司曉偉 周小平

[摘要]目的：觀察補(bǔ)益營衛(wèi)方對衰老小鼠皮膚端粒酶表達(dá)的影響，探討補(bǔ)益營衛(wèi)方延緩皮膚衰老的機(jī)制。方法：以自然衰老小鼠為模型，制備石蠟切片，應(yīng)用免疫組化法對端粒酶的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果：衰老小鼠皮膚中端粒酶的表達(dá)水平較年輕小鼠低，且有顯著性差異（P<0.05）。應(yīng)用補(bǔ)益營衛(wèi)方高、中、低劑量組處理后，可顯著提高端粒酶的表達(dá)，與老齡模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。三個劑量組相比，低劑量組對端粒酶表達(dá)水平的影響優(yōu)于其它兩個劑量組（P<0.01），中劑量組和高劑量組相比沒有明顯差異（P>0.05）。結(jié)論：補(bǔ)益營衛(wèi)方通過促進(jìn)衰老皮膚端粒酶的表達(dá)，起到延緩皮膚衰老作用。

[關(guān)鍵詞]營衛(wèi)；皮膚衰老；端粒酶；中醫(yī)藥；機(jī)制

[中圖分類號]Q591

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號]1008-6455（2016）01-0041-03

中醫(yī)理論認(rèn)為營衛(wèi)具有“熏膚、充身、澤毛、溫分肉、充皮膚、肥腠理、司開合”的作用，其與皮膚的生理和病理有密切關(guān)系。隨著年齡的增加，人體氣血漸衰，營衛(wèi)亦顯不足，皮膚顯現(xiàn)衰老的表象。端粒酶（Telomerase）是一種在細(xì)胞中負(fù)責(zé)端粒延長的酶，端粒在不同物種細(xì)胞中對于保持染色體穩(wěn)定性和細(xì)胞活性有重要作用，許多研究表明，端粒酶除具有合成端粒重復(fù)序列，防止細(xì)胞復(fù)制性衰老的作用以外，還具有獨立于端粒外的抗凋亡作用和調(diào)節(jié)細(xì)胞生存的作用。本實驗擬通過對衰老小鼠皮膚端粒酶的影響，探討補(bǔ)益營衛(wèi)方延緩皮膚衰老的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康清潔級C57BL/6種雌性小鼠50只，其中3月齡10只，重量（20±2）g，14月齡40只，重量（28±3）g，實驗動物合格證號：SYXK（蘇）2011-0035，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供。飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。

1.2 實驗藥物

補(bǔ)益營衛(wèi)方由人參、甘草等組成，購自寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)門診部，常規(guī)水煎2次，合并濾液濃縮至生藥含量1g/ml，4℃冷藏保存。灌胃時用生理鹽水稀釋至所需濃度。

1.3 主要實驗儀器與實驗試劑

LEICA RM2245石蠟切片機(jī)（德國徠卡公司），LEICAEG1150C組織包埋機(jī)（德國徠卡公司），Glanz WD800微波爐（廣東格蘭仕有限公司），Olympus光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）等均有寧夏醫(yī)科大學(xué)解剖實驗室提供。端粒酶相關(guān)一抗和二抗（abcam公司），DAB顯色劑（中杉生物有限公司）等。

1.4 分組、給藥、取材

清潔級C57BL/6種雌性小鼠50只，其中3月齡10只，設(shè)為年輕組；14月齡40只，隨機(jī)分為4組，每組10只，分別設(shè)為老齡模型組、補(bǔ)益營衛(wèi)高劑量組、中劑量組和低劑量組。補(bǔ)益營衛(wèi)方高、中、低劑量組每天分別按6g/kg、39/kg、1.5g/kg的劑量灌胃給藥，每周禁食稱重一次，連續(xù)六周。六周后，脫臼處死動物，剪下背部皮膚，盡可能剪去背毛，取1.Ocm×1.Ocm，分成數(shù)份，置于4%多聚甲醛中固定，將固定標(biāo)本取出，常規(guī)脫水，透明，浸蠟后包埋，石蠟切片厚度為5μm。

1.5 實驗方法

本次實驗通過免疫組化法對小鼠皮膚端粒酶表達(dá)的檢測，具體過程如下：①5μm石蠟切片脫臘入水；②枸櫞酸緩沖液加熱至90℃，微波修復(fù)Imin后冷卻，移至PBS；③PBS漂洗5min×3次；④加20%正常牛血清，室溫留置30min；⑤加100μlTdT反應(yīng)混合液，置濕盒中，37℃反應(yīng)90min；⑥PBS漂洗5min×3次；⑦浸入0.3%過氧化氫甲醇液，室溫阻斷l(xiāng)Omin；⑧PBS漂洗5min×3次；⑨加POD轉(zhuǎn)化劑，37℃反應(yīng)30min；⑩PBS漂洗5min×3次； 11.加100μlDAB顯色；12.蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。

