莊金秋，張穎，梅建國(guó)，王艷，苗立中

(山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

鴨病毒性肝炎病毒檢測(cè)方法研究進(jìn)展*

莊金秋，張穎，梅建國(guó)，王艷，苗立中

(山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

本文綜述了鴨病毒性肝炎病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展，主要包括病毒分離與鑒定、血清學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)方法，著重介紹了目前廣泛應(yīng)用的中和試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、凝集試驗(yàn)、熒光抗體試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)及RT-PCR、熒光定量RT-PCR技術(shù)等，比較了各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)和實(shí)用性，并對(duì)鴨病毒性肝炎病毒檢測(cè)新技術(shù)進(jìn)行了展望。

鴨病毒性肝炎病毒；檢測(cè)；研究進(jìn)展

鴨病毒性肝炎 （Duck viral hepatitis，DVH）俗稱(chēng) “背脖病”，是由鴨病毒性肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV）引起雛鴨的一種急性、高度致死性、病毒性傳染病。本病以發(fā)病急、傳播快、病程短、死亡率高為主要特征，臨床表現(xiàn)痙攣、抽搐和角弓反張等神經(jīng)癥狀，病理變化以肝腫大和出血為特征性病變。本病呈世界性分布，主要侵害4周齡以?xún)?nèi)的雛鴨，1周齡內(nèi)的雛鴨死亡率可高達(dá)95%以上，嚴(yán)重影響著養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展。過(guò)去曾將DHV分為3個(gè)血清型，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。目前已證實(shí)DHV-Ⅰ屬于小RNA病毒科；而DHV-Ⅱ和DHV-Ⅲ均屬于禽星狀病毒。小RNA病毒科血清Ⅰ型可分為3個(gè)基因型，分別為基因Ⅰ型 （傳統(tǒng)DHV-Ⅰ型）、基因Ⅱ型（臺(tái)灣型）、基因Ⅲ型（韓國(guó)N-DHV型）。中國(guó)主要流行傳統(tǒng)DHV-Ⅰ型及新型（New serotype duck hepatitis virus，N-DHV）型，二者之間無(wú)抗原相關(guān)性，沒(méi)有交叉免疫保護(hù)和交叉中和作用。本病全年均可發(fā)生，同時(shí)由于血清型變異呈現(xiàn)的上升趨勢(shì)，給疾病的診斷和防治帶來(lái)了困難，給養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本文綜述了DHV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法研究進(jìn)展，以期為疾病的快速診斷及預(yù)防和控制提供參考。

1 病毒分離與鑒定

病毒的分離培養(yǎng)是對(duì)DHV經(jīng)常使用的鑒定方法。DHV分離技術(shù)主要有細(xì)胞培養(yǎng)、鴨胚（或雞胚）尿囊腔接種和動(dòng)物接種三種方法。在細(xì)胞培養(yǎng)方面，國(guó)外許多學(xué)者報(bào)道該病毒能在雞胚成纖維細(xì)胞、鴨胚成纖維細(xì)胞、鴨胚肝細(xì)胞、鴨胚腎細(xì)胞和雞胚腎細(xì)胞等多種原代細(xì)胞中生長(zhǎng)增殖。Kaeberle等[1]（1988）用北京鴨腎細(xì)胞成功地培養(yǎng)的DHV，黃新民等[2]（1994）則在鴨胚肝細(xì)胞上成功的培養(yǎng)出了DHV。由于各毒株毒力強(qiáng)弱和對(duì)細(xì)胞的適應(yīng)性程度不同，因此DHV在細(xì)胞上可輕微產(chǎn)生或不產(chǎn)生細(xì)胞病變。病毒初代分離一般使用鴨胚，在鴨胚中連續(xù)傳幾代后，容易在雞胚中增殖。死亡鴨胚特征主要表現(xiàn)皮膚出血，水腫，侏儒癥，肝臟腫大變綠，并有壞死灶。在隨后的傳代中，病死率上升，死亡特征更加明顯。收集死胚尿囊液，可通過(guò)電鏡技術(shù)及中和試驗(yàn)等方法對(duì)DHV進(jìn)行鑒定。王平等[3]（1980）在DHV病例的肝細(xì)胞中看到過(guò)病毒顆粒，呈類(lèi)晶格狀排列，顆粒近似圓形，直徑在35～40nm。程安春等[4]（1994）用膠體金免疫電鏡技術(shù)和直接電鏡（DEM）、免疫電鏡（IEM）比較觀察DHV，結(jié)果顯示膠體金免疫電鏡技術(shù)比DEM、IEM清晰，具有直觀、靈敏的特點(diǎn)，但對(duì)設(shè)備的要求很高，現(xiàn)主要用于科研，臨床診斷受到限制。

