陳虞超，聶峰杰，張麗，鞏檑，甘曉燕，石磊，宋玉霞

（寧夏農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川，750002）

馬鈴薯X病毒研究進(jìn)展

陳虞超，聶峰杰，張麗，鞏檑，甘曉燕，石磊，宋玉霞

（寧夏農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川，750002）

從PVX的發(fā)生與分布、基因組結(jié)構(gòu)與功能、檢測(cè)方法、防治技術(shù)和應(yīng)用研究方面進(jìn)行了綜述，同時(shí)對(duì)PVX的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望，旨在為PVX的深入研究提供參考。

馬鈴薯X病毒；分布與發(fā)生；基因結(jié)構(gòu)與功能；檢測(cè)方法；防治技術(shù)

馬鈴薯X病毒（Potato virus X，PVX）又稱馬鈴薯潛隱病毒 （Potato latent virus）或馬鈴薯輕花葉病毒（Potato mild mosaic virus）， 為馬鈴薯 X病毒屬（Potexvirus）模式成員，是由一條正鏈RNA組成的線性病毒，RNA長(zhǎng)約6.4 kbp，病毒粒子呈長(zhǎng)桿狀，長(zhǎng)×寬=515 nm×13 nm。自然條件下主要靠寄主植株不同部位、寄主植株之間接觸摩擦進(jìn)行機(jī)械傳播。PVX單獨(dú)侵染時(shí)癥狀較輕，與馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）、煙草脈斑駁病毒 （Tobacco vein mottling virus，TVMV）、煙草蝕紋病毒 （Tobacco etch virus，TEV）等馬鈴薯Y病毒屬病毒復(fù)合侵染時(shí)癥狀加劇，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1～3]。目前有關(guān)PVX的分布與發(fā)生、基因組結(jié)構(gòu)和功能、檢測(cè)方法、防控技術(shù)以及生產(chǎn)應(yīng)用等方面的研究均取得顯著進(jìn)展。本文對(duì)上述研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，探討其中尚存在的問題，以期為深入開展PVX相關(guān)研究提供一定參考。

1 PVX的發(fā)生與分布

所有馬鈴薯 （Solanum tuberosum）產(chǎn)區(qū)均存在PVX發(fā)生的現(xiàn)象，但不同栽培品種受PVX侵染情況存在較大差異，有些品種帶毒率較高。在田間，PVX侵染馬鈴薯植株，引起輕型花葉或者潛隱病征，若多年侵染則易引起重花葉或者植株矮化，造成10%～ 80%減產(chǎn)。PVX常與PVY復(fù)合侵染，使癥狀加劇[4～6]。PVX主要靠汁液接觸傳播，也可以由某些昆蟲如異黑蝗（Melanoplus differentialis）和綠叢螽斯（Tettigonia viridissima）的咀嚼式口器經(jīng)機(jī)械作用傳播，菟絲子（Cuscuta campestris） 和集合油壺菌（Synchytium endobiotcum）也能夠傳播該病毒，但實(shí)生種子不能傳毒[7]。PVX寄主范圍較廣，可侵染16科240種植物，茄科植物是主要的寄主，其診斷寄主有白肋煙（White burley）及其他煙草（Nicotiana tabacum）品種。初侵染的葉片通常表現(xiàn)為壞死斑，之后發(fā)展為壞死斑駁、褪綠、花葉或脈褪綠。在曼陀羅（Datura stramonium）上繼斑駁之后產(chǎn)生褪綠環(huán)，脈褪綠或脈壞死。煙草栽培品種適于作繁殖寄主。千日紅（Gomphrena globosa）是較好的指示植物，除HB株系外都產(chǎn)生局部斑[8，9]。

