鄭麗慧，徐 江，李西文，丁曉萍，肖 凌，汪 波，李丹平＊＊

（1.湖北中醫(yī)藥大學 武漢 430065；2.湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院 武漢 430075；3.中國中醫(yī)科學院中藥研究所 北京 100700）

基于ITS2序列鑒定紅白二丸藥材及其近緣易混品＊

鄭麗慧1,2，徐 江3，李西文3，丁曉萍2，肖 凌2，汪 波2，李丹平2＊＊

（1.湖北中醫(yī)藥大學 武漢 430065；2.湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院 武漢 430075；3.中國中醫(yī)科學院中藥研究所 北京 100700）

目的：基于ITS2序列建立紅白二丸藥材及其近緣易混品的分子鑒定方法。方法：共收集67份紅白二丸藥材（中華秋海棠）及其近緣易混品（秋海棠、掌裂葉秋海棠和柔毛秋海棠），提取總DNA、PCR擴增ITS2序列并進行雙向測序，通過CodonCode Aligner V4.2.1對測序 序列進行質(zhì)量分析和拼接，采用MEGA 6.0進行多序列比對分析，并基于最近距離法和建樹法（NJ樹和UPGMA樹）對紅白二丸藥材及其近緣易混品進行物種鑒定。結(jié)果：最近距離法和建樹法的結(jié)果均表明中華秋海棠與其近緣易混品掌裂葉秋海棠、柔毛秋海棠能有效區(qū)分，但其與秋海棠未能區(qū)分開（秋海棠與中華秋海棠為原亞種與亞種的關(guān)系）。結(jié)論：ITS2序列可以有效區(qū)分紅白二丸藥材及其近緣易混品的物種基原，可以作為紅白二丸藥材的分子鑒定方法，為紅白二丸藥材的真?zhèn)舞b別和保證臨床用藥安全提供有效的技術(shù)支持。

DNA條形碼 ITS2序列 紅白二丸 近緣易混品

秋海棠屬藥用歷史始載于公元1765年的《本草綱目拾遺》，歷史悠久，療效確切，在10多個民族被廣泛使用[1]。紅白二丸為秋海棠科Begoniaceae植物中華秋海棠Begonia sinensis A.DC.的塊莖或全草，又稱紅黑二丸、巖丸子、鴛鴦七、一點血、山海棠，其性味苦、酸、平，在土家族、苗族、白族、傣族、拉祜族、仡佬族等少數(shù)民族常被用來治療月經(jīng)不調(diào)、跌打損傷和痢疾等癥[2-5]。

部分中草藥的“同名異物”現(xiàn)象給中草藥安全有效使用帶來極大的隱患。由于歷代本草記載不一致，各地民間的用藥習慣不同，以及秋海棠屬藥材原植物、藥用部位形態(tài)非常相似等原因，民間常將中華秋海棠與同屬植物秋海棠Begonia evansiana Andr.的塊莖或全草（秋海棠）、掌裂葉秋海棠Begonia pedatifida Levl.的根狀莖（水八角）和柔毛秋海棠Begonia henryi Hemsl.的塊莖（巖丸子）都作為紅白二丸藥材使用[6-9]，但它們的功能主治并不完全相同[10]，造成了紅白二丸藥材 的誤用和混用。目前，秋海棠屬藥材的鑒定多集中在傳統(tǒng)的性狀、顯微鑒別等方面[11-15]。這些方法的主觀性較大、特異性不強，無法滿足中草藥去偽存真的需求。因此，急需一種快速、穩(wěn)定的方法來準確鑒別紅白二丸藥材及其近緣易混品。

DNA條形碼技術(shù)具有準確、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好、操作簡便等特點，是當前物種鑒定的研究 熱點[16-21]。目前，中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則已納入《中國藥典》2010年版第三增補本附錄及《中國藥典》2015年版指導(dǎo)原則[22，23]，已在多種動植物藥材及其混偽品的鑒定中得到了廣泛的應(yīng)用［23-30］。本研究利用ITS2序列對紅白二丸藥材及其近緣易混品進行DNA條形碼鑒定研究，可為紅白二丸藥材的快速、準確鑒定及其安全用藥提供技術(shù)保障和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗共收集了紅白二丸藥材（中華秋海棠B. sinensis的塊莖、全草）及其近緣易混品（秋海棠B. evansiana的塊莖、全草，掌裂葉秋海棠B. pedatifida的根狀莖，柔毛秋海棠B. henryi的塊莖）共4個物種67份樣品，以上樣品均經(jīng)中南民族大學萬定榮教授鑒定，樣品信息詳見表 1。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

取干燥藥材經(jīng)75%乙醇擦拭藥材表面后稱取50 mg（原植物干燥葉片稱取30-40 mg），高通量組織球磨儀研磨2 min（50 Hz），利用植物DNA提取試劑盒（批號：03428，北京天根生化科技有限公司公司）提取總DNA，葉片樣品65℃水浴30 min，塊莖樣品加核分離液（100 mmol·L-1，Tris-HCL，pH=8.0；20 mmol·L-1EDTA，pH=8.0；0.7 mmol·L-1，NaCl，2% PVP40，0.4% β-巰基乙醇）[31]洗滌，每次800 μL，洗滌3次后，65℃水浴3 h，其余步驟按照試劑盒說明進行。