2 血清學(xué)方法

2.1 中和試驗(yàn) 中和試驗(yàn)是檢測(cè)DHV最經(jīng)典、可靠的方法，是目前公認(rèn)的權(quán)威方法。我國(guó)各地對(duì)DVH的確診及DHV血清型的判定大多采用此法。病毒中和實(shí)驗(yàn)通常在雞胚上以固定血清-稀釋病毒法進(jìn)行，也有人利用鴨胚、雛鴨或病毒適應(yīng)細(xì)胞中進(jìn)行中和試驗(yàn)。Hwang等[5]（1966）對(duì)中和試驗(yàn)中的孵育、溫度、病毒量等的最佳條件進(jìn)行研究，認(rèn)為被檢血清在56℃條件下滅活30min，、病毒與血清的混合液在接8日齡雞胚前37℃水浴40min可以提高檢出率。Kaeberle等[1]用北京鴨腎細(xì)胞培養(yǎng)的DHV進(jìn)行微量中和試驗(yàn)，既快速又易于判定。陳琨等[6]（1996）在從鴨胚得到高純度病毒的基礎(chǔ)上，建立了DHV-Ⅰ微量中和試驗(yàn)，用于免疫監(jiān)測(cè)以及抗體的消長(zhǎng)規(guī)律的測(cè)定，比一般的鴨胚中和試驗(yàn)更靈敏、更準(zhǔn)確。秦智鋒[7]（2002）等用雞胚和雛鴨進(jìn)行中和試驗(yàn)，成功制定了DVH的檢疫和診斷方法。Tseng等[8]（2007）用血清交叉中和實(shí)驗(yàn)成功鑒別了DHV-Ⅰ與N-DHV。中和試驗(yàn)雖是普遍認(rèn)同的權(quán)威方法，但其工作煩瑣，費(fèi)時(shí)，不能用于快速診斷，不適于基層推廣。

2.2 凝集試驗(yàn)

2.2.1 間接血凝與血凝抑制試驗(yàn) 近年來(lái)，間接血凝試驗(yàn)（IHA）經(jīng)過(guò)不斷改進(jìn)后已廣泛應(yīng)用于檢測(cè)血清中各種病原的抗體，與ELISA相比，IHA操作過(guò)程簡(jiǎn)便、快速且不需要特殊儀器。Taylor等[9]（1967）首先報(bào)道了純化的細(xì)胞增殖的DHV-Ⅰ被鞣酸化的綿羊紅細(xì)胞致敏后進(jìn)行的間接血凝抑制試驗(yàn)。Vashhenko等[10]（1982）檢驗(yàn)了間接血凝試驗(yàn)診斷DHV-Ⅰ的效果，表明間接血凝試驗(yàn)與中和試驗(yàn)的結(jié)果符合率為90%。國(guó)內(nèi)羅函祿等[11]（1990）率先報(bào)道了應(yīng)用純化的病毒抗原進(jìn)行間接血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)DHV抗原研制成功。孫泉云等[12]（1996）用間接血凝抑制試驗(yàn)與中和試驗(yàn)比較，陽(yáng)性結(jié)果符合率為84.6%。陶海靜等[13]（2007）將純化的DHV-Ⅰ致敏雙醛化紅細(xì)胞制備檢測(cè)DHV抗體的間接血凝診斷抗原，檢測(cè)敏感性是瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的32～64倍，可用于疫苗免疫后抗體水平的檢測(cè)及DVH的流行病學(xué)調(diào)查。由于受非特異性凝血因子影響，以及不同批次制備的紅細(xì)胞在敏感性和穩(wěn)定性方面有波動(dòng)，限制了IHA方法的推廣應(yīng)用。