對(duì)于PVX株系的分類還未有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，但Cockerham[10]的方法認(rèn)可度較高，該方法根據(jù)PVX侵染攜帶不同抗病基因（Nx和Nb）的馬鈴薯植株所表現(xiàn)出的癥狀，將PVX株系分為4組，分別是X1、X2、X3和X4。X1組（如CS35株系）在含Nx、Nb基因的馬鈴薯上均能引起過敏反應(yīng) （Hypersensitive resistance，HR）。X2組（如CP株系）只在含Nb基因的馬鈴薯上引起HR。X3組（如UK3、DX株系）只在含有Nx基因的馬鈴薯上引起HR。X4組（如DX4、CP4、HB株系）則能完全克服Nx、Nb抗性。許多研究表明，PVX的外殼蛋白（Coat protein，CP）基因在決定PVX與植物抗病基因互作方面起著重要作用。CP可作為激發(fā)子使馬鈴薯產(chǎn)生 HR、ER （極端抗病性，extremeresistance，ER）反應(yīng)，CP基因核苷酸序列的變化會(huì)導(dǎo)致寄主產(chǎn)生不同的癥狀類型。因此，PVX的CP基因序列分析也有助于對(duì)PVX的分類研究[11～16]。

2 PVX的基因組結(jié)構(gòu)與功能

PVX基因組由一條單組分的正單鏈RNA分子組成，長(zhǎng)度約6.4 kbp。RNA的5′-末端有m7GpppA帽子結(jié)構(gòu)，3′-末端有1個(gè)poly（A）尾結(jié)構(gòu)，共包含5個(gè)開放式閱讀框（Open reading frane，ORF）。ORF1編碼166 kDa的 RNA依賴的 RNA聚合酶 （RNA-dependent RNA polymerase，RdRp），是 PVX合成RNA必需的，也是唯一來源于自身的蛋白。中間的ORF2、ORF3、ORF4相互重疊，被稱為三基因區(qū)段（Triple-gene block，TGB），分別編碼25 kDa的TGBp1蛋白、12 kDa的TGBp2蛋白、8 kDa的TGBp3蛋白，這些蛋白與病毒在寄主細(xì)胞間的移動(dòng)有關(guān)，其中，TGBp1蛋白已經(jīng)被證明是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默的抑制因子，可打破寄主植物的防御反應(yīng)，使病毒成功侵染。3′-末端的ORF5編碼25 kDa的病毒外殼蛋白（Capsid protein，CP），除具有包裝核酸的功能外，也是病毒在細(xì)胞間移動(dòng)所必需的，而且還能起到復(fù)制調(diào)節(jié)的作用[17～19]。

另外，PVX基因組還包括5′-末端非翻譯區(qū)域（5′-Untranslational region，5′-UTR）和3′-端非翻譯區(qū)域 （3′-Untranslational region，3′-UTR）。5′-UTR有84個(gè)核苷酸（nt），已有的研究表明，5′-UTR對(duì)于病毒的復(fù)制、細(xì)胞與細(xì)胞間的移動(dòng)以及病毒的組裝等有重要作用[20～23]。3′-UTR有72個(gè)核苷酸，含有多種重疊的作用元件，其中包括1個(gè)富含U的八核苷酸序列，對(duì)于病毒RNA與寄主蛋白之間的互作以及病毒的增殖起著重要作用[24]。

3 PVX的檢測(cè)方法

PVX的檢測(cè)方法較多，主要包括指示植物檢測(cè)法、電鏡檢測(cè)法、免疫學(xué)檢測(cè)法和核酸介導(dǎo)的分子生物學(xué)檢測(cè)法。