1.6 指標(biāo)測定

光鏡下細(xì)胞核呈棕色顆粒為陽性細(xì)胞。每張切片在高倍鏡視野下選擇對照背景較好，陽性細(xì)胞表達(dá)最強(qiáng)的染色部位，細(xì)胞分布較為均勻的10個視野，應(yīng)用Image-ProPlus 6.0進(jìn)行圖像分析，用光密度值評價端粒酶。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSSII.5進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)用x±s表示，樣本均值比較采用單因素方差分析，方差分析采用LSD法比較各組均數(shù)間的差異。顯著性水平設(shè)為a=0.05，P≤0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

見圖1。結(jié)果顯示，在光學(xué)顯微鏡下，端粒酶表達(dá)的陽性細(xì)胞的胞核呈棕黃色，陰性細(xì)胞呈淡藍(lán)色。年輕組小鼠皮膚端粒酶表達(dá)強(qiáng)，主要分布在表皮基底層及毛囊部位；而老齡模型組端粒酶的表達(dá)則明顯較弱，兩組之間有顯著差異（P<0.05）。應(yīng)用補(bǔ)益營衛(wèi)方不同劑量組處理后，可顯著提高衰老小鼠皮膚端粒酶的表達(dá)，與老齡模型組比較有顯著差異（P<0.05）。補(bǔ)益營衛(wèi)方三個劑量相比，低劑量組對端粒酶表達(dá)水平的影響優(yōu)于其它兩個劑量組，并有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），中劑量組和高劑量組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。見表1。

3 討論

隨著人類社會的發(fā)展和進(jìn)步，人們生活質(zhì)量逐漸提高，對延緩皮膚衰老的要求越來越迫切。皮膚衰老作為機(jī)體衰老的重要組成部分，最先表現(xiàn)于外，衰老的皮膚外觀不但影響容貌靚麗，亦影響社交，因此預(yù)防和延緩皮膚衰老已成為美容醫(yī)學(xué)研究的熱點。中醫(yī)藥在數(shù)千年的發(fā)展中積累了豐富的抗衰老理論和經(jīng)驗，《傷寒論·平脈法》第69條說：“寸口脈微而澀，微者衛(wèi)氣衰，澀者榮氣不足，衛(wèi)氣衰，面色黃，榮氣不足，面色青。”指出營衛(wèi)充盛，則肌肉健壯，容光煥發(fā)，沒有衰老之象；反之，營衛(wèi)不足，則面色青黃，衰象顯露。因此皮膚的健康，疾病以及衰老與營衛(wèi)密切相關(guān)。

筆者從《傷寒論》和《金匱要略》中與營衛(wèi)相關(guān)方劑的挖掘、整理與分析，從以“營氣不足”導(dǎo)致身疼痛為病機(jī)的桂枝新加湯證中選取益營氣的人參，從治虛勞的黃芪建中湯證選取益衛(wèi)的生黃芪，再加益氣調(diào)和藥性的炙甘草組成了補(bǔ)益營衛(wèi)方。本實驗從補(bǔ)益營衛(wèi)的角度出發(fā)，探討補(bǔ)益營衛(wèi)方對衰老皮膚中端粒酶的表達(dá)影響。

近年研究表明，端粒和端粒酶在細(xì)胞復(fù)制性衰老中起著重要作用。正常體細(xì)胞端粒的長度是有限度的，隨著年齡的增長和細(xì)胞分裂次數(shù)的增多，端粒會逐漸縮短，一般丟失速度為50-200bp/次。端粒長度決定了細(xì)胞的分裂次數(shù)，它作為有絲分裂的“時鐘”，調(diào)控著細(xì)胞的復(fù)制壽命，超過分裂極限后細(xì)胞自然衰老死亡。

端粒酶是一種能延長端粒末端、由RNA和蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白酶。端粒酶結(jié)構(gòu)組成主要包括三部分：人類端粒酶RNA基因（human telomerase RNA component，hTerc），人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTert），Dyskerin。有研究發(fā)現(xiàn)，激活端粒酶活性可以阻止端?？s短引起的衰老，延緩組織老化并提升機(jī)體的健康狀況及生命長度。國內(nèi)外研究表明，端粒酶與衰老有密切的聯(lián)系，因此對端粒酶的檢測對抗衰老有著重大意義。

本研究采用免疫組化技術(shù)通過對衰老小鼠皮膚端粒酶的表達(dá)，探究補(bǔ)益營衛(wèi)方延緩皮膚衰老的機(jī)制。實驗結(jié)果顯示，衰老小鼠皮膚中端粒酶的表達(dá)水平比年輕小鼠的表達(dá)水平明顯下降，兩者之間有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與國內(nèi)外的報道相符。經(jīng)補(bǔ)益營衛(wèi)方高、中、低劑量組干預(yù)，對衰老小鼠皮膚端粒酶的表達(dá)有促進(jìn)作用，與老齡模型組比較有顯著差異（P0.05）。

綜上所述，可以看出補(bǔ)益營衛(wèi)方通過促進(jìn)衰老皮膚端粒酶的表達(dá)而延緩皮膚衰老。