2.2.2 協(xié)同凝集試驗(yàn) 汪銘書(shū)等[14]（1996）應(yīng)用葡萄球菌A蛋白協(xié)同凝集試驗(yàn) （SPA-CoA）檢測(cè)DHV，對(duì)用DHV攻擊死亡的雛鴨肝臟中的病毒檢出率為100%。表明SPA-CoA可用于檢測(cè)含DHV的病料，具有良好的敏感性和特異性。但此試驗(yàn)對(duì)于抗原濃度、純度要求很高，限制了實(shí)際應(yīng)用。

2.3 乳膠凝集試驗(yàn) 劉利芳[15]（2008）用純化的抗DHV抗體致敏乳膠成功地建立了反向乳膠凝集試驗(yàn)檢測(cè)DHV抗原的方法。應(yīng)用結(jié)果表明，抗體致敏乳膠無(wú)自凝性，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，質(zhì)量可靠。同時(shí)，其利用競(jìng)爭(zhēng)凝集的原理，采用純化的抗DHV-Ⅰ抗體致敏乳膠與待測(cè)血清抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合最小抗原量，建立了競(jìng)爭(zhēng)乳膠凝集試驗(yàn)檢測(cè)病毒抗體的方法，該方法對(duì)抗原純度要求不是很高，避開(kāi)了DHV難以純化的問(wèn)題。試驗(yàn)結(jié)果表明，最小抗原量為0.02mg/ml。該方法不與其它病原反應(yīng)，阻斷效果明顯，檢測(cè)DHV-Ⅰ抗體可達(dá)1：800，比AGP試驗(yàn)高50倍。表明競(jìng)爭(zhēng)乳膠凝集法檢測(cè)DHV-Ⅰ抗體特異性高、敏感性強(qiáng)、重復(fù)性好、質(zhì)量穩(wěn)定、結(jié)果可靠，適合于臨床流行病學(xué)調(diào)查。

2.4 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP） Murty等[16]（1961）首次報(bào)道了應(yīng)用AGP鑒定DHV-Ⅰ，以感染雞胚組織制備的抗原與兔抗DHV血清進(jìn)行AGP，18～24h時(shí)有沉淀線(xiàn)產(chǎn)生。孫泉云等[17]（1998）建立了AGP試驗(yàn)并檢測(cè)了DHV抗原。許偉琦等[18]（1997）試驗(yàn)表明，在瓊脂中加入2%PEG能加快反應(yīng)速度，24h即能作結(jié)果判定，而且提高了沉淀線(xiàn)清晰度，而原來(lái)要48h以上才能判定結(jié)果。DHV為無(wú)囊膜病毒，張濟(jì)培等[19]（2002）用不同的鴨肝炎病料，通過(guò)氯仿去脂和反透析法進(jìn)行病毒的提純濃縮，然后應(yīng)用AGP試驗(yàn)對(duì)DHV抗原和抗體進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示用抗原檢測(cè)抗體或用抗體（血清）檢測(cè)病毒抗原，均可達(dá)到80%的檢出率。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)最佳的凝膠配方為pH為7.2，NaCl為8%和瓊脂糖含量為1%，病雛鴨肝濃縮抗原最為理想。AGP試驗(yàn)簡(jiǎn)便易行，但其特異性與靈敏度還有待提高，且AGP試驗(yàn)對(duì)抗原和抗體的要求嚴(yán)格，檢測(cè)的DHV抗原需經(jīng)濃縮純化，判定結(jié)果的時(shí)間也較長(zhǎng)，因此在臨床中較難推廣。

