王　晶,楊冰潔,潘隆應(yīng),蔡　明,丁曉六,潘會(huì)堂*,張啟翔

(1 花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心,城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室,北京林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院,北京 100083;2 福建金森林業(yè)股份有限公司,福建三明 365000)

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基于熒光原位雜交技術(shù)的紫薇屬植物核型分析

王晶1,楊冰潔1,潘隆應(yīng)2,蔡明1,丁曉六1,潘會(huì)堂1*,張啟翔1

(1 花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心,城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室,北京林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院,北京 100083;2 福建金森林業(yè)股份有限公司,福建三明 365000)

摘要:以紫薇(Lagerstroemia indica)、尾葉紫薇(L.caudata)、屋久島紫薇(L.fauriei)和福建紫薇(L.limii)4種紫薇屬植物為材料,利用染色體熒光原位雜交技術(shù)(FISH)獲得了4種紫薇屬植物的有絲分裂中期染色體FISH圖及核型參數(shù),分析了45S rDNA在紫薇屬植物染色體上的數(shù)量和分布特點(diǎn)。結(jié)果表明,4種紫薇屬植物染色體上均具有1對(duì)45S rDNA雜交位點(diǎn),位于較長(zhǎng)染色體短臂的近端部,紫薇、尾葉紫薇、屋久島紫薇和福建紫薇的核型公式分別為2n=48=2M+24m+22sm、2n=48=30m+18sm、2n=48=2M+20m+26sm和2n=48=2M+32m+14sm,均為2A型。該研究首次獲得了紫薇屬植物45S rDNA熒光原位雜交核型,為紫薇屬植物親緣關(guān)系研究和細(xì)胞生物學(xué)研究提供了分子細(xì)胞學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞:紫薇屬;45S rDNA;熒光原位雜交技術(shù);核型

紫薇(LagerstroemiaindicaL.)是中國(guó)重要的夏季觀花植物,具有花色豐富、色澤艷麗、夏季單花及花序觀花期長(zhǎng)等觀賞特性,同時(shí)還有耐高溫、耐污染、栽培養(yǎng)護(hù)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[1],在中國(guó)已有1 500多年的栽培史。關(guān)于紫薇屬植物,前人在種質(zhì)資源調(diào)查[2-4]、植物遺傳多樣性分析[5-8]、新品種培育[9-11]等方面進(jìn)行了廣泛研究。由于該屬植物的染色體很小,染色體數(shù)目較大,導(dǎo)致紫薇屬植物制片難度大,傳統(tǒng)的核型分析方法很難明確識(shí)別其染色體。前人關(guān)于紫薇屬植物核型研究較少,陳瑞陽(yáng)[12]報(bào)導(dǎo)了紫薇的核型公式為28m+18sm+2st,染色體數(shù)目為2n=48;另有研究表明紫薇、屋久島紫薇、福建紫薇的染色體數(shù)目均為48[13],但未獲得其相應(yīng)的核型公式。

原位雜交技術(shù)(insituhybridization,ISH)是根據(jù)核酸分子堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,將探針與經(jīng)過(guò)染色體變性的DNA進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì),結(jié)合成專一的、可被檢測(cè)到的核酸雜交分子,經(jīng)過(guò)特定檢測(cè)手段顯示探針在染色體上的物理位置的技術(shù)手段。原位雜交技術(shù)在植物多倍體的起源、非整倍體的鑒定、物種特定基因序列在染色體上的物理定位、染色體導(dǎo)入片段確定、雜種鑒定、植物基因組間關(guān)系、植物親緣關(guān)系研究等方面有很大的優(yōu)勢(shì),并得到廣泛的應(yīng)用[14-20]。在亞洲百合‘Petit Brigitte’、青島百合(Liliumtsingtauense)及其雜交后代進(jìn)行45S rDNA物理定位,研究表明‘Petit Brigitte’有10個(gè)45S rDNA位點(diǎn)、青島百合有8個(gè)位點(diǎn),所有雜種后代均有9個(gè)45S rDNA位點(diǎn),說(shuō)明雜種后代的染色體分別源于‘Petit Brigitte’和青島百合[21]。利用雙色熒光原位雜交技術(shù)(FISH)對(duì)3種薔薇屬植物的中期染色體進(jìn)行5S rDNA、45S rDNA的物理定位,通過(guò)位點(diǎn)數(shù)目及分布特點(diǎn)的觀察,可以為識(shí)別3種薔薇屬植物的染色體提供明確有效的分子細(xì)胞學(xué)標(biāo)記[22]。利用栽培黃瓜全基因組DNA與45S rDNA同時(shí)作為探針,進(jìn)行2個(gè)黃瓜變種染色體熒光原位雜交,可以對(duì)2個(gè)黃瓜變種每條染色體進(jìn)行清晰地鑒別,并快速建立2個(gè)變種的核型模式[23]。熒光原位雜交技術(shù)與RFLP、PCR、Southern、RAPD或染色體分帶等結(jié)合,可以相互印證,為物種的遺傳改良研究提供技術(shù)支撐[24-25]。

