周　程

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諾貝爾獎(jiǎng)級(jí)科學(xué)成就究竟是怎樣取得的？
——綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)、表達(dá)與開(kāi)發(fā)

周程

摘要：第二次世界大戰(zhàn)結(jié)束后不久，大科學(xué)開(kāi)始興起，科學(xué)知識(shí)按“指數(shù)規(guī)律”持續(xù)高速增長(zhǎng)，但生物學(xué)的發(fā)展卻遇到一個(gè)瓶頸：人們無(wú)法觀察蛋白質(zhì)在活體細(xì)胞中的運(yùn)動(dòng)與變化情況。進(jìn)入20世紀(jì)后期，以綠色熒光蛋白為代表的一系列生物熒光標(biāo)記材料的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用，為生物學(xué)的大發(fā)展提供了一種全新的工具。此后，科學(xué)家們能夠很方便地觀察活細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)和生理過(guò)程，為深入研究腦細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程以及癌細(xì)胞的擴(kuò)散方式等問(wèn)題打下了良好的基礎(chǔ)。論文基于已有研究，主要依據(jù)研發(fā)參與者撰寫(xiě)的回憶文章和發(fā)表的論文，對(duì)多管水母綠色熒光蛋白分子的發(fā)現(xiàn)、基因的復(fù)制與表達(dá)、突變體的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用、類(lèi)似體的篩選與改進(jìn)等研究開(kāi)發(fā)關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行考察，揭示熒光蛋白標(biāo)記法的誕生經(jīng)緯，解釋瑞典皇家科學(xué)院將2008年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予下村修、馬丁·查爾菲和錢(qián)永健的主要原因。

關(guān)鍵詞：諾貝爾獎(jiǎng)；熒光蛋白；下村修；查爾菲；錢(qián)永健

引言

回顧科學(xué)史不難發(fā)現(xiàn)：每當(dāng)有人發(fā)明一種新的技術(shù)或方法，使人們的觀察視野大為擴(kuò)展之時(shí)，科學(xué)就會(huì)向前跨出一大步。望遠(yuǎn)鏡的發(fā)明，使伽利略(Galileo Galilei,1564—1642)清楚地看到月球上也有山峰，木星周?chē)灿行l(wèi)星，于是古希臘的四元素說(shuō)被徹底顛覆；顯微鏡的發(fā)明，使列文虎克(Antony van Leeuwenhoek,1632—1723)看到水滴中有許多小生物在蠕動(dòng)，血液中含有成千上萬(wàn)的紅細(xì)胞，于是微生物世界的大門(mén)被打開(kāi)。

第二次世界大戰(zhàn)結(jié)束后不久，大科學(xué)開(kāi)始興起，科學(xué)知識(shí)按“指數(shù)規(guī)律”持續(xù)高速增長(zhǎng)，但生物學(xué)的發(fā)展卻遇到一個(gè)瓶頸，那就是，盡管顯微鏡的倍數(shù)在不斷增加，人們?nèi)詿o(wú)法觀察蛋白質(zhì)在活體細(xì)胞中的運(yùn)動(dòng)與變化情況。蛋白質(zhì)乃生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，如果無(wú)法掌握細(xì)胞中蛋白質(zhì)的動(dòng)向，人類(lèi)就無(wú)法深入揭示生命活動(dòng)的奧秘。

20世紀(jì)后期，以綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)為代表的一系列生物熒光標(biāo)記材料的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用，為生物學(xué)的大發(fā)展提供了一種全新的工具。自此之后，科學(xué)家們似乎煉成了火眼金睛，能夠很方便地觀察活細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)和生理過(guò)程，為深入研究腦細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程以及癌細(xì)胞的擴(kuò)散方式等問(wèn)題打下良好基礎(chǔ)。

GFP無(wú)需依賴(lài)熒光素酶或其他輔助因子的作用，就可以在生物體內(nèi)每一個(gè)被表達(dá)的細(xì)胞中“自動(dòng)”出現(xiàn)。而且，GFP的熒光非常穩(wěn)定,在激發(fā)光照射下，其抗光漂白能力比熒光素強(qiáng)很多。是故，GFP及其變種今日被廣泛地用作分子標(biāo)記。此外，GFP還被用作砷和一些重金屬的傳感器。正因?yàn)槿绱?，瑞典皇家科學(xué)院決定將2008年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予對(duì)GFP的發(fā)現(xiàn)、表達(dá)和開(kāi)發(fā)做出杰出貢獻(xiàn)的三位科學(xué)家：下村修(Osamu Shimomura,1928—)、馬丁·查爾菲(Martin Chalfie,1947—)和錢(qián)永健(Roger Yonchien Tsien,1952—)。

下村修、查爾菲和錢(qián)永健三人榮獲2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的消息傳開(kāi)后不久，國(guó)內(nèi)便涌現(xiàn)出一批介紹他們的研究業(yè)績(jī)以及GFP的性質(zhì)與用途之類(lèi)的文章。這些文章無(wú)疑有助于加深人們對(duì)三位科學(xué)家學(xué)術(shù)貢獻(xiàn)以及對(duì)GFP的理解。但是，這些文章并沒(méi)有深入揭示下村修、查爾菲和錢(qián)永健開(kāi)展GFP研究的背景以及他們的研究與其他學(xué)者之間的傳承關(guān)系。實(shí)際上，從綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)到熒光蛋白標(biāo)記法的發(fā)明應(yīng)用，過(guò)程相當(dāng)復(fù)雜。可以說(shuō)，如果沒(méi)有眾多科學(xué)家接力推進(jìn)，使之成功穿越橫亙?cè)诎l(fā)現(xiàn)與發(fā)明之間的“亞馬孫叢林”，熒光蛋白標(biāo)記法就不可能獲得普及。

以下，筆者擬在馬克·季默(Marc Zimmer)*Marc Zimmer, Glowing Genes: A Revolution in Biotechnology, New York: Prometheus Books, 2005.、宮脅敦史*宮脇敦史：「GFPをめぐる半世紀(jì)の歴史」，『科學(xué)』2009年第79卷第1期。等人的研究基礎(chǔ)上，主要依據(jù)研發(fā)參與者撰寫(xiě)的回憶文章和發(fā)表的論文，對(duì)GFP分子的發(fā)現(xiàn)*筆者曾對(duì)下村修發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白的業(yè)績(jī)進(jìn)行過(guò)研究，具體可參見(jiàn)周程《杰出人才是怎樣煉成的？——下村修榮獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)案例研究》(《科學(xué)學(xué)與科學(xué)技術(shù)管理》 2012年第4期)。出于本文整體結(jié)構(gòu)上的需要，以下只對(duì)下村發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白的過(guò)程作一簡(jiǎn)要概述。、基因的復(fù)制與表達(dá)、突變體的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用、類(lèi)似體的篩選與改進(jìn)等研發(fā)關(guān)鍵環(huán)節(jié)作一更為深入的考察，以期能夠較為全面地揭示熒光蛋白標(biāo)記法的誕生經(jīng)緯，從而加深人們對(duì)諾貝爾獎(jiǎng)級(jí)科學(xué)貢獻(xiàn)的理解。

一、綠色熒光蛋白分子的發(fā)現(xiàn)

GFP革命的種子是由下村修于1962年埋下的。因此，下村修被認(rèn)為是GFP革命的始祖。但是，下村當(dāng)時(shí)并沒(méi)有意識(shí)到，自己在從事基礎(chǔ)研究過(guò)程中不經(jīng)意間發(fā)現(xiàn)的GFP后來(lái)竟成為科學(xué)家們深入揭示生命活動(dòng)奧秘的一個(gè)非常重要的工具。

下村修的中學(xué)時(shí)代是在戰(zhàn)亂中度過(guò)的。戰(zhàn)后初期，他在長(zhǎng)崎醫(yī)科大學(xué)(長(zhǎng)崎大學(xué)前身)附屬藥學(xué)專(zhuān)科部接受了三年的高等教育，畢業(yè)后留校任分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)教師。1955年，下村被選派到名古屋大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系天然有機(jī)化學(xué)研究室進(jìn)修。報(bào)到當(dāng)天，其指導(dǎo)教授就把一個(gè)裝滿干燥海螢(Cypridinahilgendorfri)的真空防潮容器拿給他，希望能將發(fā)光海螢體內(nèi)的熒光素提取出來(lái)并獲得結(jié)晶，以便為最終確定熒光素的分子結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)。由于海螢熒光素遇到氧氣后很快就會(huì)分解，這項(xiàng)工作難度極大，以致普林斯頓大學(xué)哈維(Newton Harvey,1887—1959)教授帶著學(xué)生研究多年仍未取得成功?？墒沁@一難題卻因下村的一項(xiàng)意外發(fā)現(xiàn)而被解決了*下村修：『クラゲの光に魅せられて――ノーベル化學(xué)賞の原點(diǎn)』，東京:朝日新聞出版,2009年。。

下村修的工作引起了哈維的弟子——普林斯頓大學(xué)生物學(xué)系教授約翰遜(Frank Johnson,1908—1990)的注意。在約翰遜的盛情邀請(qǐng)下，剛被名古屋大學(xué)破格授予理學(xué)博士學(xué)位的下村于1960年9月來(lái)到普林斯頓，開(kāi)始從事為期三年的博士后研究*O. Shimomura, Autobiography,[2010-02-12], http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/Shimomura.html.。當(dāng)時(shí)，每到夏季在美國(guó)西北海岸的星期五港灣都可看到成群的多管水母(Aequoreavictoria)，但是人們不知道這種無(wú)色透明的水母為什么會(huì)發(fā)出綠光*下村修：『GFP発見(jiàn)の歴史』，宮脇敦史編，『GFPとバイオイメージング』，東京:羊土社，2000年，第13～16頁(yè)。。約翰遜建議二人間的合作研究就從這種水母入手。由于提取純化多管水母體內(nèi)的發(fā)光物質(zhì)看似與自己先前的研究跨度不大，下村欣然接受了這一提議。

1961年夏，下村修如約跟隨約翰遜來(lái)到華盛頓大學(xué)的星期五港灣研究所。令下村沒(méi)有料到的是，多管水母的發(fā)光機(jī)理好像和海螢的完全不同，無(wú)論他和約翰遜采用哪一種降低熒光素酶活性的方法或去氧措施，都無(wú)法讓多管水母發(fā)光物質(zhì)提取液停止發(fā)光。在無(wú)法說(shuō)服約翰遜放棄原定研究方案的情況下，下村不得不獨(dú)自行動(dòng)。經(jīng)過(guò)數(shù)周的苦苦探索后，下村突然意識(shí)到：多管水母體內(nèi)的發(fā)光物質(zhì)很有可能是蛋白質(zhì)，若確實(shí)如此，則可通過(guò)改變提取液的pH值來(lái)降低蛋白質(zhì)的活性，進(jìn)而遏制發(fā)光物質(zhì)發(fā)光。之后的實(shí)驗(yàn)證明下村的判斷是正確的。富有戲劇性的是，當(dāng)下村做完實(shí)驗(yàn)把含有多管水母發(fā)光物質(zhì)的溶液倒進(jìn)污水池時(shí)，污水池里突然躥出一道藍(lán)光。當(dāng)時(shí)，正巧有人往污水池里排放海水。于是下村推定，引起發(fā)光的主因極有可能是海水中的鈣離子。這意味著可以通過(guò)降低提取液中的鈣離子濃度來(lái)阻止發(fā)光物質(zhì)發(fā)光。實(shí)際上，有效遏制多管水母發(fā)光物質(zhì)發(fā)光的難題后來(lái)就這么簡(jiǎn)單地解決了*下村修：「イクオリンとGFPの発見(jiàn)」，『バイオサイエンス最前線』1998年第22期。。