2.5 熒光抗體試驗(yàn) Maiborda等[20]（1972）報(bào)道，快速準(zhǔn)確診斷DVH的方法是接種雛鴨采用直接熒光抗體試驗(yàn)。我國(guó)郭玉璞等[21]（1984）應(yīng)用間接熒光抗體（IFA）檢測(cè)證實(shí)了北京地區(qū)流行的DVH由DHV-I引起。劉建[22]（2004）采用感染N-DHV強(qiáng)毒后死亡的鴨的腎細(xì)胞做滴片進(jìn)行熒光染色，檢測(cè)到病毒抗原存在，為臨床上快速診斷N-DHV感染提供了一種檢測(cè)方法。陳海軍[23]（2007）建立了檢測(cè)石蠟組織切片中的DHV-I抗原的IFA抗體方法。免疫熒光抗體試驗(yàn)雖然具有快速、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)， 但其費(fèi)用和對(duì)設(shè)備的要求很高，因此目前基層很少應(yīng)用該法進(jìn)行DHV的檢測(cè)。

2.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 盡管病毒中和試驗(yàn)是目前公認(rèn)的檢測(cè)DHV最權(quán)威的方法，但相比ELISA試驗(yàn)，在敏感性和特異性等方面均表現(xiàn)出其劣勢(shì)。ELISA敏感、快速，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于DVH診斷。隨著研究深入，國(guó)內(nèi)外學(xué)者以原有技術(shù)為基礎(chǔ)，相繼建立了更加準(zhǔn)確、敏感的檢測(cè)DHV的ELISA方法，為鴨抗DHV血清抗體的檢測(cè)以及進(jìn)行DHV單克隆抗體的篩選提供了依據(jù)。

2.6.1 間接ELISA 間接ELISA法檢測(cè)DHV抗體特異性高、敏感性強(qiáng)、重復(fù)性好、質(zhì)量穩(wěn)定、結(jié)果可靠，適合于臨床流行病學(xué)調(diào)查。孫泉云等[24]（1997）最先以蔗糖密度梯度離心法純化的病毒作包被抗原，建立了檢測(cè)DHV抗體的間接ELISA方法。經(jīng)特異性及重復(fù)性試驗(yàn)，效果良好。楊萍萍等[25]（2004）以氯仿去脂-濾膜過(guò)濾-濃縮層析方法純化病毒作包被抗原，建立了檢測(cè)雞抗DHV-I型血清抗體的間接ELISA法，經(jīng)交叉試驗(yàn)和阻斷試驗(yàn)表明，該方法具有很高的敏感性和特異性，應(yīng)用于DHV抗體檢測(cè)比較有效。劉利芳[15]（2008）用純化的DHV作為包被抗原和HRP酶標(biāo)記的兔抗番鴨二抗，成功地建立了檢測(cè)DHV抗體的間接ELISA法。檢測(cè)DHV抗體可達(dá)1：800，靈敏度比AGP試驗(yàn)高50倍。馮廣鵬[26]（2009）將通過(guò)鴨胚傳代的病毒經(jīng)過(guò)純化后，作為包被抗原，建立了一種檢測(cè)血清中 DHV抗體的間接 ELISA方法。Liu等[27]（2010）建立了VP1-ELISA檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)VP1蛋白的表達(dá)，其方法是用包被的抗原來(lái)檢測(cè)鴨的DHV-Ⅰ抗體水平。與病毒的中和試驗(yàn)相比，VP1-ELISA不與其他病原體產(chǎn)生交叉反應(yīng)，特異性和敏感性分別達(dá)到了92.5%和96.7%，更適用于臨床大量樣品的檢測(cè)。孫鳳萍等[28]（2011）將離心純化后的病毒作為ELISA包被抗原，建立了檢測(cè)DHV-I全病毒的間接ELISA方法，可以用于快速診斷DHV病毒感染。馬秀麗等[29]（2008）以純化的重組蛋白為抗原建立間接ELISA方法并初步應(yīng)用于臨床?；谌《窘⒌腅LISA方法因DHV純化比較困難而限制了該方法的推廣應(yīng)用。而本研究中利用大腸桿菌表達(dá)的VP1重組蛋白作為抗原建立的間接ELISA方法具有較好的敏感性，通過(guò)對(duì)80份血清樣品的檢測(cè)表明，該方法與中和試驗(yàn)的符合率為97.5%，表明其可用于雛鴨母源抗體和免疫后抗體的消長(zhǎng)變化的檢測(cè)。