為了給紫薇屬植物研究提供分子細(xì)胞學(xué)證據(jù),本研究以4種紫薇屬植物為材料,系統(tǒng)研究了紫薇屬植物染色體熒光原位雜交技術(shù)體系,首次獲得了基于FISH技術(shù)的紫薇(L.indica)、尾葉紫薇(L.caudata)、屋久島紫薇(L.fauriei)和福建紫薇(L.limii)的染色體核型圖,并分析了45S rDNA在4種紫薇屬植物中期染色體上分布特點(diǎn)。研究結(jié)果為紫薇屬植物基因在染色體上的物理定位提供了技術(shù)基礎(chǔ),也為進(jìn)一步在分子細(xì)胞學(xué)水平探討紫薇屬植物親緣關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1取材

實(shí)驗(yàn)材料為紫薇品種‘多花粉’、尾葉紫薇、屋久島紫薇和福建紫薇,均栽植于北京昌平小湯山國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心花卉種質(zhì)資源圃。取各材料當(dāng)年生枝條莖尖生長(zhǎng)點(diǎn),-20 ℃條件下于改良固定液[無(wú)水乙醇∶冰醋酸(分析純)∶三氯甲烷(分析純)=5∶3∶2,V/V]中固定過(guò)夜(10～12 h)待用。

1.2染色體制片

參考本課題組前期研發(fā)的方法[13],將固定好的生長(zhǎng)點(diǎn)用蒸餾水洗脫后,在2.5%纖維素酶∶2.5%果膠酶∶0.01%蛋白酶K=2∶1∶3(V/V)的混合酶液中37 ℃水浴酶解4～5 h,通過(guò)火焰干燥法獲得染色體制片,置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3探針制備

45S rDNA克隆自玉米(Zeymay),探針質(zhì)粒為中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米改良中心金危危教授實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng),質(zhì)粒濃度47.5 ng/μL。采用缺口平移法進(jìn)行探針標(biāo)記,地高辛標(biāo)記試劑盒(Roche,Dig-Nick Translation Mix,No.11745816910)標(biāo)記質(zhì)粒,按照說(shuō)明書(shū)操作。

1.4染色體制片處理

于-20 ℃冰箱中取出做好的染色體制片,65 ℃烘箱內(nèi)干燥1 h,制片上加100 μL 0.1 mg/mL RNA酶溶液,蓋上封口膜,放入底部有水的濕盒中,37 ℃條件下分別溫育0.5、1和1.5 h。揭去封口膜,2×SSC搖洗2×5 min后無(wú)需晾干,加20 μL 0.1 mg/mL胃蛋白酶K溶液于染色體片上,蓋上封口膜,放入底部有水的濕盒中,在37 ℃條件下分別溫育5、10和15 min(表1)。

1.5雜交液的制備

按照每張染色體制片加入20 μL雜交液的量配制雜交液,取4 μL 10 mg/mL鮭魚(yú)精溶液于離心管中,分別加入1、2、3、4和5 μL探針標(biāo)記混合液,放于65 ℃烘箱內(nèi)開(kāi)蓋烘烤至4 μL刻度處;加入去離子甲酰胺10 μL、20×SSC溶液2 μL、50% DS溶液4 μL,短暫離心。

表1　雜交前染色體制片的處理

1.6變性

(1)探針變性將制得的雜交液在95 ℃金屬浴避光變性10 min,轉(zhuǎn)入冰水中處理10 min,得變性探針。

(2)染色體變性每張染色體制片加入100 μL變性液(去離子甲酰胺∶ddH2O∶20×SSC=7∶2∶1,V/V),把變性液加到染色體制片上,蓋上蓋玻片,85 ℃烘箱內(nèi)分別避光變性2、2.5、3、3.5、4、4.5和5 min,然后迅速甩脫蓋玻片,用70%、95%、100%乙醇-20 ℃逐級(jí)脫水,每級(jí)脫水5 min,空氣中晾干待用。