1961年9月，在星期五港灣辛苦工作了三個(gè)多月的約翰遜和下村等人帶著冷凍多管水母發(fā)光物質(zhì)提取液回到普林斯頓。第二年春，他們提取到5毫克高純度多管水母發(fā)光物質(zhì)，對(duì)其進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，該發(fā)光物質(zhì)確實(shí)是一種蛋白質(zhì)，加微量鈣離子后會(huì)發(fā)藍(lán)光，而且在真空狀態(tài)下也能發(fā)光。下村等人將這種特殊蛋白質(zhì)命名為“aequorin”，即水母素*下村修：「イクオリンとGFPの発見(jiàn)」，『バイオサイエンス最前線』1998年第22期。。在純化水母素過(guò)程中，下村等人還發(fā)現(xiàn)一個(gè)副產(chǎn)品——一種含量很低、在自然光的照射下發(fā)淺綠色熒光的新型蛋白質(zhì)。在該年投給《細(xì)胞和比較生理學(xué)學(xué)報(bào)》的論文腳注中，下村等人首次公開(kāi)了這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)。當(dāng)時(shí)，他們將這種新型蛋白質(zhì)稱(chēng)為“綠色蛋白質(zhì)”*F. H. Johnson, O. Shimomura, Y. Saiga, L. C. Gershman, G. T. Reynolds, J. R. Waters, Quantum Efficiency of Cypridina Luminescence, with a Note on that of Aequorea, Journal of Cellular and Comparative Physiology, vol. 60, no. 1(1962), pp. 85-103.。

盡管下村和約翰遜等人在1962年就發(fā)現(xiàn)了多管水母“綠色蛋白質(zhì)”，但是他們當(dāng)時(shí)還顧不上對(duì)這種物質(zhì)的生化性質(zhì)展開(kāi)深入研究，再說(shuō)他們當(dāng)初積攢的“綠色蛋白質(zhì)”數(shù)量有限，根本滿足不了實(shí)驗(yàn)最低需求。當(dāng)時(shí)，下村和約翰遜最為關(guān)心的是，既然水母素對(duì)鈣離子非常敏感，那么可否利用它的這一特性來(lái)測(cè)定血清和牛奶中的鈣離子含量？1963年初，他們把自己在這方面所做的研究整理成文，美國(guó)的《科學(xué)》雜志同年6月就刊發(fā)了該文*O. Shimomura, F. H. Johnson, Y. Saiga, Microdetermination of Calcium by Aequorin Luminescence, Science,vol. 140(1963),pp. 1339-1340.。

1963年，35歲的下村修回到日本，就任名古屋大學(xué)水質(zhì)科學(xué)研究所副教授。因其對(duì)生物發(fā)光研究情有獨(dú)鐘，在魚(yú)和熊掌不可兼得的情況下，他于1965年底辭去待遇優(yōu)厚的日本國(guó)立大學(xué)的教職，帶著夫人和一歲的兒子返回普林斯頓，在約翰遜研究室當(dāng)起了依靠申請(qǐng)研究經(jīng)費(fèi)過(guò)活的博士后研究員*下村修：「発光生物研究40年」，『長(zhǎng)薬同窓會(huì)會(huì)報(bào)』1995年第35期。。20世紀(jì)60年代后期，下村急于探明的主要是水母素的化學(xué)結(jié)構(gòu)與發(fā)光機(jī)理*O. Shimomura， The Discovery of Aequorin and Green Fluorescent Protein, Journal of Microscopy, vol. 217,no. 1(2005), pp. 3-15.。為獲得足量的水母素，他每年夏天都要帶上家人到星期五港灣去大量捕撈多管水母。雖然非常辛苦，但他樂(lè)此不疲*下村修：「イクオリンとGFPの発見(jiàn)」，『バイオサイエンス最前線』1998年第22期。。在大量提取水母素的過(guò)程中，他也積攢了不少多管水母“綠色蛋白質(zhì)”，不過(guò)他當(dāng)時(shí)并未對(duì)其展開(kāi)實(shí)質(zhì)性的研究。

1969年，哈佛大學(xué)的伍迪·哈斯廷(Woody Hasting,1927—) 和詹姆斯·莫林(James Morin,1953—)在研究腔腸動(dòng)物發(fā)光蛋白質(zhì)特性時(shí)再次“發(fā)現(xiàn)”了多管水母“綠色蛋白質(zhì)”，并將其命名為“Green Fluorescent Protein”，即綠色熒光蛋白*J. W. Hasting, J. G.Morin, Comparative Biochemistry of Calcium-activated Photoproteins from the Ctenophore, Mnemiopsis, and the Coelenterates Aequorea, Obelia, Pelagia and Renilla, Biological Bulletin, vol. 137(1969), p. 402.。二人在研究過(guò)程中還注意到，水母素遇到鈣離子后發(fā)出來(lái)的光是藍(lán)色的，而多管水母受到刺激后發(fā)出的卻是綠光。此后，水母素發(fā)出的藍(lán)光是怎樣轉(zhuǎn)變成綠色的，GFP在中間發(fā)揮了什么樣的作用之類(lèi)的問(wèn)題便一直縈繞在他們的腦海里。1971年，他們提出了熒光共振能量轉(zhuǎn)移理論(FRET)，對(duì)這類(lèi)現(xiàn)象進(jìn)行了解釋*J. G. Morin, J. W. Hasting, Energy Transfer in a Bioluminescent System, Journal of Cellular Physiology, vol. 77, no. 3(1971), pp. 313-318.。依據(jù)該理論，水母素生產(chǎn)的藍(lán)光先以無(wú)輻射的方式傳遞給GFP，GFP受到藍(lán)光激發(fā)后再以發(fā)綠光的方式將能量釋放出來(lái)。產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移必須滿足兩個(gè)條件：(1)供體的發(fā)射波長(zhǎng)和受體的吸收波長(zhǎng)重疊；(2)供體和受體的距離小于3納米。1974年，下村等人使用自己提純的水母素和多管水母GFP首次驗(yàn)證了這一理論*H. Morise, O. Shimomura, F. H. Johnson, J. Winant, Intermolecular Energy Transfer in the Bioluminescent System of Aequorea, Biochemistry, vol. 13, no. 12(1974), pp. 2656-2662.。

由于水母素分子的發(fā)光機(jī)理已于1973年被解明*O. Shimomura, F. H. Johnson, Chemical Nature of Light Emitter in Bioluminescence of Aequorin, Tetrahedron Letters, vol. 14, no. 31(1973), pp. 2963-2966.，這樣多管水母的發(fā)光機(jī)理問(wèn)題于1974年被解決之后，弄清GFP分子的發(fā)光機(jī)理便成為當(dāng)務(wù)之急。遺憾的是，下村等人多年積攢起來(lái)的多管水母GFP被約翰遜帶去參加學(xué)術(shù)會(huì)議時(shí)丟失了*M. Zimmer, Glowing Genes: A Revolution in Biotechnology.。而當(dāng)時(shí)的生物技術(shù)還不甚發(fā)達(dá)，做一次GFP結(jié)構(gòu)分析實(shí)驗(yàn)需要上百毫克的GFP。所以，此后數(shù)年下村不得不仍舊帶著家人去星期五港灣大量捕撈多管水母。由于多管水母中的GFP含量遠(yuǎn)低于水母素，故直到1979年下村才攢足100毫克GFP*下村修：「イクオリンとGFPの発見(jiàn)」，『バイオサイエンス最前線』1998年第22期。。是年，下村他們把手中的多管水母GFP全部酶解成肽段，然后逐一檢查這些肽段的光反應(yīng)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些肽段均不發(fā)光，像GFP一樣吸收光的也只有一段*M. Zimmer, Glowing Genes: A Revolution in Biotechnology.。對(duì)純化后只有0.1毫克的這片肽段展開(kāi)深入研究后，下村驚奇地發(fā)現(xiàn)其吸收光譜峰值和自己20年前在名古屋大學(xué)研究海螢熒光素時(shí)合成的化合物的吸收光譜峰值非常接近*O. Shimomura, Discovery of Green Fluorescent Protein, GFP, Nobel Lecture, 2008-12-08, [2010-02-12]， http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/Shimomura-lecture.html.。于是他很快就推測(cè)出多管水母GFP發(fā)光基團(tuán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并在《歐洲生物化學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)盟通訊》上公開(kāi)了這一研究成果*O. Shimomura, Structure of the Chromophore of Aequorea Green Fluorescent Protein, FEBS Letters, vol. 104, no. 2(1979), pp. 220-222.。

1979年用聯(lián)想類(lèi)比法推出多管水母GFP發(fā)光基團(tuán)結(jié)構(gòu)后不久，下村獲知?jiǎng)倧淖糁蝸喆髮W(xué)轉(zhuǎn)到羅格斯大學(xué)任教的威廉·瓦德(William Ward)也在星期五港灣大量捕撈多管水母，并已重點(diǎn)展開(kāi)對(duì)GFP的研究。經(jīng)過(guò)一番考量，對(duì)基因工程興趣不是很濃的下村決定專(zhuān)注于當(dāng)時(shí)被認(rèn)為有著廣泛應(yīng)用前景的水母素的研究，不再參與GFP的研究開(kāi)發(fā)競(jìng)爭(zhēng)*下村修：「イクオリンとGFPの発見(jiàn)」，『バイオサイエンス最前線』1998年第22期。。

二、綠色熒光蛋白基因的分離與復(fù)制

1981年，下村修轉(zhuǎn)到位于馬薩諸塞州伍茲霍爾(Woods Hole)的海洋生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室就任資深科學(xué)家，同時(shí)兼任波士頓大學(xué)藥學(xué)院教授。六年后，在佐治亞大學(xué)跟隨密爾頓·考彌爾(Milton J. Cormier,1948—)教授進(jìn)行多年水母素克隆研究的道格拉斯·普拉舍(Douglas Prasher,1951—)也來(lái)到海洋生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。在這里，普拉舍成功地從多管水母的DNA中分離出GFP基因，并對(duì)其進(jìn)行復(fù)制與測(cè)序，為GFP在異源生物體中的表達(dá)奠定了重要的基礎(chǔ)。