2.6.2 斑點(diǎn)ELISA 自以硝酸纖維素膜為固相載體建立斑點(diǎn)ELISA（Dot-ELISA）以來(lái)，因硝酸纖維素膜吸附能力強(qiáng)，樣品用量少，用離子型去污劑溶解的抗原亦可吸附等優(yōu)點(diǎn)而使得此方法迅速得以推廣。國(guó)內(nèi)外已有許多用以檢測(cè)DHV抗原抗體的報(bào)道。范偉興等[30]（1991）首次建立了單克隆抗體Dot-ELISA法檢測(cè)DHV。楊奎等[31]（1996）采用過(guò)碘酸鈉法將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記在純化的DHV上，將待檢血清點(diǎn)樣到硝酸纖維素膜上，用酶標(biāo)記DHV建立了Dot-ELISA來(lái)檢測(cè)DHV抗體，取得了良好的結(jié)果。由此建立了檢測(cè)DHV抗體的斑點(diǎn)ELISA方法，與間接 ELISA方法的符合率達(dá)100%。嚴(yán)亞賢等[32]（2000）將病鴨的肝臟勻漿凍融后點(diǎn)于硝酸纖維素膜，建立了檢測(cè)DHV抗原的Dot-ELISA。馬秀麗等[33]（2004）采用過(guò)碘酸鈉法以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記純化的DHV-I單克隆抗體，建立了Dot-EL1SA方法。對(duì)病毒尿囊液的最低檢出范圍為1：16，而對(duì)肝臟病料的最低檢出范圍為1：160，可用于臨床發(fā)病鴨的檢測(cè)。黃艷艷等[34]（2007）提取和純化了鴨瘟病毒（DPV）和DHV的抗原作為Dot-ELISA的膜載抗原，以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鴨IgG作為ELISA反應(yīng)的第二抗體，建立了能夠同時(shí)檢測(cè)DPV和DHV抗體的Dot-ELISA方法。Dot-ELISA方法快速、敏感，且結(jié)果肉眼可見(jiàn)，不需要特殊的讀取設(shè)備，同間接ELISA方法相比較，成本低，是一種適用于小型檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室使用的大規(guī)模樣品檢測(cè)技術(shù)。但Dot-ELISA法也有其缺點(diǎn)，用它檢測(cè)DHV易受組織中色素的干擾，而且單抗的供應(yīng)尚未商業(yè)化，其推廣受到限制。

2.6.3 夾心ELISA 范偉興等[35]（1991）首次報(bào)道了DHV單克隆抗體的研制成功，并用單抗建立了夾心ELISA法來(lái)檢測(cè)DHV-I，此法能夠靈敏地檢測(cè)病毒樣品。后經(jīng)各國(guó)學(xué)者應(yīng)用借鑒并逐漸完善了此類(lèi)診斷技術(shù)。韓永俊[36]（2007）建立了直接檢測(cè)DHV抗原的夾心ELISA法，比AGP敏感64倍，具有較好的特異性和敏感性。