3.1 指示植物檢測(cè)法

指示植物檢測(cè)法是利用指示植物被PVX侵染后所表現(xiàn)出的特異癥狀，來檢測(cè)PVX是否存在。指示植物檢測(cè)法簡(jiǎn)便可行，對(duì)儀器設(shè)備要求較低，可迅速掌握利用。吳凌娟等[9]用多種指示植物分離鑒定了PVX，結(jié)果發(fā)現(xiàn)千日紅發(fā)病時(shí)間短、易觀察，比較適合作為PVX檢測(cè)的指示植物。常用于檢測(cè)PVX的指示植物還包括白花刺果曼陀羅（Datura metel）、心葉煙（Nicotiana glutinosa）等。但指示植物檢測(cè)法耗時(shí)較長(zhǎng)，受環(huán)境影響較大，準(zhǔn)確性和靈敏度不高，已不作為PVX檢測(cè)和鑒定的主要方法，多用于分子生物學(xué)或免疫學(xué)檢測(cè)之前的初步鑒定[25]。

3.2 電鏡檢測(cè)法

電鏡檢測(cè)法是開展植物病毒研究的常規(guī)手段之一，主要是通過觀察病毒粒子形態(tài)、內(nèi)含物、亞結(jié)構(gòu)等方面的特征來確定病毒的種類。電鏡的分辨率可達(dá)到0.5 nm，比指示植物法更直觀、速度更快、觀察結(jié)果也更準(zhǔn)確。張仲凱等[26，27]利用電鏡對(duì)云南地區(qū)的PVX等病毒進(jìn)行了觀察和鑒定。電鏡還可以觀測(cè)到病毒引起的寄主細(xì)胞的病變和內(nèi)含體特征，是深度研究病毒病機(jī)理的重要手段。但是，電鏡檢測(cè)法所需儀器設(shè)備昂貴，操作過程繁瑣，對(duì)人員要求較高，在PVX檢測(cè)上應(yīng)用較少。

3.3 免疫學(xué)檢測(cè)法

①酶聯(lián)免疫吸附法 酶聯(lián)免疫吸附法 （Enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）由 Voller等[28]首次應(yīng)用于植物病毒檢測(cè)，主要是利用抗原與酶標(biāo)抗體特異性結(jié)合以及底物的顯色反應(yīng)，檢測(cè)病毒存在與否，并可對(duì)病毒含量進(jìn)行初步測(cè)定。ELISA具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適合于口岸、生產(chǎn)企業(yè)開展大樣本檢測(cè)。ELISA依據(jù)支持物的不同可分為雙抗體夾心法 （DAS-ELISA）和硝酸纖維素膜法（NCM-ELISA）。DAS-ELISA和NCM-ELISA在PVX檢測(cè)上應(yīng)用較為廣泛。李云海等[29]利用ELISA對(duì)云南省馬鈴薯脫毒試管苗的PVX病毒進(jìn)行了檢測(cè)；白艷菊等[30]利用DAS-ELISA對(duì)黑龍江省主栽馬鈴薯品種的脫毒試管苗及田間收獲薯塊感染PVX的情況進(jìn)行了檢測(cè)；仲乃琴[31]利用DAS-ELISA對(duì)甘肅省種植的6個(gè)馬鈴薯品種的老齡薯、幼齡薯以及2個(gè)品種的莖尖組培苗攜帶PVX的情況進(jìn)行了檢測(cè)分析；張國(guó)柱[32]利用NCM-ELISA對(duì)山西省的主栽馬鈴薯品種PVX感染情況進(jìn)行了檢測(cè)，并均取得了較好的結(jié)果。

②免疫膠體金技術(shù) 免疫膠體金技術(shù)（Immune colloidal gold technique，ICG）是一種新型檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)操作簡(jiǎn)單，樣品用量較少、無(wú)需特殊處理，檢測(cè)時(shí)間短，僅15 min便可完成，肉眼水平便可觀察結(jié)果，特別適合口岸檢疫、基層單位的實(shí)驗(yàn)室和大田病毒病害的快速檢測(cè)[33，34]。魏梅生等[35]已研制出用于PVX檢測(cè)的ICG試紙條，該試紙條的靈敏度和精確度均較高。張麗等[36]利用ICG技術(shù)對(duì)寧夏地區(qū)不同馬鈴薯品種及不同級(jí)別脫毒種薯的脫毒情況進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ICG檢測(cè)效果與ELISA相當(dāng)，但具有樣本用量極小、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，適用于一級(jí)種薯田間小樣本抽樣檢測(cè)。