普拉舍1979年在俄亥俄大學(xué)取得生物化學(xué)博士學(xué)位后，到佐治亞大學(xué)跟隨細(xì)菌遺傳學(xué)家悉尼·庫(kù)斯納(Sidney Kushner)教授做了一期博士后研究。在此期間，普拉舍結(jié)識(shí)了該校的生物化學(xué)系創(chuàng)始人考彌爾*M. Zimmer, Glowing Genes: A Revolution in Biotechnology.。考彌爾1958年調(diào)入佐治亞大學(xué)后，便開(kāi)始迷上一種大量生活在佐治亞的淺水海灣里、受刺激后能發(fā)出綠光的群體無(wú)脊椎動(dòng)物——海腎(Renillareniformis)。在考彌爾的指導(dǎo)下，1977年，一名研究生成功地分離出海腎熒光素酶；緊隨其后，一名博士后又提取到海腎GFP*M. J. Cormier, Nobel Prize Spotlights Basic Research, UGA Research Magazine, spring 2009, [2011-07-18], http://researchmagazine.uga.edu/aa/spring2009/spotlight.php.。1979年，考彌爾和其指導(dǎo)的博士后瓦德聯(lián)名發(fā)表的有關(guān)海腎GFP特性的那篇著名論文就是在此研究基礎(chǔ)上形成的*W. W. Ward, M. J. Cormier, An Energy Transfer Protein in Coelenterate Bioluminescence, Characterization of the Renilla Green-fluorescent protein, The Journal of Biological Chemistry, vol. 254, no. 3(1979), pp.781-788.。當(dāng)時(shí)的研究表明，海腎與多管水母的發(fā)光機(jī)理非常相似，但也存在不少差別。為加深對(duì)動(dòng)物發(fā)光現(xiàn)象的理解，考彌爾決定做一些有關(guān)海腎與多管水母發(fā)光機(jī)理的比較研究。是故，進(jìn)入20世紀(jì)80年代后，考彌爾把多管水母也列作自己的重點(diǎn)研究對(duì)象。由于對(duì)生物發(fā)光研究產(chǎn)生了濃厚興趣，故完成一期博士后研究后，普拉舍就轉(zhuǎn)至考彌爾門(mén)下，開(kāi)始從事水母素的克隆研究*M. J. Cormier, Nobel Prize Spotlights Basic Research, UGA Research Magazine, spring 2009, [2011-07-18], http://researchmagazine.uga.edu/aa/spring2009/spotlight.php.。

如眾所知，20世紀(jì)70年代初，重組DNA研究在美國(guó)取得重大突破。之后，基因技術(shù)獲得快速發(fā)展，以致進(jìn)入20世紀(jì)80年代后發(fā)達(dá)國(guó)家的不少實(shí)驗(yàn)室陸續(xù)掌握了使用微生物大量表達(dá)外源蛋白質(zhì)這項(xiàng)前沿技術(shù)。考彌爾實(shí)驗(yàn)室是其中的一名佼佼者。在考彌爾的指導(dǎo)下，普拉舍和實(shí)驗(yàn)室技術(shù)員麥坎(Richard O. McCann)合作，于20世紀(jì)80年代初就確定了水母素基因在多管水母DNA中的位置。此后，他們?cè)俳釉賲枺殖晒Φ貙?shí)現(xiàn)了脫輔基水母素(apoaequorin)基因在大腸桿菌中的表達(dá)。脫輔基水母素在有氧環(huán)境下用腔腸素(coelenterazine)進(jìn)行處理后可轉(zhuǎn)化為能夠發(fā)光的水母素，這意味著此后科學(xué)家們無(wú)需再去美國(guó)西北海岸捕撈多管水母就可以大量制取水母素*下村修：「イクオリンとGFPの発見(jiàn)」，『バイオサイエンス最前線』1998年第22期。。1985年2月，普拉舍等人公開(kāi)發(fā)表了這一研究成果*D. Prasher, R. O. McCann, M. J. Cormier, Cloning and Expression of the cDNA Coding for Aequorin, a Bioluminescent Calcium-binding Protein, Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 126, no. 3(1985), pp.1259-1268.。遵照考彌爾的建議，普拉舍隨后又啟動(dòng)了多管水母GFP基因的分離與復(fù)制研究*M. J. Cormier, Nobel Prize Spotlights Basic Research, UGA Research Magazine, spring 2009, [2016-06-16], http://researchmagazine.uga.edu/aa/spring2009/spotlight.php.。因瓦德等人此前已對(duì)多管水母GFP的組成結(jié)構(gòu)與生化特性展開(kāi)了一系列探索，故普拉舍以此為基礎(chǔ)很快獲得一個(gè)多管水母GFP基因片段的拷貝*M. J. Cormier, Nobel Prize Spotlights Basic Research, UGA Research Magazine, spring 2009, [2016-06-16], http://researchmagazine.uga.edu/aa/spring2009/spotlight.php; D. C. Prasher, V. K. Eckenrode, W. W. Ward, F. G. Prendergast, M. J. Cormier, Primary Structure of the Aequorea Victoria Green-fluorescent Protein, Gene, vol. 111, no. 2(1992), pp. 229-233.。后因普拉舍轉(zhuǎn)赴伍茲霍爾就任新職，故此項(xiàng)研究被暫時(shí)擱置。

1988年，也即在獲聘擔(dān)任海洋生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室助理研究員的第二年，普拉舍獲得美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)提供的為期三年、金額超過(guò)20萬(wàn)美元的研究資助，于是他按照資助協(xié)議在伍茲霍爾重新啟動(dòng)GFP基因的分離與復(fù)制研究。毋庸贅言，此項(xiàng)研究是同考彌爾等人合作進(jìn)行的。盡管此前已獲得一個(gè)多管水母GFP基因片段的拷貝，但它只含有168個(gè)氨基酸，而多管水母的GFP是由238個(gè)氨基酸組成的，這意味著分離出來(lái)的GFP基因片段少了30%的密碼子。為獲取完整的GFP基因，普拉舍再次遠(yuǎn)赴星期五港灣捕撈了一批多管水母，并用液氮對(duì)其進(jìn)行速凍處理。返回伍茲霍爾后，普拉舍將從多管水母中提取的DNA酶切成140萬(wàn)個(gè)片段。普拉舍原以為這些DNA片段中含有GFP基因的怎么也有成百上千個(gè)，可是逐個(gè)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，只有一個(gè)片段含有GFP基因。幸運(yùn)的是，費(fèi)盡千辛萬(wàn)苦分離出來(lái)的GFP基因是一個(gè)完整的GFP基因*M. Zimmer, Glowing Genes: A Revolution in Biotechnology.。之后，普拉舍使用細(xì)菌的質(zhì)粒作載體對(duì)GFP基因進(jìn)行大量復(fù)制，并確定了多管水母GFP的基因序列。1991年3月，他把這項(xiàng)研究成果整理成文，投給《基因》雜志。次年2月《基因》正式刊發(fā)了這篇論文*D. C. Prasher, V. K. Eckenrode, W. W. Ward, F. G. Prendergast, M. J. Cormier, Primary Structure of the Aequorea Victoria Green-fluorescent Protein, Gene, vol. 111, no. 2(1992), pp. 229-233.。不過(guò)，普拉舍并沒(méi)有實(shí)現(xiàn)GFP基因在異源生物體中的表達(dá)。

實(shí)際上，早在1987年，普拉舍就產(chǎn)生用多管水母GFP做示蹤分子來(lái)研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)活動(dòng)情況的想法*M. Zimmer, Douglas Prasher, [2011-07-18], http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/prasher.html.。這主要是因?yàn)椋?1)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)太小，用最先進(jìn)的電子顯微鏡也無(wú)法觀察。如果能把多管水母GFP和目的蛋白質(zhì)連在一起，無(wú)異于在目的蛋白質(zhì)上裝了一個(gè)燈泡，人們可以通過(guò)觀察GFP的熒光來(lái)了解目的蛋白質(zhì)的活動(dòng)情況。(2)下村修多年前就已揭示多管水母GFP是一種非常小的蛋白質(zhì)，將小蛋白質(zhì)連接到比較大的目的蛋白質(zhì)上一般不會(huì)對(duì)目的蛋白質(zhì)的功能產(chǎn)生影響。不過(guò)，普拉舍以為，多管水母GFP發(fā)光基團(tuán)的形成有可能需要體內(nèi)輔助因子或外源反應(yīng)底物提供幫助*D. C. Prasher, V. K. Eckenrode, W. W. Ward, F. G. Prendergast, M. J. Cormier, Primary Structure of the Aequorea Victoria Green-fluorescent Protein, Gene, vol. 111, no. 2(1992), pp. 229-233; M. Zimmer, Glowing Genes: A Revolution in Biotechnology.。因?yàn)楫?dāng)時(shí)的研究表明，即使是在有氧環(huán)境下，從生物體中提取的發(fā)光物質(zhì)，如水母素、熒光素等都不可能單獨(dú)發(fā)光。這意味著除非多管水母GFP是一個(gè)例外，否則人們很難實(shí)現(xiàn)其在異源生物細(xì)胞中的表達(dá)，也即不太可能在其他生物體中觀察到多管水母GFP發(fā)出的熒光。

由于對(duì)GFP基因在其他生物體中的表達(dá)缺乏信心，故普拉舍在美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)資助的科研經(jīng)費(fèi)告罄前都沒(méi)有將其用GFP做示蹤分子的想法完全付諸實(shí)施。當(dāng)他下決心啟動(dòng)GFP基因表達(dá)研究，并向美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院等機(jī)構(gòu)申請(qǐng)有關(guān)資助時(shí)，卻遭到拒絕，以致他不無(wú)遺憾地將揭開(kāi)GFP革命序幕的機(jī)會(huì)拱手讓給了別人*M. Zimmer, Glowing Genes: A Revolution in Biotechnology.。不過(guò)，用細(xì)菌的質(zhì)粒大量復(fù)制GFP基因技術(shù)的掌握，使普拉舍等人得以更方便地對(duì)GFP發(fā)光基團(tuán)的結(jié)構(gòu)展開(kāi)深入研究，以致1991年普拉舍和瓦德等人用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了下村修1979年提出的有關(guān)GFP發(fā)光基團(tuán)化學(xué)結(jié)構(gòu)的主要推測(cè)，同時(shí)提出不少有關(guān)GFP發(fā)光基團(tuán)分子結(jié)構(gòu)與發(fā)光機(jī)理的新見(jiàn)解。這些研究成果于1993年公開(kāi)發(fā)表在《生物化學(xué)》雜志上*C. W. Cody, D. C. Prasher, W. M. Westler, F. G. Prendergast, W. W. Ward, Chemical Structure of the Hexapeptide Chromophore of the Aequorea Green-fluorescent Protein, Biochemistry, vol. 32, no. 5(1993), pp. 1212-1218.。