2.6.4 單克隆抗體捕捉法 ELISA 孫泉云等[37]（1997）將單抗的高度特異性與ELISA的高度靈敏性結(jié)合起來(lái)，以DHV單克隆抗體包被反應(yīng)板，以粗提病毒作為抗原，建立了檢測(cè)DHV抗體的單抗捕捉法ELISA方法。經(jīng)與間接ELISA作平行試驗(yàn)，二者檢測(cè)符合率為100%。由于單克隆抗體能特異性地捕捉DHV抗原，即使使用粗制抗原（甚至是尿囊液毒）也能克服非特異性反應(yīng)，顯示出間接ELISA法無(wú)可替代的優(yōu)勢(shì)，因此該方法的優(yōu)點(diǎn)在于可免去DHV-I的復(fù)雜提純工作，便于推廣應(yīng)用。

2.7 膠體金技術(shù) 程安春等[4]（1994）將DHV-I樣品與兔抗DHV-I抗體混合作用后13000r/min離心，取沉淀用雙蒸水懸浮后加入膠體金羊抗兔IgG，37℃作用30min，再次離心取沉淀用雙蒸水懸浮，滴于銅網(wǎng)，用3%、pH6.5～7.0的磷鎢酸負(fù)染，干燥后鏡檢。結(jié)果在電鏡視野中觀察到大量的單個(gè)DHV病毒粒子。表明膠體金免疫電鏡技術(shù)可用于檢測(cè)DHV-I，而且具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、直觀等特點(diǎn)，但膠體金法成本高，限制了該方法的推廣應(yīng)用。張小飛等[38]（1997）用膠體金標(biāo)記提純后的兔抗DHV的IgG，建立了一種以微孔濾膜為固相載體，以紅色膠體金為標(biāo)記物來(lái)檢測(cè)DHV的斑點(diǎn)免疫金滲濾法（DIGFA）。該法既可定性，亦可定量，對(duì)純化DHV的最小檢測(cè)量為4.12ng/點(diǎn)，其敏感性為抗原斑點(diǎn)試驗(yàn)（AST）的2倍。特異性阻斷試驗(yàn)和交叉反應(yīng)試驗(yàn)證明用DIGFA檢測(cè)DHV具有較高特異性。對(duì)DHV雞胚尿囊液的檢出率為100%，對(duì)36份臨床樣本檢測(cè)的陽(yáng)性率為83.3%。但是目前在應(yīng)用DIGFA法檢測(cè)肝臟等病料時(shí)，因有血色素在濾膜上沉淀，嚴(yán)重干擾了結(jié)果判定。

2.8 免疫組化法 免疫組織化學(xué)法是用標(biāo)記的特異性抗體（或抗原）對(duì)組織內(nèi)抗原（或抗體）的分布進(jìn)行定性、定位的一種檢測(cè)方法，經(jīng)過(guò)組織化學(xué)的顯色反應(yīng)呈現(xiàn)醒目的陽(yáng)性色彩，用顯微鏡、熒光顯微鏡或電子顯微鏡觀察。張小飛等[39]（2005）以鼠抗DHV抗體為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，建立了檢測(cè)石蠟切片中DHV抗原的免疫酶組化法，并以此對(duì)人工感染雛鴨的不同組織器官中的DHV做精確定位和分布測(cè)定，為探討DVH的致病機(jī)理提供依據(jù)。陳海軍[23]（2007）以蔗糖密度梯度離心提純的DHV-I免疫兔制備兔抗DHVI抗體，建立了檢測(cè)石蠟組織切片中DHV-I抗原的間接免疫酶染色法（IIS），并對(duì)DHV-I強(qiáng)毒人工感染死亡或?yàn)l死雛鴨的各個(gè)組織器官進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明該IIS法具有良好的特異性，為DHV-I感染的實(shí)驗(yàn)室診斷、感染鴨體內(nèi)DHV-I抗原亞細(xì)胞定位的研究提供了有效的檢測(cè)手段。