1.7原位雜交和圖像攝取

雜交液變性后加在染色體制片上,放入濕盒中37 ℃恒溫暗處理16～18 h,經(jīng)2×SSC和1×PBS洗脫。每張制片加100 μL 2 μg/mL地高辛抗體(Roche,No.11207750910,5%BSA溶液稀釋),37 ℃溫育1 h,1×PBS洗脫晾干,加上約13 μL含有DAPI的封片液,于Olympus BX-51熒光顯微鏡下鏡檢,Cytovision軟件采集圖像。

1.8數(shù)據(jù)分析

利用Photoshop軟件進(jìn)行圖像處理后進(jìn)行染色體數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

2結(jié)果與分析

2.1染色體制片前處理方法對(duì)雜交效果的影響

不同的染色體制片前處理對(duì)雜交效果有不同的影響。通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn),染色體制片前處理Ⅰ雜質(zhì)太多,完全觀測(cè)不到雜交信號(hào);處理Ⅱ雜質(zhì)較少,但雜交信號(hào)不清晰;處理Ⅲ有部分染色體丟失,且雜交信號(hào)不清晰;處理Ⅳ雜質(zhì)較多,雜交信號(hào)不清晰;處理Ⅴ雜質(zhì)較少,雜交信號(hào)也較清晰;處理Ⅵ部分染色體丟失,雜交信號(hào)較清晰;處理Ⅶ雜質(zhì)較少,但雜交信號(hào)不清晰;處理Ⅷ部分染色體丟失,雜交位點(diǎn)較清晰;處理Ⅸ染色體丟失嚴(yán)重,雜交信號(hào)不清晰。綜上,100 μL 0.1 mg/mL RNA酶處理1 h ,結(jié)合20 μL 0.1 mg/mL胃蛋白酶K溶液37 ℃溫育10 min,細(xì)胞質(zhì)等雜質(zhì)去除較完全,信號(hào)較清晰,探針與染色體雜交效果較好,制片效果最好。

2.2探針用量對(duì)雜交效果的影響

探針用量為1～2 μL時(shí),雜交信號(hào)太弱,亮度較小,甚至難以看清(圖1,A);探針用量為3～4 μL時(shí),信號(hào)點(diǎn)明亮度適中,信號(hào)清晰可辨,效果最好(圖1,B);當(dāng)探針量為5 μL時(shí),不僅影響信號(hào)顯示,還會(huì)出現(xiàn)雜質(zhì)點(diǎn)(圖1,C)。綜合分析認(rèn)為適宜的探針用量為3～4 μL。

2.3變性時(shí)間對(duì)雜交結(jié)果的影響

85 ℃烘箱內(nèi)避光變性時(shí)間為2～3 min時(shí),制片染色體DNA雙鏈未完全打開(kāi),無(wú)法進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì),探針無(wú)法與靶染色體雜交,無(wú)特異性信號(hào)出現(xiàn);變性3.5 min,染色體形態(tài)完好,變性完全,信號(hào)點(diǎn)清晰,數(shù)目穩(wěn)定,觀察得到的雜交效果最好。染色體變性時(shí)間大于或等于4 min時(shí),由于變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng),染色體會(huì)發(fā)生明顯的膨脹變形,且時(shí)間越久,膨脹變型越明顯。

2.445S rDNA在紫薇屬植物中期染色體上的物理定位

在獲得優(yōu)化的紫薇屬FISH技術(shù)體系的基礎(chǔ)上,得到了4種紫薇屬植物中期染色體45S rDNA-FISH制片,并測(cè)定核型參數(shù),進(jìn)行核型分析。4種紫薇屬植物染色體數(shù)目均為2n=2x=48,紫薇屬植物染色體絕對(duì)長(zhǎng)度在1～2 μm之間,屬小染色體植物,且很多染色體呈顆粒狀(表2)。不同種類紫薇屬植物的核型公式和染色體相對(duì)長(zhǎng)度略有不同。按照由對(duì)稱到不對(duì)稱的核型分類方法,可以判定紫薇屬植物在植物進(jìn)化上比較原始。