3.4 分子生物學(xué)檢測(cè)法

分子生物學(xué)方法在馬鈴薯病毒檢測(cè)中的應(yīng)用發(fā)展十分迅速。與傳統(tǒng)馬鈴薯病毒檢測(cè)方法相比，其具有靈敏度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，尤其是反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）和核酸斑點(diǎn)雜交（Nucleic acid spot hybridization，NASH）技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于PVX的檢測(cè)。

①RT-PCR技術(shù) RT-PCR技術(shù)以PVX的RNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后對(duì)cDNA擴(kuò)增，最后進(jìn)行檢測(cè)分析，該方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、快速、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好和取樣量少等優(yōu)點(diǎn)，十分適合種薯生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)控管理[37]。 關(guān)翠萍等[38]運(yùn)用一步RT-PCR法對(duì)馬鈴薯中的PVX等病毒進(jìn)行了檢測(cè)，建立了靈敏度較高的一步法RT-PCR檢測(cè)技術(shù)。朱云芬等[2]建立了 PVX的 RT-PCR和IC-RT-PCR （Immunocapture reverse transcription polymerase chain reaction）技術(shù)，認(rèn)為這2種方法均具有較高的靈敏度，均可滿足檢測(cè)需求。在RT-PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，研究者們進(jìn)一步開發(fā)了多重RT-PCR技術(shù)，可對(duì)PVX等多種馬鈴薯病毒同時(shí)進(jìn)行有效的檢測(cè)[39～41]。

②NASH技術(shù) NASH技術(shù)是將PVX基因組的一段核苷酸序列進(jìn)行放射性或非放射性標(biāo)記，制成探針，再與待檢樣品的核酸進(jìn)行雜交，從而指示PVX的存在與否[42]。Eweida等[43]利用NASH檢測(cè)PVX，結(jié)果表明該方法的靈敏度是ELISA的100～250倍。Katarzyna等[44]利用NASH對(duì)馬鈴薯組培苗中的PVX等病毒進(jìn)行了多重檢測(cè)。吳興泉等[45]首次在國(guó)內(nèi)研究建立了PVX的NASH檢測(cè)技術(shù)，認(rèn)為NASH可完全滿足檢測(cè)的實(shí)際要求。

4 PVX的防治技術(shù)

PVX的防治技術(shù)主要包括生產(chǎn)脫毒種薯、培育抗病毒品種和利用抗病毒化學(xué)藥劑3個(gè)方面。生產(chǎn)脫毒種薯是目前最主要的防控措施，培育抗病品種是今后的發(fā)展方向，研發(fā)有效的抗病毒化學(xué)藥劑也是一個(gè)重點(diǎn)領(lǐng)域。

4.1 脫毒種薯生產(chǎn)

脫除PVX的常用方法有熱處理脫毒法、莖尖培養(yǎng)脫毒法、熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒法，其中熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒法應(yīng)用最為廣泛，脫毒效果也最顯著[46，47]。PVX脫毒種薯的生產(chǎn)流程主要分為4步，第一步是在實(shí)驗(yàn)室利用上述脫毒方法去除PVX，得到馬鈴薯組培脫毒試管苗；第二步是在溫室或者網(wǎng)室內(nèi)開展微型薯（也稱作原原種，薯塊質(zhì)量1～20 g）的生產(chǎn)；第三步是在田間開展原種（薯塊質(zhì)量小于75 g）的生產(chǎn)；第四步是在田間開展一級(jí)種（也稱作生產(chǎn)種，薯塊質(zhì)量50～100 g）的生產(chǎn)。在脫毒種薯的生產(chǎn)過程中，必須對(duì)各級(jí)種薯攜帶PVX的情況進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格控制種薯帶毒率。