3 分子生物學(xué)方法

3.1 RT-PCR PCR具有靈敏度高、快速、特異、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，隨著人們對(duì)DHV基因組序列的不斷研究，RT-PCR已被廣泛應(yīng)用于DHV病原的檢測(cè)。Kim等[40]（2006）、馬秀麗等[41]（2006）、程安春等[42]（2007）、華炯鋼等[43]（2007）、張麗等[44]（2008）、關(guān)育芳等[45]（2008）、劉艷萍等[46]（2008）、邵澤香等[47]（2009）、Cheng等[48]（2009）、鈕慧敏等[49]（2011）先后根據(jù)DHV保守區(qū)設(shè)計(jì)物，建立了檢測(cè)DHV-Ⅰ型的RT-PCR方法。為DHV-Ⅰ的分離鑒定、臨床病料的檢測(cè)和分子流行病學(xué)調(diào)查奠定了基礎(chǔ)，也為有效防治DVH提供了科學(xué)依據(jù)，同時(shí)對(duì)減少經(jīng)濟(jì)損失也具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 何冉婭等[50]（2009）、宋永峰等[51]（2009）、魏雪濤等[52]（2010）先后建立了DHV-Ⅰ型和N-DHV型的鑒別RT-PCR檢測(cè)方法，為兩種病毒的鑒別診斷提供了可靠的理論依據(jù)。

3.2 套式RT-PCR 羅玉均等[53]（2007）、蒙秋[54]（2007）、黃顯明等[55]（2008）、黃成斌等[56]（2009）、李嬌等[57]（2011）先后建立了檢測(cè)DHV-I的套式RTPCR方法，可用于DVH-I的早期診斷、臨床病料檢測(cè)和分子流行病學(xué)調(diào)查等。陳琳琳[58]（2013）、柴順秀等[59]（2013）、李嬌等[60]（2013）先后建立了DHV-Ⅰ型和N-DHV型的鑒別雙重RT-PCR檢測(cè)方法可用于DHV的快速分型和鑒別檢測(cè)。

3.3 熒光定量RT-PCR 羅玉均等[61]（2008）建立了檢測(cè)DHV-I的SYBR GreenⅠ熒光定量RTPCR方法。楊苗[62]（2009）根據(jù)DHV-I 3D區(qū)域序列設(shè)計(jì)引物和TaqMan TM探針，建立了熒光定量RT-PCR方法。應(yīng)用該方法對(duì)DHV-I強(qiáng)毒在鴨胚內(nèi)的分布規(guī)律和弱毒在雞胚內(nèi)的分布規(guī)律進(jìn)行了研究，定量檢測(cè)人工感染DHV-I的雛鴨體內(nèi)病毒動(dòng)態(tài)分布情況，定量檢測(cè)感染DHV-I強(qiáng)毒后耐過(guò)雛鴨的病毒排泄規(guī)律，并對(duì)四川部分鴨場(chǎng)的健康鴨群和養(yǎng)鴨環(huán)境進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查。

3.4 PCR-ELISA 劉艷萍[63]（2014）、耿昕穎等[64]（2016）先后根據(jù)DHV-I VP1基因，設(shè)計(jì)合成生物素及地高辛標(biāo)記的引物及探針，成功建立DHV PCRELISA檢測(cè)方法，其敏感度比常規(guī)PCR高100倍。該P(yáng)CR-ELISA方法具有特異、敏感、安全的特點(diǎn)，為DVH的流行病學(xué)研究及病原檢測(cè)提供了新的途徑。