申請(qǐng)多管水母GFP基因表達(dá)研究資助遭拒后，普拉舍接受美國(guó)海軍研究辦公室的資助，開(kāi)始開(kāi)發(fā)與水銀之類(lèi)的重金屬相遇后旋即發(fā)光的水母素變種*M. Zimmer， Glowing Genes: A Revolution in Biotechnology.。此后，普拉舍因未能通過(guò)海洋生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的終身職位評(píng)審而不得不先后轉(zhuǎn)至美國(guó)農(nóng)業(yè)部所屬的奧的斯植物保護(hù)中心、植物遺傳資源與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，美國(guó)宇航局旗下的AZ技術(shù)公司等機(jī)構(gòu)從事與GFP無(wú)甚關(guān)聯(lián)的研究*Wikipedia, Douglas Prasher, [2011-07-18], http://en.wikipedia.org/wiki/Douglas_Prasher; M. Herper, Biotech’s Glowing Breakthrough Wins Nobel Prize, Forbes, 2008-10-08,[2011-07-18], http://www.forbes.com/2008/10/08/nobel-chalfie-shimomura-tsien-biz-healthcare-cx_mh_1008gfp.html.。不斷拋棄先前的研究積累，展開(kāi)全新的研究，要做出一番業(yè)績(jī)談何容易！加上時(shí)運(yùn)不佳，以致普拉舍后來(lái)落魄時(shí)不得不跑到豐田汽車(chē)專(zhuān)賣(mài)店當(dāng)起了班車(chē)駕駛員*A. Gouveia, Shuttle Driver Reflects on Nobel Snub, Cape Cod Times， 2008-10-11, [2011-07-18], http://www.capecodonline.com/apps/pbcs.dll/article?AID=/20081011/NEWS/810110328.。

三、綠色熒光蛋白基因的表達(dá)

普拉舍放棄開(kāi)展多管水母GFP基因在異源生物細(xì)胞中的表達(dá)研究時(shí)，應(yīng)哥倫比亞大學(xué)從事線蟲(chóng)觸覺(jué)神經(jīng)研究的馬丁·查爾菲教授的請(qǐng)求，將含有多管水母GFP基因的質(zhì)粒提供給了查爾菲。此后，查爾菲和他的研究生合作，成功實(shí)現(xiàn)多管水母GFP基因在大腸桿菌和線蟲(chóng)中的表達(dá)，從而揭開(kāi)GFP革命的序幕。

查爾菲于1977年在哈佛大學(xué)獲生理學(xué)博士學(xué)位后，決定接受學(xué)友羅伯特·霍維茨(H. Robert Horvitz,1947—)的建議，赴英國(guó)劍橋大學(xué)跟隨悉尼·布倫納(Sydney Brenner,1927—)教授從事博士后研究*M. Zimmer, Glowing Genes: A Revolution in Biotechnology.。布倫納于20世紀(jì)60年代初期和DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)者之一克里克(Francis Crick, 1916—2004)合作解釋了蛋白質(zhì)翻譯的三元碼問(wèn)題之后，開(kāi)始另辟蹊徑專(zhuān)注于秀麗隱桿線蟲(chóng)研究。他用這種身長(zhǎng)僅一兩個(gè)毫米的透明線蟲(chóng)作模式生物，和其學(xué)生合作開(kāi)展一系列發(fā)育生物學(xué)研究。因在揭示器官發(fā)育和細(xì)胞程序化凋亡的遺傳調(diào)控機(jī)理方面做出創(chuàng)造性的貢獻(xiàn)，他和兩名學(xué)生——霍維茨、蘇爾斯頓(John E.Sulston, 1942—)一起被授予2002年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)*饒毅：《三位有趣的生物學(xué)家：2002年諾貝爾獎(jiǎng)獲得者》，[2011-07-18]， http://www.bioon.com/VIP/successway/sciroad/200310/1870.html。。在跟隨布倫納研究線蟲(chóng)期間，查爾菲對(duì)這種體細(xì)胞總數(shù)不到1000，壽命不超過(guò)4天，但在生理上與人體有著眾多相似之處的線蟲(chóng)產(chǎn)生了濃厚的興趣，以致1982年到哥倫比亞大學(xué)就任教職后一直把線蟲(chóng)作為主要研究對(duì)象。

20世紀(jì)80年代中期，查爾菲在研究線蟲(chóng)細(xì)胞中的基因和基因啟動(dòng)子的作用機(jī)理時(shí)，只能使用具有糖解作用的β-半乳糖苷酶基因作標(biāo)記，即將其連接在目的基因或基因啟動(dòng)子后面。采用這種方法存在一個(gè)問(wèn)題，那就是最終必須把線蟲(chóng)殺死，否則無(wú)法深入了解線蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)的基因或基因啟動(dòng)子的活動(dòng)情況*生化學(xué)若い研究者の會(huì)：『光るクラゲがノーベル賞をとった理由』，東京：日本評(píng)論社，2009年。。1988年初，在哥倫比亞大學(xué)舉辦的一個(gè)以發(fā)光生物為主題的討論班上，查爾菲獲悉人們已從多管水母身上提取到一種叫做GFP的熒光物質(zhì)。他當(dāng)即意識(shí)到可以嘗試使用這種熒光物質(zhì)的基因作報(bào)告基因，以解決自己在研究線蟲(chóng)細(xì)胞過(guò)程中遇到的諸多難題。經(jīng)過(guò)數(shù)日的調(diào)查，查爾菲了解到普拉舍正在從事多管水母GFP基因的分離與復(fù)制研究。于是他與普拉舍取得聯(lián)系，并提出希望合作開(kāi)展多管水母GFP基因在線蟲(chóng)中的表達(dá)研究*宮脇敦史：「2008年ノーベル化學(xué)賞――GFPの発見(jiàn),発現(xiàn),開(kāi)発の歴史」，『パリテイ』2008年第23卷第12期。。當(dāng)時(shí)，普拉舍只解讀完一個(gè)不完整的多管水母GFP基因的堿基對(duì)，故談不上和查爾菲開(kāi)展相關(guān)合作研究。1992年初，普拉舍解讀完多管水母GFP基因的全部堿基對(duì)后打電話通知查爾菲時(shí)，不巧查爾菲正在猶他大學(xué)度婚假，因此雙方?jīng)]能聯(lián)系上。普拉舍當(dāng)時(shí)誤以為查爾菲已經(jīng)離職*M. Herper, Biotech’s Glowing Breakthrough Wins Nobel Prize, Forbes, 2008-10-08, [2011-07-18], http://www.forbes.com/2008/10/08/nobel-chalfie-shimomura-tsien-biz-healthcare-cx_mh_1008gfp.html.。

1992年9月，一直沒(méi)有收到普拉舍分離多管水母GFP基因取得成功消息的查爾菲與研究生奧伊斯基興(Ghia Euskirchen)討論制定了一份有關(guān)使用GFP基因研究透明線蟲(chóng)的計(jì)劃。他們?cè)谶M(jìn)行文獻(xiàn)檢索時(shí)發(fā)現(xiàn)，普拉舍和考彌爾等半年前在《基因》雜志上合作發(fā)表了一篇有關(guān)多管水母GFP一級(jí)結(jié)構(gòu)的論文*宮脇敦史:「GFPをめぐる半世紀(jì)の歴史」，『科學(xué)』2009年第79卷第1期。。在這篇文章中，普拉舍等人報(bào)告了他們從事多管水母GFP基因分離、復(fù)制與測(cè)序研究所取得的進(jìn)展，不過(guò)在文章的末尾，他們把自己復(fù)制出的GFP稱(chēng)作脫輔基GFP*D. C. Prasher, V. K. Eckenrode, W. W. Ward, F. G. Prendergast, M. J. Cormier, Primary Structure of the Aequorea Victoria Green-fluorescent Protein, Gene, vol. 111, no. 2(1992), pp. 229-233.。言下之意是這種蛋白質(zhì)不含發(fā)光基團(tuán)，尚不能發(fā)光。盡管如此，查爾菲還是滿懷希望地聯(lián)系上普拉舍，并獲得普拉舍提供的含有多管水母GFP基因的質(zhì)粒*M. Herper, Biotech’s Glowing Breakthrough Wins Nobel Prize, Forbes, 2008-10-08, [2011-07-18], http://www.forbes.com/2008/10/08/nobel-chalfie-shimomura-tsien-biz-healthcare-cx_mh_1008gfp.html.。

收到含有多管水母GFP基因的質(zhì)粒之后，查爾菲便指示奧伊斯基興使用剛剛興起的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增GFP基因，然后再用大腸桿菌做GFP基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)。在查爾菲看來(lái)，無(wú)論這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)成功與否，它對(duì)研究生來(lái)講都是一次很好的鍛煉。經(jīng)過(guò)一個(gè)月的努力，奧伊斯基興終于在顯微鏡中觀察到大腸桿菌體內(nèi)發(fā)出的綠光*M. Zimmer, Glowing Genes: A Revolution in Biotechnology.。這意味著多管水母GFP無(wú)需任何輔助因子和反應(yīng)底物，就可以自行形成發(fā)光基團(tuán)。這項(xiàng)研究使查爾菲深受鼓舞。

查爾菲此前從未接觸過(guò)多管水母GFP基因，而且其實(shí)驗(yàn)室里并未配備與熒光蛋白研究有關(guān)的專(zhuān)用儀器設(shè)備。在這種情況下，向美國(guó)國(guó)家科學(xué)基金會(huì)等機(jī)構(gòu)申請(qǐng)GFP基因表達(dá)研究資助很難通過(guò)同行評(píng)審，即使僥幸通過(guò)，那也是半年后的事。深諳科技界競(jìng)爭(zhēng)規(guī)則的查爾菲沒(méi)有緣木求魚(yú)，他果斷地決定先用自主經(jīng)費(fèi)啟動(dòng)多管水母GFP基因在更為復(fù)雜的生物體——線蟲(chóng)中的表達(dá)研究*M. Zimmer, Glowing Genes: A Revolution in Biotechnology.。當(dāng)克服重重困難把多管水母GFP基因插入線蟲(chóng)目的基因及其啟動(dòng)子之間后，他們?cè)诰€蟲(chóng)的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)觀察到多管水母GFP發(fā)出的熒光，并確認(rèn)多管水母GFP對(duì)線蟲(chóng)神經(jīng)細(xì)胞無(wú)毒副作用。1994年2月，美國(guó)《科學(xué)》雜志刊發(fā)了這一里程碑性的研究成果，并在封面上刊登了查爾菲提供的帶有多個(gè)綠色熒光點(diǎn)的線蟲(chóng)配圖*M. Chalfie, Y. Tu, G. Euskirchen, W. W. Ward, D. C. Prasher, Green Fluorescent Protein as a Marker for Gene Expression, Science, vol. 263, no. 5148(1994), pp. 802-805.。