4.2 抗病品種培育

常規(guī)育種技術(shù)是馬鈴薯抗病毒病育種的主要途徑之一，主要是通過雜交等方法，將抗性栽培種、野生種或近緣種的抗病基因引入到主栽品種中[48，49]。目前，研究者們已經(jīng)分離了多個(gè)抗PVX的基因。Ritter等[50]分離定位了PVX的極端抗性基因Rx1和Rx2，并將其引入到馬鈴薯育種材料中；Bendahmane等[51]在馬鈴薯栽培種 Cara中分離了PVX的極端抗性基因Rx，并將其定位于Ⅻ染色體上；Tommiska等[52]從二倍體栽培種Solanum phureja IvP35中分離到PVX高敏抗性基因Nxphu，并將其定位到Ⅸ染色體上。

植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是馬鈴薯抗病毒病育種的一個(gè)新途徑，主要是通過轉(zhuǎn)基因手段，將具有抗PVX功能的外源基因整合到目標(biāo)馬鈴薯品種的基因組中，增強(qiáng)其PVX抗性。這些功能基因種類較多，主要包括馬鈴薯自身的抗性基因、PVX外殼蛋白基因以及其他物種體內(nèi)的抗性基因。張鶴齡等[53]、Doreste等[54]分別將PVX的CP基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯品種虎頭、克新4號(hào)和cv.Desiree中，得到了具有較強(qiáng)PVX抗性的轉(zhuǎn)基因株系。Lodge等[55]將美國(guó)商陸（Phytolacca americana）的PAP基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯品種Russet Burbank中，得到的轉(zhuǎn)基因后代表現(xiàn)出較強(qiáng)的PVX抗性。

4.3 抗病毒病化學(xué)藥劑的利用

利用化學(xué)藥劑對(duì)PVX進(jìn)行防治也是一個(gè)重點(diǎn)研究方向。研究表明，嘌呤、嘧啶堿基類似物等物質(zhì)具有抑制PVX活性的功能。Huber等[56]研究發(fā)現(xiàn)，8-氮雜鳥嘌呤、8-氮雜腺嘌呤和6-丙基-2-硫代尿嘧啶對(duì)PVX具有明顯的抑制作用；Schulze等[57]研究發(fā)現(xiàn)，6-氨基尿嘧啶、6-氨基胸腺嘧啶和9-（2，3-二羥基丙基）腺嘌呤具有抑制PVX復(fù)制的功能；Schuster等[58，59]發(fā)現(xiàn)，咪唑衍生物類物質(zhì)病毒唑（三氮唑核苷）可完全抑制馬鈴薯莖培養(yǎng)物中PVX的增殖，三嗪類衍生物DHT（2，4-二酮-六氫化1，3，5-三嗪）等對(duì)PVX也具有抑制作用。