45S rDNA在紫薇、尾葉紫薇、屋久島紫薇和福建紫薇染色體有絲分裂中期染色體上的定位如圖2和圖3所示。4種紫薇屬植物染色體與45S rDNA探針雜交后均得到了1對(duì)雜交信號(hào)點(diǎn),信號(hào)點(diǎn)均位于較長(zhǎng)染色體短臂近端部,紫薇染色體雜交信號(hào)位于第2對(duì)染色體的染色體短臂近端部,尾葉紫薇染色體雜交信號(hào)位于第1對(duì)染色體上,屋久島紫薇染色體雜交信號(hào)位于第4對(duì)染色體上,福建紫薇染色體雜交信號(hào)位于第2對(duì)染色體上。

表2　4種紫薇屬植物核型基本參數(shù)

A.2 μL;B.3.5 μL;C.5 μL

A.紫薇;B.尾葉紫薇;C.屋久島紫薇;D.福建紫薇;a.45S rDNA雜交信號(hào)(紅色)與DAPI復(fù)染的

A/a.紫薇;B/b.尾葉紫薇;C/c.屋久島紫薇;D/d.福建紫薇

3討論

3.1染色體熒光原位雜交的影響因素

(1)雜交前染色體制片的處理染色體制片預(yù)處理可有效去除細(xì)胞中的RNA和蛋白質(zhì),減少探針與載玻片上核酸和蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合。胃蛋白酶可消化細(xì)胞中殘留的雜質(zhì),暴露DNA核酸片段,利于檢測(cè)分子的穿透,增加探針與靶核酸的結(jié)合率。多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),用胃蛋白酶處理紫薇屬植物細(xì)胞10 min的消化效果最好,100 μL 0.1 mg/mL RNA酶溶液在37 ℃濕盒中溫育1 h消化結(jié)果最佳。

(2)雜交液濃度本試驗(yàn)中,紫薇屬植物探針用量1～2 μL(濃度1～3 ng/μL)時(shí)雜交信號(hào)較弱甚至難以看清;3～4 μL(濃度4～5 ng/μL)時(shí)效果較好,信號(hào)點(diǎn)明亮度適中;5 μL(濃度6 ng/μL)時(shí)探針濃度過(guò)高,影響信號(hào)顯示。與其他物種的最適濃度(柑橘屬2 ng/μL[26]、樹(shù)莓5 ng/μL[27]、石蒜3 ng/μL[28])差異不大。

(3)探針與染色體變性在原位雜交試驗(yàn)中,為了使探針與靶染色體結(jié)合,雙鏈DNA探針和染色體雜交前必須經(jīng)過(guò)變性處理,呈單鏈狀態(tài),才能按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行雜交。通過(guò)共變性或染色體、探針?lè)珠_(kāi)變性的方法均可以達(dá)到變性目的,但共變性的變性時(shí)間不好掌握,而分開(kāi)變性可以有效防止目標(biāo)染色體復(fù)性。在紫薇屬植物原位雜交中采用對(duì)染色體和探針?lè)珠_(kāi)變性的方法效果較好。

3.2紫薇屬植物的核型

紫薇屬植物的染色體非常小,絕對(duì)長(zhǎng)度在1～2 μm,染色體形態(tài)多數(shù)呈顆粒狀,有很多染色體僅憑肉眼很難分辨其是否同源,錯(cuò)配的幾率非常大。本研究得到的紫薇核型公式與前人的結(jié)果[12]有一定的相似性,如:核型公式中均為m(著絲點(diǎn)位于中部)或者sm(著絲點(diǎn)位于亞中部)的居多,染色體相對(duì)組成中為M1(中短染色體)居多;同時(shí),所得的核型公式也存在一定差異,紫薇屬植物常規(guī)核型分析中染色體均經(jīng)人為配對(duì),加之染色體非常小、數(shù)目較多,且不排除染色體變形的可能,所以不同的研究得到的結(jié)果有差異是在所難免的。在高等植物中,45S rDNA是編碼各種rDNA(5.8S、18S、25S、28S)的前體基因,45S rDNA與核仁的形成有關(guān),前人的研究表明隨體染色體數(shù)目與45S rDNA雜交位點(diǎn)的數(shù)目一般是一致的,如在棉花[29]、玉米[30]、水稻[31]等作物中,45S rDNA熒光雜交位點(diǎn)數(shù)目與隨體數(shù)目相同,但在蕓薹屬植物原位雜交試驗(yàn)中,所得到的雜交信號(hào)的個(gè)數(shù)多于隨體染色體數(shù)[32]。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),4種紫薇屬植物均具有1對(duì)45S rDNA雜交位點(diǎn),故推測(cè)4種紫薇屬植物均具有1對(duì)隨體,但由于紫薇染色體太小,隨體染色體的存在不能通過(guò)肉眼識(shí)別,所以還需通過(guò)其他多種檢測(cè)手段才能確定是否存在。故而在今后的研究中,如果能夠開(kāi)發(fā)出更多、更有效的特異性探針,并在靶染色體上進(jìn)行精確的物理定位,將會(huì)推動(dòng)紫薇屬植物以及其他小染色體植物在染色體分析、核型分析及分子細(xì)胞生物學(xué)等方面的深入研究。