其實(shí)，當(dāng)時(shí)不只是查爾菲團(tuán)隊(duì)在從事多管水母GFP基因的表達(dá)研究。不過(guò)，其他團(tuán)隊(duì)大都未能在異源生物體上觀察到GFP發(fā)出的熒光。很多從事生物發(fā)光研究的學(xué)者研究受挫后都以為GFP和此前發(fā)現(xiàn)的所有發(fā)光物質(zhì)一樣需要特定的輔助因子或反應(yīng)底物參與作用才能發(fā)光，因此都沒(méi)有去深究GFP基因未能在異源生物體中獲得表達(dá)是否是因剪切GFP基因時(shí)出了問(wèn)題*宮脇敦史：「2008年ノーベル化學(xué)賞――GFPの発見(jiàn),発現(xiàn),開(kāi)発の歴史」，『パリテイ』2008年第23卷第12期。。換言之，從事生物發(fā)光研究的學(xué)者主要是從化學(xué)方面，而非從生物方面尋找敗因。查爾菲是從事發(fā)育生物學(xué)研究的，他對(duì)生物發(fā)光研究界流行的生物體內(nèi)的發(fā)光物質(zhì)獨(dú)自不能發(fā)光的觀點(diǎn)認(rèn)識(shí)有限，因此他果敢地向被生物發(fā)光研究學(xué)者認(rèn)為不可能的事發(fā)起了挑戰(zhàn)*W. W. Ward, Fluorescent Proteins: Who’s Got’Em and Why? Bioluminescence and Chemiluminescence: Progress & Current Applications, eds. by P. E. Stanley, L. J. Kricka, Singapore: World Scientific, 2002, pp. 123-126.。查爾菲團(tuán)隊(duì)研究后發(fā)現(xiàn)，很多團(tuán)隊(duì)之所以在異源生物體中觀察不到多管水母GFP發(fā)出的熒光，主要是因?yàn)樗麄兓谄绽岬难芯?，用限制性剪切酶剪切GFP基因時(shí)未將多余的堿基切除，以致多管水母GFP基因未能在細(xì)胞中獲得表達(dá)*M. Chalfie, Y. Tu, G. Euskirchen, W. W. Ward, D. C. Prasher, Green Fluorescent Protein as a Marker for Gene Expression, Science, vol. 263, no. 5148(1994), pp. 802-805.。

不過(guò)，1994年3月，《歐洲生物學(xué)化學(xué)會(huì)聯(lián)盟通訊》刊發(fā)了一篇與多管水母GFP基因表達(dá)有關(guān)的論文，它是由當(dāng)時(shí)正在加州大學(xué)圣地亞哥分校斯克里普斯海洋學(xué)研究所訪問(wèn)研究的日本窒素肥料株式會(huì)社的井上敏(Satoshi Inouye)與該所的研究員、日裔學(xué)者辻(Frederick I. Tsuji)合作完成的*S. Inouye, F. I. Tsuji, Aequorea Green Fluorescent Protein: Expression of the Gene and Fluorescence Characteristics of the Recombinant Protein, FEBS letters, vol. 341, no. 2-3(1994), pp. 277-280.。這是第二個(gè)在異源生物細(xì)胞中表達(dá)多管水母GFP基因取得成功的團(tuán)隊(duì)。1984年，他們倆還與日本九州大學(xué)的幾位學(xué)者一起獨(dú)立地克隆出水母素基因，但論文的發(fā)表日期比普拉舍和考彌爾的相關(guān)論文也晚了一個(gè)月*S. Inouye, M. Noguchi, Y. Sakaki, Y. Takagi, T. Miyata, S. Iwanaga, T. Miyata, F. I. Tsuji, Cloning and Sequence Analysis of cDNA for the Luminescent Protein Aequorin, PNAS, vol. 82, no. 10(1985), pp. 3154-3158.。

盡管美國(guó)《科學(xué)》雜志1994年2月刊發(fā)的查爾菲等人的論文正文不足兩頁(yè)，但它標(biāo)志著科學(xué)家們已打開(kāi)了用GFP對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行示蹤研究的大門(mén)。十年后，查爾菲也因此而榮幸地當(dāng)選美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院士。

四、綠色熒光蛋白突變體的開(kāi)發(fā)

普拉舍退出GFP克隆研究前，還將其獲得的含有多管水母GFP基因的質(zhì)粒無(wú)償?shù)靥峁┙o加州大學(xué)圣地亞哥分校的錢(qián)永健。此后，錢(qián)永健對(duì)多管水母GFP的結(jié)構(gòu)與功能展開(kāi)了一系列卓有成效的研究，并進(jìn)而開(kāi)發(fā)出一批發(fā)光效率更高、性能更加穩(wěn)定、顏色更為豐富的新型熒光蛋白，為科學(xué)家們提供了一個(gè)將不同的蛋白質(zhì)或細(xì)胞“染上”不同的顏色，借以跟蹤研究其活動(dòng)過(guò)程的工具箱。

出生于美國(guó)紐約的錢(qián)永健乃錢(qián)學(xué)森的堂侄。錢(qián)永健在哈佛大學(xué)獲得化學(xué)與物理學(xué)專(zhuān)業(yè)的學(xué)士學(xué)位后，轉(zhuǎn)赴英國(guó)劍橋大學(xué)留學(xué)。在劍橋大學(xué)，他一開(kāi)始迷上分子生物學(xué)，后來(lái)轉(zhuǎn)向海洋學(xué)，最后又轉(zhuǎn)向生理學(xué)，并于1977年獲博士學(xué)位。之后，他留在英國(guó)從事一段時(shí)間的博士后研究。1981年，錢(qián)永健返回美國(guó)就任加州大學(xué)伯克利分校教職，1989年轉(zhuǎn)任加州大學(xué)圣地亞哥分校藥理學(xué)教授以及化學(xué)與生物化學(xué)教授。

早在劍橋大學(xué)從事博士后研究期間，錢(qián)永健就發(fā)明一種可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的染料。當(dāng)時(shí)，測(cè)量細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的方法還相當(dāng)原始，即便使用下村修發(fā)現(xiàn)的水母素，也需要將其注射到細(xì)胞內(nèi)，這樣很容易對(duì)研究用細(xì)胞造成傷害。為此，錢(qián)永健發(fā)明了一種有機(jī)染料，這種染料分子無(wú)需注射即可穿透細(xì)胞壁。1981年獲得加州大學(xué)伯克利分校的教職后，錢(qián)永健又對(duì)自己發(fā)明的鈣染料進(jìn)行改進(jìn)，使其使用更方便，適用性更廣*郭曉強(qiáng)：《生命內(nèi)部世界變得五顏六色——綠色熒光蛋白質(zhì)改進(jìn)者錢(qián)永健簡(jiǎn)介》，《化學(xué)教育》2009年第4期。。

1989年轉(zhuǎn)到圣地亞哥分校后，錢(qián)永健的關(guān)注點(diǎn)由細(xì)胞內(nèi)的鈣離子轉(zhuǎn)向細(xì)胞內(nèi)的環(huán)腺苷酸(cAMP)。環(huán)腺苷酸被稱(chēng)作細(xì)胞內(nèi)的第二信使，它通過(guò)激活蛋白激酶來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。根據(jù)這一性質(zhì)，錢(qián)永健團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種熒光染料*S. R. Adams, A. T. Harootunian, Y. J. Buechler, S. S. Taylor, R. Y. Tsien, Fluorescence Ratio Imaging of Cyclic AMP in Single Cells, Nature, vol. 349, no. 6311(1991), pp. 694-697.。將蛋白激酶染上這種熒光染料后，再將其注入細(xì)胞內(nèi)，這樣人們便可以通過(guò)觀察蛋白激酶被激活的程度來(lái)了解環(huán)腺苷酸的活動(dòng)情況。顯然，使用這種方法甚為不便。因此，1992年4至5月間錢(qián)永健看到普拉舍和瓦德等人在《基因》雜志上發(fā)表的那篇文章后，頓覺(jué)眼前一亮，他仿佛看到了用多管水母GFP取代化學(xué)熒光染料開(kāi)展熒光標(biāo)記研究的曙光*李名揚(yáng)：《為生命上色：諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主──錢(qián)永健》，《科學(xué)人》2010年第3期。。

錢(qián)永健聯(lián)系上普拉舍后，得到可以免費(fèi)獲取多管水母GFP基因的答復(fù)。與長(zhǎng)期從事線蟲(chóng)觸覺(jué)神經(jīng)研究的查爾菲不同，主要從事化學(xué)熒光染料開(kāi)發(fā)的錢(qián)永健并不擅長(zhǎng)基因重組操作，而且其團(tuán)隊(duì)中當(dāng)時(shí)并無(wú)這方面的專(zhuān)才，因此其團(tuán)隊(duì)并沒(méi)有馬上開(kāi)展GFP表達(dá)研究，以致率先實(shí)現(xiàn)多管水母GFP基因在異源生物細(xì)胞中的表達(dá)之功被查爾菲團(tuán)隊(duì)搶走。1992年9月，一位受過(guò)分子遺傳學(xué)訓(xùn)練，名叫海姆(Roger Heim)的瑞士籍博士后研究人員加盟錢(qián)永健實(shí)驗(yàn)室。以此為契機(jī)，錢(qián)永健啟動(dòng)了對(duì)GFP的研究*李名揚(yáng)：《為生命上色：諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主──錢(qián)永健》，《科學(xué)人》2010年第3期。。其團(tuán)隊(duì)在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，多管水母GFP在有氧情況下才會(huì)發(fā)光，于是他們推斷，氧分子是其發(fā)光的唯一輔助物。由于氧氣無(wú)處不在，故他們進(jìn)一步推斷多管水母GFP基因可以在任何有機(jī)生物的細(xì)胞中獲得表達(dá)。

因野生型多管水母GFP有兩個(gè)激發(fā)峰，光穩(wěn)定性不好，而且熒光強(qiáng)度弱，需要紫外線照射的時(shí)間長(zhǎng)，故錢(qián)永健決定優(yōu)先從解決野生型多管水母GFP的諸多不足處入手，以促進(jìn)GFP標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用與普及。這樣，對(duì)多管水母GFP結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析與改造自然而然成為錢(qián)永健團(tuán)隊(duì)的研究重點(diǎn)。當(dāng)錢(qián)永健團(tuán)隊(duì)正在為如何下手才能快速有效地改良多管水母GFP發(fā)光性質(zhì)而苦惱時(shí)，傳來(lái)了凱利·穆利斯(Kary Mullis 1944—)因發(fā)明PCR技術(shù)、邁克爾·史密斯(Michael Smith 1932—2000)因發(fā)明對(duì)DNA特定位置實(shí)行定點(diǎn)突變的方法而獲1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的消息。穆利斯雖然在1984年就完成PCR技術(shù)的發(fā)明，但這項(xiàng)技術(shù)直到其同事于1988年從溫泉中分離出一株嗜熱桿菌之后才獲得推廣應(yīng)用。PCR技術(shù)的推廣應(yīng)用又為史密斯于1978年初次提出、1985年進(jìn)一步完善的基因定點(diǎn)突變方法的普及奠定了基礎(chǔ)*隋廣超、張庭芳：《基因工程技術(shù)的重大突破──1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)》，《大學(xué)化學(xué)》1994年第9卷第3期。。不難看出，1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)實(shí)際上獎(jiǎng)勵(lì)的是剛剛興起的兩項(xiàng)分子生物學(xué)技術(shù)。受這兩項(xiàng)新興技術(shù)的影響，錢(qián)永健團(tuán)隊(duì)決定采用隨機(jī)誘變的方式來(lái)改組GFP基因，進(jìn)而篩選出激發(fā)峰和熒光強(qiáng)度等都得到優(yōu)化的GFP衍生物。