3.5 其它生物學(xué)方法 在PCR檢測(cè)法不斷創(chuàng)新的同時(shí)，其他分子生物學(xué)的方法也不斷推出。楊奎[31]（1996）利用構(gòu)建的 DHV cDNA文庫(kù)制備了cDNA探針，用于檢測(cè)DHV，其敏感性比Dot-ELISA高200倍，探針能與DHV不同毒株的核酸雜交，病毒檢出量達(dá)lpg水平。Huang等[65]（2011）建立了基于橢圓偏振法的生物傳感器檢測(cè)DHV-I病毒的新型方法。它將DHV-I的多克隆抗體固定后，通過(guò)一種蛋白質(zhì)來(lái)捕獲樣品中的病毒顆粒。檢測(cè)結(jié)果顯示這種技術(shù)較傳統(tǒng)檢測(cè)方法更加便捷、敏感，在 DHV檢測(cè)上有很好的應(yīng)用前景。Song等[66]（2012）通過(guò)使用DHV-I高保守的3D基因，建立了逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù) （RT-LAMP），對(duì)DHV-I病毒的檢出量是1.45pgRNA。同時(shí)證實(shí)了使用RT-LAMP檢測(cè)出的受感染樣品中DHV-I RNA的安全性很高。RT-LAMP檢測(cè)方法具有高靈敏度、特異性、快速且容易肉眼觀察到最終產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn)，它的建立為檢測(cè)和監(jiān)督DHV-1病毒提供了新方法。董航等[67]（2016）建立了檢測(cè)DHV的核酸序列依賴(lài)性擴(kuò)增技術(shù)（NASBA），相對(duì)于常規(guī)的RT-PCR方法，NASBA檢測(cè)不需要擴(kuò)增儀且用時(shí)更短，實(shí)際操作也更易被人們接受，也便于其在基層推廣。該方法為DVH的診斷提供了新的技術(shù)支持。

4 前景與展望

DVH致病性高，傳播速度快，是20世紀(jì)以來(lái)危害雛鴨最為嚴(yán)重的傳染病之一，給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。通過(guò)疫苗接種雛鴨可避免該病的發(fā)生，如果已經(jīng)發(fā)病可用高免血清或高免卵黃抗體進(jìn)行治療，可有效控制病情。有效地防控DVH的暴發(fā)與蔓延關(guān)鍵在于早期快速、敏感和特異的診斷，但近年來(lái)我國(guó)DHV-I及其變異株廣泛流行，給疾病防控診斷帶來(lái)了很大困難。綜上所述，可用于DVH診斷的方法雖很多，然而目前公認(rèn)的最常用、最可靠的實(shí)驗(yàn)室診斷方法仍屬中和試驗(yàn)。但因其操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)、成本高，不能用于快速診斷，故不適于基層的推廣應(yīng)用。由于DHV抗原提純困難，許多實(shí)驗(yàn)室診斷方法難以得到實(shí)際應(yīng)用，如IHA、AGP等。免疫熒光抗體檢測(cè)雖然具有快速、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，但因其對(duì)費(fèi)用和設(shè)備的要求高，臨床上難以推廣。ELISA法雖有簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但仍需進(jìn)一步提高抗原純度，加速單克隆抗體的研發(fā)，并使之商業(yè)化。近年來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)，特別是PCR及熒光定量PCR技術(shù)得到了飛速發(fā)展，已被廣泛應(yīng)用于DHV病原的檢測(cè)。相信隨著DHV全基因序列的破譯，通過(guò)分子生物學(xué)研究，將基因工程技術(shù)運(yùn)用到免疫學(xué)檢測(cè)方法中，加快開(kāi)發(fā)建立和制定行之有效的標(biāo)準(zhǔn)化免疫診斷程序，建立一套完整、有效、快速的檢測(cè)方法將會(huì)作為以后DHV流行病學(xué)檢測(cè)和診斷的主要方法，具有更為廣闊的應(yīng)用前景和理想價(jià)值，從而促進(jìn)我國(guó)DVH防控事業(yè)的健康、快速、持續(xù)發(fā)展。

1～67省略，如有需要請(qǐng)與雜志社聯(lián)系）。

S858.324.4+3

A

1673-1085（2016）09-0052-05

2016-08-20

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目 （SDAIT-11-16）；濱州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2015ZC0109）

莊金秋（1978-），女，山東濰坊人，獸醫(yī)碩士，副研究員，主要從事細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物用病毒疫苗研制。