3.345S rDNA在紫薇屬植物中期染色體上的定位

45S rDNA編碼的次縊痕一般在染色體短臂近著絲點(diǎn)部位,或是位于端粒上。微小染色體所含基因較少,其染色體場(chǎng)發(fā)育不全,不具有正常的著絲點(diǎn)和端粒。本研究中,4種紫薇屬植物均僅有1對(duì)45S rDNA雜交位點(diǎn),可能是小染色體的著絲點(diǎn)或端粒等部位發(fā)育不全。45S rDNA是一種有效的染色體標(biāo)記,可為研究基因組在分子或染色體水平的進(jìn)化提供證據(jù),有效反映植物種、屬間的分化程度。利用單色FISH和雙色FISH技術(shù)在幾種葫蘆科植物染色體上的定位表明在種屬分化過(guò)程中葫蘆科植物可能進(jìn)行過(guò)染色體非整倍化以及染色體斷裂、重排或不等價(jià)交換[33]。所以,通過(guò)觀測(cè)紫薇屬植物不同種間染色體上45S rDNA位點(diǎn)的數(shù)目、位置、信號(hào)強(qiáng)弱,可以在細(xì)胞分子水平對(duì)紫薇屬植物進(jìn)行分類鑒別、判定其親緣關(guān)系與系統(tǒng)進(jìn)化程度。隨著研究的深入,必將獲得更多專屬于紫薇屬植物的基因序列。 rDNA在紫薇屬染色體上的成功定位不僅有助于在細(xì)胞和分子水平上對(duì)紫薇屬植物進(jìn)行系統(tǒng)的研究,也是構(gòu)建紫薇屬植物物理圖譜的第一步。

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(編輯:宋亞珍)

Karyotype Analysis ofLagerstroemiaSpecies with 45S rDNA-FISH

WANG Jing1,YANG Bingjie1,PAN Longying2,CAI Ming1,DING Xiaoliu1,PAN Huitang1*,ZHANG Qixiang1

(1 Beijing Key Laboratory of Ornamental Plants Germplasm Innovation & Molecular Breeding ,National Engineering Research Center for floriculture,Beijing Laboratory of Urban and Rural Ecological Environment and College of Landscape Architecture,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China;2 Fujian Jinsen Forestry Co.,Ltd.,Sanming,Fujian 365000,China)

Abstract:Fluorescence in situ hybridization(FISH) system was established in Lagerstroemia species,and 45S rDNA loci were anchored on the chromosomes of L.indica,L.caudata,L.fauriei and L.limii.The results showed that only one pair of 45S rDNA loci were found at the end of the short arms of one pair of homologous chromosomes.The karyotypes of the four Lagerstroemia species were all 2A and the karyotype formulas were 2n=48=2M+24m+22sm(L.indica),2n=48=30m+18sm(L.caudata),2n=48=2M+20m +26sm(L.fauriei) and 2n=48=2M+32m+14sm(L.limii) respectively.It is the first report on karyotype analysis with 45S rDNA loci in Lagerstroemia genus and the results will provide a cytomolecular basis for genetic research of Lagerstroemia.

Key words:Lagerstroemia;45S rDNA;FISH;karyotype

中圖分類號(hào):Q343.2+2;Q781

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

作者簡(jiǎn)介:王晶(1990-),女,在讀碩士研究生,主要從事園林植物資源與育種研究。E-mail:wongj2013@163.com*通信作者:潘會(huì)堂,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事園林植物與觀賞園藝研究。E-mail:htpan@bjfu.edu.cn

基金項(xiàng)目:十二五國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題(2013BAD01B07);國(guó)家自然科學(xué)基金(31470695);北京市共建項(xiàng)目專項(xiàng)

收稿日期:2015-09-29;修改稿收到日期:2015-11-16

文章編號(hào):1000-4025(2016)01-0030-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.01.0030