錢(qián)永健團(tuán)隊(duì)先后制作6000種突變點(diǎn)不盡相同的多管水母GFP基因模型，并從其表達(dá)物中發(fā)現(xiàn)若干激發(fā)峰由紫外區(qū)移至藍(lán)光區(qū)、綠色熒光強(qiáng)度明顯增大的多管水母GFP變種，以及一種發(fā)藍(lán)色熒光和一種發(fā)青色熒光的多管水母GFP突變體。進(jìn)一步的研究表明，藍(lán)色熒光蛋白是因多管水母GFP中的第66位氨基酸——酪氨酸被轉(zhuǎn)換成組氨酸造成的；如果第66位的酪氨酸被色氨酸取代后則發(fā)青色的熒光。1994年12月，錢(qián)永健團(tuán)隊(duì)公開(kāi)發(fā)表了這些研究成果*R. Heim, D. C. Prasher, R. Y. Tsien, Wavelength Mutations and Post-translational Autooxidation of Green Fluorescent Protein, PNAS, vol. 91, no. 26(1994), pp. 12501-12504.。翌年2月，該團(tuán)隊(duì)又在英國(guó)的《自然》雜志上發(fā)文重點(diǎn)介紹一種單點(diǎn)突變后形成的增強(qiáng)型GFP——S65T。這種熒光蛋白與野生型多管水母GFP相比，光穩(wěn)定性和熒光強(qiáng)度獲得大幅度的改善，激發(fā)峰的波長(zhǎng)也提高到更方便使用的488納米*R. Heim, A. B. Cubitt, R. Y. Tsien, Improved Green Fluorescence, Nature, vol. 373, no. 6516(1995), pp. 663-664.。

多管水母GFP的發(fā)光性質(zhì)是由其結(jié)構(gòu)決定的。盡管普拉舍等人已經(jīng)測(cè)出組成多管水母GFP的238個(gè)氨基酸的排序，并且闡明其發(fā)光基團(tuán)的一級(jí)化學(xué)結(jié)構(gòu)，但是人們對(duì)多管水母GFP的晶體結(jié)構(gòu)，也即三維結(jié)構(gòu)仍知之不詳。這顯然不利于使用定點(diǎn)突變的方法改進(jìn)GFP的發(fā)光性能。為此，錢(qián)永健和俄勒岡州立大學(xué)的詹姆斯·雷明頓(S. James Remington)等人合作，使用X射線晶體衍射分析法于1996年解析出多管水母GFP的S65T突變體的晶體結(jié)構(gòu)*M. Orm?, A. Cubitt, K. Kallio, L. Gross, R. Tsien, S. Remington, Crystal Structure of the Aequorea Victoria Green Fluorescent Protein, Science, vol. 273, no. 5280(1996), pp. 1392-1395.。同年，萊斯大學(xué)的喬治·飛利浦(George Phillips)團(tuán)隊(duì)也使用相同方法，獨(dú)立解析出野生型多管水母GFP的晶體結(jié)構(gòu)*F. Yang, L. C. Moss, G. N. Jr. Phillips, The Molecular Structure of Green Fluorescent Protein, Nature Biotechnology, vol. 14, no. 10(1996), pp. 1246-1251.。結(jié)果表明，多管水母GFP是一個(gè)由11條β-折疊繞成的圓筒狀結(jié)構(gòu)，一條α螺旋的肽鏈沿圓筒中軸線分布。由第65至67位的三個(gè)氨基酸(絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸)組成的發(fā)光基團(tuán)嵌在α螺旋上，幾乎被包埋在圓筒的中心。

弄清多管水母GFP的三維結(jié)構(gòu)后，人們便不難理解為何將第66位的氨基酸——酪氨酸轉(zhuǎn)換成組氨酸或色氨酸后，所獲得的突變體便會(huì)發(fā)出藍(lán)色或青色的熒光，因?yàn)镚FP發(fā)光基團(tuán)的分子結(jié)構(gòu)已經(jīng)被改變了。那么，使用定點(diǎn)突變的方法改變多管水母GFP發(fā)光基團(tuán)周?chē)陌被峤Y(jié)構(gòu)，是否能制造出科研所需的新的GFP衍生物？順著這條思路，錢(qián)永健團(tuán)隊(duì)利用與雷明頓合作所取得的有關(guān)多管水母GFP晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，通過(guò)使用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，最終獲得一種新的GFP衍生物——黃色熒光蛋白。黃色熒光蛋白是錢(qián)永健團(tuán)隊(duì)采用定點(diǎn)突變方法將位于多管水母GFP發(fā)光基團(tuán)正下方的第203位氨基酸——蘇氨酸換成酪氨酸制成的*F. Yang, L. C. Moss, G. N. Jr. Phillips, The Molecular Structure of Green Fluorescent Protein, Nature Biotechnology, vol. 14, no. 10(1996), pp. 1246-1251.。

藍(lán)色、青色、黃色熒光蛋白的獲得，不僅為同時(shí)追蹤多種蛋白質(zhì)分子在細(xì)胞內(nèi)的活動(dòng)情況提供了方便，而且還為依據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移理論研究不同蛋白質(zhì)之間的相互作用提供了一個(gè)有效工具。但是，在查爾菲用多管水母GFP作示蹤分子取得成功后的最初幾年里，無(wú)論錢(qián)永健等人如何努力，都無(wú)法基于多管水母GFP分子結(jié)構(gòu)改造出應(yīng)用范圍更廣的紅色熒光蛋白。在各種可見(jiàn)熒光中，紅光的穿透性最強(qiáng)，如果有了紅色熒光蛋白，人們便可以更方便地觀察非透明動(dòng)物的細(xì)胞，乃至細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)活動(dòng)情況。而紅色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)乃錢(qián)永健團(tuán)隊(duì)于1996年“設(shè)計(jì)”出黃色熒光蛋白三年后之事。

五、綠色熒光蛋白類(lèi)似物的篩選與改進(jìn)

1999年，俄羅斯科學(xué)院舍米亞金和奧夫欽尼科夫(Shemyakin-Ovchinnikov)生物有機(jī)化學(xué)研究所(前身為天然化學(xué)產(chǎn)物研究所)的謝爾蓋·盧科亞諾夫(Sergey Lukyanov,1963—)團(tuán)隊(duì)，從珊瑚蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)了六種特性與多管水母GFP相似的蛋白質(zhì)，即GFP類(lèi)似物(GFP-like proteins,縮寫(xiě)為GFPs)。其中的四種發(fā)綠色熒光，一種發(fā)黃色熒光，一種發(fā)紅色熒光。在此之前，沒(méi)有一個(gè)人嘗試從珊瑚蟲(chóng)中尋找多管水母GFP類(lèi)似物，因?yàn)樯汉飨x(chóng)并非發(fā)光生物。紅色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)標(biāo)志著熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展又躍上一個(gè)新臺(tái)階。

錢(qián)永健團(tuán)隊(duì)在全力開(kāi)發(fā)多管水母GFP突變體時(shí)，另外一些團(tuán)隊(duì)則在設(shè)法找尋多管水母GFP類(lèi)似物。如前所述，早在20世紀(jì)70年代，瓦德和考彌爾就從發(fā)光海腎中提取到多管水母GFP類(lèi)似物。之后，人們又從其他發(fā)光生物中提取到數(shù)種多管水母GFP類(lèi)似物*M. Chalfie, Green Fluorescent Protein, Photochemistry and Photobiology, vol. 62, no. 4(1995), pp. 651-656.。這些GFP類(lèi)似物與多管水母GFP一樣，擔(dān)負(fù)著第二級(jí)發(fā)射器的使命，也即負(fù)責(zé)接收體內(nèi)發(fā)光蛋白質(zhì)生產(chǎn)出的頻率較高的光能，然后把它轉(zhuǎn)換成頻率較低、波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光能并將其發(fā)射出去*M. V. Mata, Y. A. Labas, J. Ugalde, Evolution of Function and Color in GFP-like Proteins, Green Fluorescent Protein: Properties, Applications and Protocols, Second Edition, eds. by M. Chalfie, S. R. Kain, New Jersey:John Wiley & Sons Inc., 2006, pp. 139-162.。由于現(xiàn)有的GFP類(lèi)似物和多管水母GFP一樣都是從發(fā)光生物中提取出來(lái)的，而且其發(fā)光機(jī)理與多管水母GFP也很相似，所以那些試圖尋找新型GFP類(lèi)似物的團(tuán)隊(duì)大多以發(fā)光生物為研究重點(diǎn)。盡管他們的篩選研究并非毫無(wú)收獲，但是歷經(jīng)千辛萬(wàn)苦尋獲的幾種GFP類(lèi)似物都沒(méi)有太大的應(yīng)用價(jià)值。篩選研究之所以收效甚微，主要是因?yàn)檫@些團(tuán)隊(duì)被多管水母GFP及其類(lèi)似物都是從發(fā)光生物中提取出來(lái)的表象迷惑了。此外，由于像多管水母這樣的發(fā)光生物是無(wú)色透明的，所以都以為多管水母GFP及其類(lèi)似物的存在與生物本身的顏色無(wú)關(guān)，關(guān)鍵是生物要能夠發(fā)光*M. V. Mata, K. A. Lukyanov, S. A. Lukyanov, Family of the Green Fluorecent Protein: Journey to the End of the Rainbow, Bioessays, vol. 24, no. 10(2002), pp. 953-959.。

