。首次免疫1周后以相同劑量和途徑加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫后1周后用TCID50為10-7.1934/0.1ml病毒液肌肉注射攻毒，攻毒量為：0.2ml/只，結(jié)果顯示，所有免疫組在加強(qiáng)免疫后攻毒前抗體均轉(zhuǎn)陽(yáng)，攻毒后pCIS3+pCIS4ORF2聯(lián)合免疫組可對(duì)免疫番鴨形成100%完全保護(hù)，pCIS3免疫組可對(duì)免疫番鴨形成 80%保護(hù)，pCIS4ORF2免疫組對(duì)免疫番鴨形成90%保護(hù)。

2.3 活載體疫苗 采用弱毒或無(wú)毒病原微生物作為表達(dá)載體，對(duì)其導(dǎo)入外源抗原基因，制成疫苗后，接種動(dòng)物，誘導(dǎo)機(jī)休產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，這類新型疫苗稱為活載體疫苗。萬(wàn)俊杰等[26]構(gòu)建了能表達(dá)禽呼腸孤病毒σB、σC基因的重組減毒沙門(mén)氏菌SL7207(pVAX-σB)、SL7207(pVAX-σC)、SL7207(pVAXAB-σB-σC)，并分別以 1.0× 109CFU的劑量每隔2周免疫雛雞3次，設(shè)空質(zhì)粒和PBS組作，結(jié)果顯示，首免后2周SL7207 (pVAX-σC)與空質(zhì)粒SL7207(pVAX1)以及PBS對(duì)照組相比產(chǎn)生了較高的血清抗體IgG(P＜0.05)，而SL7207(pVAXAB-σB-σC)與空質(zhì)粒以及PBS對(duì)照組相比產(chǎn)生了較高水平的粘膜抗體IgA(P＜0.01)，各疫苗免疫組在二免后第二周均能產(chǎn)生較高的血清抗體IgG和粘膜抗體IgA，SL7207(pVAX-σC)與其它免疫組相比差異顯著(P＜0.01)，到三免后第二周各組抗體水平進(jìn)一步升高，其中SL7207(pVAX-σC)與SL7207(pVAXAB-σB-σC)組較其它組產(chǎn)生了較高的血清抗體和粘膜抗體水平(P＜0.01)。王存?zhèn)サ葘W(xué)者[27]成功構(gòu)建了介導(dǎo)禽呼腸孤病毒。σC基因疫苗的重組減毒沙門(mén)氏菌株，制備出禽呼腸孤病毒。σC基因疫苗，應(yīng)用于雛雞，以1.0×l09CFU劑量1次免疫6口齡雛雞，并于2周后進(jìn)行二免，結(jié)果顯示，免疫2周后，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生ARVσC蛋白的特異血清IgG抗體，差異顯著(P＜0.01)，二免后3周進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，保護(hù)率可達(dá)66.7%，重組減毒沙門(mén)氏菌株對(duì)雛雞具有良好的免疫原性和安全性。

3 小結(jié)與展望

想成功的控制和清除禽呼腸孤病毒的感染，需要采用常規(guī)監(jiān)測(cè)和疾病診斷相結(jié)合的方法，雖然禽呼腸孤病毒分子生物學(xué)鑒別診斷方法有很多，但各有利弊，常規(guī)RT-PCR方法雖然檢測(cè)速度快、特異性強(qiáng)，但不能準(zhǔn)確的定量，且敏感性有限。熒光定量 RT-PCR方法雖然克服了常規(guī)RT-PCR的缺陷，但儀器和探針的合成價(jià)格昂貴，檢測(cè)成本比較高，不適合大面積推廣應(yīng)用。LAMP方法雖然簡(jiǎn)單、方便，適合基層進(jìn)行推廣應(yīng)用，但靈敏度太高，易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。因此，對(duì)于所有的情況和動(dòng)物，目前仍沒(méi)有一種監(jiān)測(cè)技術(shù)是100%可靠的，近年來(lái)，各國(guó)專家、學(xué)者對(duì)禽呼腸孤病毒基因工程疫苗進(jìn)行了一定的探索和研究，并取得了一定的成績(jī)，但各種新型疫苗都有其自身的缺陷和不足，如亞單位疫苗當(dāng)前沒(méi)有獲得自然形態(tài)的蛋白，抗原獲得困難。核酸疫苗可能存在基因突變或整合到宿主基因組的危險(xiǎn)。活載體疫苗可以引起炎癥反應(yīng)。相信隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展和新技術(shù)的引入，一些檢測(cè)速度快、結(jié)果準(zhǔn)確、價(jià)廉的檢測(cè)方法將會(huì)被建立，安全、高效、易于保存和運(yùn)輸?shù)男滦突蚬こ桃呙绫貙⒀兄瞥晒?，從而最大程度的預(yù)防或控制禽呼腸孤病毒病的爆發(fā)流行。

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Q789

：A

：1673-1085（2016）05-0014-05

2016-04-09

山東省現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-13-011-10)；山東省省級(jí)引進(jìn)國(guó)外智力項(xiàng)目。作者簡(jiǎn)介：于新友(1983-)，男，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事動(dòng)物傳染病診斷及防控研究。