5 PVX的應(yīng)用

PVX主要用作植物外源基因的表達(dá)載體，研究者們多采用基因插入和融合蛋白2種構(gòu)建方法構(gòu)建PVX表達(dá)載體?；虿迦敕ㄊ菍⑼庠椿虿迦隤VX的CP基因的2個(gè)重復(fù)啟動(dòng)子之間，利用CP基因的啟動(dòng)子來指導(dǎo)外源基因的表達(dá)。為了避免重復(fù)的啟動(dòng)子同源結(jié)合導(dǎo)致外源基因丟失現(xiàn)象的發(fā)生，通常利用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（1RES）取代其中1個(gè)啟動(dòng)子[60]。融合蛋白是將目的基因以及通讀序列插入CP基因之前，編碼CP與目的基因的融合蛋白，然后利用病毒復(fù)制組裝將目的蛋白呈現(xiàn)在病毒粒子表面，表達(dá)后再?gòu)闹参镏蟹蛛x出重組病毒，用蛋白酶消化后進(jìn)行提純，得到抗原或非抗原藥物蛋白[60～62]。PVX作為表達(dá)載體具有易轉(zhuǎn)化、效率高等優(yōu)點(diǎn)，在基礎(chǔ)研究和生產(chǎn)上都得到了廣泛的應(yīng)用。Baulcombe等[63]、Avesani等[64]、Wagner等[65]、Zhou等[66]、楊鳳萍等[67]先后利用PVX載體生產(chǎn)了綠色熒光蛋白GFP、胰島素谷氨酸脫羧酶自抗原GAD65、植物過敏原、人巨粒細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF和乙肝表面抗原HBsAg。PVX載體在商業(yè)上存在顯著的應(yīng)用價(jià)值，F(xiàn)itchen等[68]利用PVX載體在煙草中生產(chǎn)兒童病毒性胃腸炎疫苗VP6蛋白，該方法生產(chǎn)的疫苗具有安全性高、數(shù)量大、成本低、儲(chǔ)藏方便等優(yōu)點(diǎn)。

6 展望

PVX病毒病是影響馬鈴薯生產(chǎn)的主要病害之一，對(duì)PVX開展深入研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前有關(guān)PVX發(fā)生與分布、基因結(jié)構(gòu)與功能、檢測(cè)方法等方面的研究較多，也取得了較大的進(jìn)展。PVX病毒病防治方面，主要采用莖尖脫毒以及三級(jí)快繁體系生產(chǎn)脫毒種薯，抗病毒病化學(xué)藥劑因其防治效果有限，應(yīng)用比較少。抗病毒病品種育種是PVX病毒病防治的主要發(fā)展方向，但這方面的研究進(jìn)展較為緩慢，亟待加大研究力度，培育出既具有良好抗病性，又能滿足生產(chǎn)實(shí)際需求的馬鈴薯品種。雖然PVX易對(duì)馬鈴薯生產(chǎn)造成較嚴(yán)重的影響，但我們可以充分利用PVX的生物學(xué)特性，根據(jù)實(shí)際需求，將其改造成攜帶外源基因的表達(dá)載體，生產(chǎn)所需蛋白，有關(guān)這方面的研究將極具應(yīng)用前景。

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Research Progress of Potato Virus X

CHEN Yuchao,NIE Fengjie,ZHANG Li,GONG Lei,GAN Xiaoyan,SHI Lei,SONG Yuxia
(Key Laboratory of Ningxia Agricultural Biotechnology,Yinchuan 750002)

This paper discussed the distribution and occurrence,genomic structure and function,detection method,control technique and application research of potato virus X (PVX),and prospected the application foreground of PVX,aimed to provide

for the further research of PVX.

Potato virus X;Distribution and occurrence;Genomic structure and function;Detection method;Control technique

S435.32

A

1001-3547（2016）18-0039-06

10.3865/j.issn.1001-3547.2016.18.015

寧夏農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新先導(dǎo)資金項(xiàng)目——寧夏地區(qū)馬鈴薯X病毒的分離與純化（NKYJ-15-36）；馬鈴薯瘡痂病病原菌鑒定及分子系統(tǒng)學(xué)研究（NKYJ-15-36）；馬鈴薯及牧草分子抗逆鑒定育種（NKYZ15-32）；馬鈴薯StCWIN1基因多態(tài)性及與產(chǎn)量結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)分析（NKYG-15-06）；寧夏農(nóng)業(yè)育種專項(xiàng)——馬鈴薯新品種選育（2014NYYZ01）

陳虞超（1982-），男，碩士，助理研究員，從事植物生理生化研究，電話：0951-6886759，E-mail：chenyuchao820321@163.com

宋玉霞（1963-），通信作者，女，碩士，研究員，主要從事植物生物技術(shù)育種及特色植物資源開發(fā)研究，電話：0951-6886755，E-mail：songyx666@163.com

2016-05-25