和其他團(tuán)隊(duì)一樣，盧科亞諾夫團(tuán)隊(duì)一開(kāi)始也打算從發(fā)光生物入手，以期能夠從中篩選出具有較高應(yīng)用價(jià)值的新型GFP類(lèi)似物，尤其是紅色熒光蛋白。盧科亞諾夫1985年畢業(yè)于莫斯科大學(xué)胚胎學(xué)系，1994年在俄羅斯科學(xué)院生物有機(jī)化學(xué)研究所獲博士學(xué)位后，留在該所再生基因?qū)嶒?yàn)室擔(dān)任資深科學(xué)家，主要從事選擇性抑制PCR技術(shù)的改良研究和蠑螈、渦蟲(chóng)再生基因的克隆與測(cè)序研究。后者主要是在該所博士生米哈伊爾·馬茲(Mikhail Matz)的協(xié)助下展開(kāi)的*Laboratory of Molecular Technologies, Sergey A. Lukyanov, [2011-09-25], http://www.ibch.ru/lgr/cv/cv_luk.htm.。由于GFP類(lèi)似物的篩選研究與其先前從事的研究相近，故盧科亞諾夫決定抓住機(jī)遇及時(shí)啟動(dòng)自身?yè)碛幸欢ǜ?jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的GFP類(lèi)似物篩選研究。

但是，盧科亞諾夫和馬茲的GFP類(lèi)似物篩選研究計(jì)劃遭到俄羅斯科學(xué)院生態(tài)與進(jìn)化研究所主要從事生物發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)化研究的專(zhuān)家優(yōu)里·拉巴斯(Yulii A. Labas,1933—2008)的質(zhì)疑。拉巴斯向前來(lái)聽(tīng)取意見(jiàn)的盧科亞諾夫和馬茲指出：被他們列作篩選對(duì)象的發(fā)光生物大都和多管水母沒(méi)有近緣關(guān)系，且大都出現(xiàn)得比較晚。雖然發(fā)光生物體內(nèi)都含有發(fā)光蛋白質(zhì)，但是多數(shù)發(fā)光生物體內(nèi)未必有GFP類(lèi)似物。GFP類(lèi)似物是熒光蛋白，它和光能的生產(chǎn)無(wú)關(guān)。因此，不發(fā)光的生物體內(nèi)未必沒(méi)有GFP類(lèi)似物。一些珊瑚蟲(chóng)自身并不發(fā)光，但卻能發(fā)出綠色的熒光。為什么不發(fā)揮想象力，試一試這類(lèi)自身并不發(fā)光的熒光生物？*M. V. Mata, K. A. Lukyanov, S. A. Lukyanov, Family of the Green Fluorecent Protein: Journey to the End of the Rainbow, Bioessays, vol. 24, no. 10(2002), pp. 953-959.拉巴斯的建議對(duì)盧科亞諾夫和馬茲的觸動(dòng)很大。之后，二人便開(kāi)始將那些顏色鮮明并能發(fā)出熒光的珊瑚類(lèi)物種確定為優(yōu)先篩選對(duì)象。

篩選研究過(guò)程中，若采用下村修當(dāng)年所使用的方法，即先將熒光蛋白設(shè)法從生物體中分離出來(lái)，然后再進(jìn)行純化、分析，那么篩選研究將會(huì)非常耗時(shí)，而且好不容易提取到的蛋白質(zhì)未必就是想要的GFP類(lèi)似物。因此，盧科亞諾夫團(tuán)隊(duì)只能另辟蹊徑。在生物化學(xué)領(lǐng)域積累了豐富研究經(jīng)驗(yàn)的盧科亞諾夫經(jīng)過(guò)一番分析后意識(shí)到，如果珊瑚中確實(shí)有GFP類(lèi)似物，那么它的大小應(yīng)該和多管水母GFP差不多，而且一些重要部位的結(jié)構(gòu)，譬如發(fā)光基團(tuán)和β-折疊拐點(diǎn)處的氨基酸排序應(yīng)該和多管水母GFP相同。這意味著可以嘗試采用普拉舍當(dāng)年分離、復(fù)制多管水母GFP基因時(shí)所使用的技術(shù)，來(lái)解決從珊瑚中提取GFP類(lèi)似物之難題*M. Zimmer, Glowing Genes: A Revolution in Biotechnology.。研究技術(shù)路線確定之后，接下來(lái)就是付諸行動(dòng)了。

當(dāng)時(shí)俄羅斯尚未從蘇聯(lián)解體后的混亂中恢復(fù)過(guò)來(lái)，和西方同行相比科研經(jīng)費(fèi)談不上充裕的盧科亞諾夫團(tuán)隊(duì)一開(kāi)始并沒(méi)有跑到遠(yuǎn)離莫斯科的熱帶海洋去采集熒光珊瑚。他們用來(lái)研究的第一批熒光珊瑚是從莫斯科市內(nèi)的水族館商店廉價(jià)買(mǎi)來(lái)的。幾個(gè)月后，他們從一種被稱(chēng)為海葵的熒光珊瑚中找到了GFP基因，并成功地對(duì)該基因進(jìn)行了克隆*K. A. Lukyanov, D. M. Chudakov, A. F. Fradkov, Y. A. Labas, M. V. Mata, S. A. Lukyanov, Discovery and Properties of GFP-like Proteins from Nonbioluminescent Anthozoa, Green Fluorescent Protein: Properties, Applications and Protocols, Second Edition, pp. 121-138.。這項(xiàng)成就的取得證明拉巴斯的推測(cè)是正確的，盧科亞諾夫確定的研究技術(shù)路線是可行的。此后，盧科亞諾夫團(tuán)隊(duì)士氣大增，他們遠(yuǎn)赴印度洋、西太平洋采集了多種色澤鮮明的珊瑚蟲(chóng)。在莫斯科的實(shí)驗(yàn)室里將這些珊瑚蟲(chóng)中與顏色有關(guān)的DNA分離出來(lái)，并進(jìn)行擴(kuò)增之后，他們找出了重要部位的氨基酸排序與多管水母GFP相同的六種蛋白質(zhì)。進(jìn)一步研究表明，這六種蛋白質(zhì)的熒光性質(zhì)與多管水母GFP有著驚人的相似之處，且能在青蛙和哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞中獲得高效表達(dá)。其中，一種發(fā)紅色熒光，一種發(fā)黃色熒光，剩下的四種則發(fā)綠色熒光。1999年10月，《自然—生物技術(shù)》雜志刊發(fā)了這一研究成果*M. V. Matz, A. F. Fradkov, Y. A. Labas, A. P. Savitsky, A. G. Zaraisky, M. L. Markelov, S. A. Lukyanov, Fluorescent Proteins from Nonbioluminescent Anthozoa Species, Nature Biotechnology, vol. 17, no. 10(1999), pp. 969-973.。

2000年，已擔(dān)任生物有機(jī)化學(xué)研究所分子技術(shù)實(shí)驗(yàn)室(前身為再生基因?qū)嶒?yàn)室)主任的盧科亞諾夫，率領(lǐng)團(tuán)隊(duì)使用錯(cuò)配PCR技術(shù)篩選發(fā)光速度更快、亮度更高的紅色熒光蛋白突變體時(shí)意外地發(fā)現(xiàn)，有一種突變體，它一開(kāi)始發(fā)出的熒光呈綠色，之后在24小時(shí)內(nèi)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色、橘黃色和紅色。利用這一特性，他們開(kāi)發(fā)出一種熒光鐘，借以了解基因啟動(dòng)子的活性隨時(shí)間變化的情況*A. Terskikh, A. Fradkov, G. Ermakova, A. Zaraisky, P. Tan, A. V. Kajava, X. N. Zhao, S. Lukyanov, M. Matz, S. Kim, I. Weissman, P. Siebert, “Fluorescent Timer”: Protein that Changes Color with Time, Science, vol. 290, no. 5496(2000), pp. 1585-1588.。而且，有人據(jù)此推測(cè)GFP是紅色熒光蛋白受損后固化下來(lái)的產(chǎn)物。后來(lái)人們發(fā)現(xiàn)，紅色熒光蛋白中的第83位氨基酸被替換之后，它就只能發(fā)綠色熒光*M. Zimmer, Glowing Genes: A Revolution in Biotechnology.。這項(xiàng)研究為上述推測(cè)提供了一個(gè)再好不過(guò)的注腳。此外，2000年，盧科亞諾夫團(tuán)隊(duì)還從非熒光生物溝迎風(fēng)海葵(Anemoniasulcata)中提取到紫色的GFP類(lèi)似物*K. A. Lukyanov, A. F. Fradkov, N. G. Gurskaya, M. V. Matz, Y. A. Labas, A. P. Savitsky, M. L. Markelov, A. G. Zaraisky, X. Zhao, Y. Fang, W. Tan, S. A. Lukyanov, Natural Animal Coloration Can Be Determined by a Nonfluorescent Green Fluorescent Protein Homolog, The Journal of Biological Chemistry, vol. 275, no. 34(2000), pp. 25879-25882.。這樣，與彩虹兩側(cè)同色的GFP類(lèi)似物都被盧科亞諾夫團(tuán)隊(duì)找到了。

由于波長(zhǎng)較長(zhǎng)的紅色熒光蛋白的應(yīng)用前景非常廣，所以它引起人們的高度關(guān)注。2000年10月，馬茲就和雷明頓團(tuán)隊(duì)合作完全解析清楚了它的晶體結(jié)構(gòu)*D. Yarbrough, R. M. Wachter, K. Kallio, M. V. Matz, S. J. Remington, Refined Crystal Structure of DsRed, a Red Fluorescent Protein from Coral, at 2.0-? Resolution, PNAS, vol. 98, no. 2(2001), pp. 462-467.。與此同時(shí)，美國(guó)的另一個(gè)團(tuán)隊(duì)也獨(dú)立地解明了紅色熒光蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，而且還搶先一個(gè)月發(fā)表了成果*M. A. Wall, M. Socolich, R. Ranganathan, The Structural Basis for Red Fluorescence in the Tetrameric GFP Homolog DsRed, Nature Structural Biology， vol. 7, no. 12(2000), pp. 1133-1138.。雖然紅色熒光蛋白的晶體結(jié)構(gòu)與多管水母GFP的晶體結(jié)構(gòu)極其相似，但它通常都以四聚體形態(tài)出現(xiàn)。這樣，用其標(biāo)記目的蛋白質(zhì)時(shí)，很容易引起目的蛋白質(zhì)性質(zhì)的變化。2002年，錢(qián)永健團(tuán)隊(duì)成功地開(kāi)發(fā)出單體形態(tài)的紅色熒光蛋白突變體*R. E. Campbell, O. Tour, A. E. Palmer, P. A. Steinbach, G. S. Baird, D. A. Zacharias, R. Y. Tsien, A Monomeric Red Fluorescent Protein, PNAS, vol. 99, no. 12(2002), pp. 7877-7882.。此后，紅色熒光蛋白就和多管水母GFP一樣，可以很方便地用于標(biāo)記研究。由于紅色熒光蛋白基因是從生活在熱帶海洋中的珊瑚蟲(chóng)里提取的，所以它在室溫下的表達(dá)速度比從生活在北太平洋的多管水母中提取的多管水母GFP基因更快。

六、結(jié)論

通過(guò)上述考察，我們可以得出如下結(jié)論：

1.1962年，在普林斯頓大學(xué)做博士后研究的下村修在開(kāi)展多管水母發(fā)光物質(zhì)研究時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)“綠色蛋白質(zhì)”。

2.1969年，哈佛大學(xué)的伍迪·哈斯廷和詹姆斯·莫林在研究腔腸動(dòng)物發(fā)光蛋白質(zhì)特性時(shí)，再次“發(fā)現(xiàn)”了多管水母“綠色蛋白質(zhì)”，并將其命名為“Green Fluorescent Protein”，即綠色熒光蛋白。

3.1979年，下村修在研究多管水母綠色熒光蛋白分子的發(fā)光機(jī)理過(guò)程中，受海螢研究的啟發(fā)，推測(cè)出多管水母綠色熒光蛋白分子發(fā)光基團(tuán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

4．1991年，道格拉斯·普拉舍在美國(guó)伍茲霍爾海洋生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室工作期間，用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了下村修推測(cè)出的結(jié)構(gòu)。同年，他還成功地分離出多管水母綠色熒光蛋白基因，并使用細(xì)菌的質(zhì)粒作載體對(duì)其進(jìn)行復(fù)制，確定了多管水母綠色熒光蛋白的基因序列。

5.1993年，在美國(guó)哥倫比亞大學(xué)執(zhí)教的馬丁·查爾菲使用普拉舍提供的含有多管水母綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒，做綠色熒光蛋白基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)時(shí)取得成功，先后從大腸桿菌的體內(nèi)和線蟲(chóng)的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)觀察到多管水母綠色熒光蛋白發(fā)出的熒光，實(shí)現(xiàn)綠色熒光蛋白在異體內(nèi)的表達(dá)。

6.1994年，加州大學(xué)圣地亞哥分校的錢(qián)永健基于普拉舍等人的研究，采用剛剛興起的隨機(jī)誘變方法改組綠色熒光蛋白基因時(shí)，獲得一種光穩(wěn)定性和熒光強(qiáng)度都好于野生型的多管水母綠色熒光蛋白S65T突變體，以及一種發(fā)藍(lán)色熒光和一種發(fā)青色熒光的多管水母綠色熒光蛋白突變體。

7.1996年，錢(qián)永健和俄勒岡州立大學(xué)的詹姆斯·雷明頓等人合作，解析出多管水母綠色熒光蛋白S65T突變體的晶體結(jié)構(gòu)。同年，萊斯大學(xué)的喬治·飛利浦團(tuán)隊(duì)也完整地解析出野生型多管水母綠色熒光蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。

8．1996年，錢(qián)永健團(tuán)隊(duì)利用與雷明頓合作所取得的有關(guān)綠色熒光蛋白晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，通過(guò)使用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，成功地開(kāi)發(fā)出一種新的綠色熒光蛋白衍生物——黃色熒光蛋白。綠色、藍(lán)色、青色、黃色熒光蛋白的獲得，為同時(shí)追蹤多種蛋白質(zhì)分子在細(xì)胞內(nèi)的活動(dòng)情況提供了方便。

9．1999年，俄羅斯的盧科亞諾夫團(tuán)隊(duì)在篩選具有較高應(yīng)用價(jià)值的新型綠色熒光蛋白類(lèi)似物，尤其是紅色熒光蛋白的過(guò)程中，從珊瑚蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)四種發(fā)綠色熒光、一種發(fā)黃色熒光和一種發(fā)紅色熒光的綠色熒光蛋白類(lèi)似物。第二年，該團(tuán)隊(duì)又從非熒光生物溝迎風(fēng)?？刑崛〉阶仙木G色熒光蛋白類(lèi)似物。

10. 2002年，錢(qián)永健團(tuán)隊(duì)成功地開(kāi)發(fā)出單體形態(tài)的紅色熒光蛋白突變體，解決了紅色熒光蛋白通常以四聚體形態(tài)出現(xiàn)，用其標(biāo)記目的蛋白質(zhì)時(shí)容易引起蛋白質(zhì)性質(zhì)變化的難題。更適合作為標(biāo)識(shí)的紅色熒光蛋白的問(wèn)世，標(biāo)志著熒光蛋白標(biāo)記法的應(yīng)用與普及步入一個(gè)新時(shí)代。

很明顯，自下村修1962年發(fā)現(xiàn)多管水母綠色熒光蛋白，到查爾菲1993年實(shí)現(xiàn)多管水母綠色熒光蛋白在異源生物體中的表達(dá)，整整經(jīng)歷了31年。在這31年里，盡管下村修推測(cè)出多管水母綠色熒光蛋白分子發(fā)光基團(tuán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，普拉舍成功地對(duì)多管水母綠色熒光蛋白基因進(jìn)行分離與復(fù)制，并確定其基因序列，從而深化人們對(duì)多管水母綠色熒光蛋白結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的認(rèn)識(shí)，使人們無(wú)須大量捕撈野生多管水母就可以批量制備多管水母綠色熒光蛋白，但是，在此期間，人們始終未能為多管水母綠色熒光蛋白找到應(yīng)用之途，科學(xué)發(fā)現(xiàn)始終未能轉(zhuǎn)化為技術(shù)發(fā)明。

多管水母綠色熒光蛋白的研究由基礎(chǔ)研究階段邁入應(yīng)用研究階段的標(biāo)志，是查爾菲成功地實(shí)現(xiàn)了多管水母綠色熒光蛋白在異源生物體中的表達(dá)。查爾菲1993年進(jìn)行活細(xì)胞示蹤實(shí)驗(yàn)時(shí)，能夠從大腸桿菌的體內(nèi)和線蟲(chóng)的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)觀察到多管水母綠色熒光蛋白發(fā)出的熒光，無(wú)疑與下村修、普拉舍等人開(kāi)展的基礎(chǔ)研究有關(guān)。沒(méi)有眾多科學(xué)家的前期研究積累，便不會(huì)有查爾菲的重大研究突破。查爾菲實(shí)現(xiàn)多管水母綠色熒光蛋白在異源生物體中的表達(dá)，既是一項(xiàng)科學(xué)發(fā)現(xiàn)，也是一項(xiàng)技術(shù)發(fā)明。說(shuō)其是科學(xué)發(fā)現(xiàn)，是因?yàn)椴闋柗朴脤?shí)驗(yàn)證明多管水母綠色熒光蛋白無(wú)需任何輔助因子和反應(yīng)底物，就可以自行形成發(fā)光基團(tuán)。說(shuō)其是技術(shù)發(fā)明，是因?yàn)椴闋柗朴脤?shí)驗(yàn)證明可以使用多管水母綠色熒光蛋白來(lái)進(jìn)行生物分子示蹤。這種新方法的發(fā)明，為生物學(xué)的大發(fā)展提供了一種全新的工具，開(kāi)啟了使用生物熒光材料進(jìn)行生物分子示蹤研究的先河。

盡管查爾菲首創(chuàng)了使用多管水母綠色熒光蛋白進(jìn)行生物分子示蹤研究的新方法，但多管水母綠色熒光蛋白并非理想的生物熒光標(biāo)記材料，而且只有綠色熒光蛋白時(shí)，人們無(wú)法同時(shí)進(jìn)行多細(xì)胞跟蹤研究。這樣一來(lái)，如何進(jìn)一步改進(jìn)綠色熒光蛋白示蹤效果，研制更多顏色的熒光蛋白，就成為擺在科學(xué)家面前的一項(xiàng)重要課題。針對(duì)這一需求，錢(qián)永健團(tuán)隊(duì)自1994年起使用剛剛興起的隨機(jī)誘變方法，開(kāi)發(fā)出多種不同顏色的多管水母綠色熒光蛋白突變體。但是，這些突變體的熒光激發(fā)波長(zhǎng)都小于綠色熒光蛋白。因此，在多管水母綠色熒光蛋白的晶體結(jié)構(gòu)被完全解明之后，錢(qián)永健1996年又通過(guò)改造多管水母綠色熒光蛋白的分子結(jié)構(gòu)，“設(shè)計(jì)”出一種熒光激發(fā)波長(zhǎng)更長(zhǎng)的黃色熒光蛋白。錢(qián)永健在1994—1996年的三年里所開(kāi)展的綠色熒光蛋白改良研究，可以說(shuō)是在應(yīng)用方向已經(jīng)相當(dāng)明確的情況下開(kāi)展的一種旨在滿足分子生物學(xué)發(fā)展需求的技術(shù)開(kāi)發(fā)活動(dòng)。

由于在可見(jiàn)光中，紅色熒光蛋白的熒光激發(fā)波長(zhǎng)最長(zhǎng)，所以更適合作示蹤材料。問(wèn)題是如何開(kāi)發(fā)這種能夠更好滿足生物研究需求的紅色熒光蛋白。經(jīng)過(guò)不斷探索，俄羅斯科學(xué)家盧科亞諾夫最終獨(dú)辟蹊徑，于1999年從非發(fā)光生物——珊瑚蟲(chóng)中分離出紅色熒光蛋白基因。但是，使用從珊瑚中分離出的紅色熒光蛋白基因制備的紅色熒光蛋白通常都以四聚體形態(tài)出現(xiàn)，仍然不適合做生物熒光標(biāo)記材料。因此，研制單體形態(tài)的紅色熒光蛋白成為當(dāng)務(wù)之急。最終成功解決這一難題的仍然是錢(qián)永健，時(shí)間是2002年。此后，科學(xué)家們便可以很方便地將不同的蛋白質(zhì)或細(xì)胞“染上”不同的顏色，借以跟蹤研究其活動(dòng)過(guò)程。

要而言之，盡管很多科學(xué)家都參與了多管水母綠色熒光蛋白的研究開(kāi)發(fā)競(jìng)爭(zhēng)，而且很多參與者都做出了原創(chuàng)性的貢獻(xiàn)，但是做出具有里程碑意義的開(kāi)創(chuàng)性貢獻(xiàn)的只有兩人，一是下村修，二是查爾菲。不過(guò)，如果沒(méi)有錢(qián)永健的研究貢獻(xiàn)，使用生物熒光標(biāo)記材料進(jìn)行蛋白質(zhì)或細(xì)胞示蹤研究便不可能快速地獲得廣泛普及，分子生物學(xué)也就不可能獲得像今日這樣突飛猛進(jìn)的發(fā)展。因此，瑞典皇家科學(xué)院決定將2008年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予對(duì)多管水母綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)、表達(dá)和開(kāi)發(fā)做出杰出貢獻(xiàn)的三位科學(xué)家下村修、馬丁·查爾菲和錢(qián)永健，乃理所應(yīng)當(dāng)。

責(zé)任編校：余沉

DOI：10.13796/j.cnki.1001-5019.2016.04.002

中圖分類(lèi)號(hào)：G31

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5019(2016)04-0008-14

基金項(xiàng)目：北京市科技計(jì)劃項(xiàng)目(Z151100002615005)

作者簡(jiǎn)介：周程，北京大學(xué)哲學(xué)系暨科學(xué)與社會(huì)研究中心教授，博士生導(dǎo)師(北京100871)。