1.2.2 PCR擴增及測序

ITS2序列擴增及測序的通用引物ITS2F為：5′-ATGCGATACTTGGT GTGAAT-3′，ITS3R為：5′-GA CGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。PCR反應(yīng)體積為25 μL，體系內(nèi)含2×Tag PCRMaster Mix（批號：261742AX，北京艾德萊生物科技有限公司）12.5 μL、引物各1.0 μL（2.5 μmol·L-1）、模板DNA為2 μL，加滅菌雙蒸水至25 μL。擴增程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，40個循環(huán)，72℃延伸10min[32]。PCR擴增產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將條帶單一且清晰的PCR產(chǎn)物用全自動DNA測序儀（型號：2720XL，美國Applied Biosystems公司）進行雙向測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

將測序后的序列使用CodonCode Aligner V4.2.4（美國CodonCode公司）校對拼接，去除引物區(qū)，同時基于隱馬爾可夫模型HMMer注釋除去5.8S 和28S，從而獲得ITS2序列[34]。所有序列用軟件 MEGA 6.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）進行比對分析[35]，并基于Kimura 2 Paramete（K2P）雙參數(shù)模型計算種內(nèi)、種間遺傳距離分析，用鄰接（Neighbor Joining，NJ）法、（UPGMA）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，利用Bootstrap（1 000次）檢驗各分支的支持率。

表1 紅白二丸藥材及其近緣易混品

2 結(jié)果與分析

2.1 紅白二丸藥材及其近緣易混品序列變異分析

紅白二丸藥材及其近緣易混品的序列長度在226-310 bp，其ITS2序列特征及遺傳距離見表2。

中華秋海棠（B. sinensis）的ITS2序列共22條，序列平均長度309 bp，平均GC含量為60.2%，有12個變異位點，9個單倍型，A2和A6是中華秋海棠主要的單倍型。紅白二丸藥材ITS2序列種內(nèi)變異位點見表3。

表2 紅白二丸及其近緣易混品的ITS2序列特征及遺傳距離

表3 紅白二丸藥材ITS2序列種內(nèi)變異位點

秋海棠（B. evansiana）ITS2序列共14條，序列平均長度308 bp，平均GC含量為60.1%，有3個變異位點，分別是197位點C-T變異、265位點T-C 或T-Y變異、289位點G-A變異，5個單倍型。

掌裂葉秋海棠（B. pedatifida）ITS2序列共21條，序列平均長度310 bp，平均GC含量為58.6%，有5個變異位點，分別是18位點C-T變異，45位點T-A變異，47位點、93位點C-G變異，120位點G-A變異，6個單倍型。

柔毛秋海棠（B. henryi）ITS2序列共10條，序列平均長度246 bp，平均GC含量為61.4% ，有9個變異位點，分別是19位點A-G變異、194位點A-T變異、201位點G-T變異，210位點、213位點G-C變異，217位點、219位點A-C變異，221位點T-G變異，230位點G-A變異，5個單倍型。

2.2 紅白二丸藥材及其近緣易混品遺傳距離分析

基于ITS2序列的K2P遺傳距離分析結(jié)果表明，中華秋海棠的最大種內(nèi)距離為0.040 3；在中華秋海棠與3種近緣易混品的種間最小遺傳距離中，中華秋海棠與柔毛秋海棠的距離最遠，為0.144 6；其次是中華秋海棠與掌裂葉秋海棠，為0.095 6；中華秋海棠與秋海棠的最近，為0.000 0。紅白二丸藥材及其近緣易混品的種內(nèi)種間K2P遺傳距離見表2。紅白二丸藥材的種內(nèi)K2P遺傳距離及其與各近緣易混品的種間K2P遺傳距離見表4。

2.3 紅白二丸藥材及其近緣易混品ITS2序列聚類分析

基于ITS2序列構(gòu)建紅白二丸藥材及其近緣易混品UPGMA樹（圖1）和NJ樹（圖2），2種方法均采用K2P距離，并以Bootstrap作1 000次可信度分析，以評價分支的統(tǒng)計學意義和可靠性。由圖1所示結(jié)果可以看出，柔毛秋海棠10個樣本聚為一支，其單系分支支持率為100%；掌裂葉秋海棠21個樣本聚為一支，其單系分支支持率為100%；中華秋海棠與秋海棠聚為一大支。同時，NJ樹得到的結(jié)果與UPGMA樹得到的結(jié)果類似，掌裂葉秋海棠和柔毛秋海棠均單獨聚為一支，秋海棠和中華秋海棠聚為一大支。

表4 紅白二丸種內(nèi)K2P遺傳距離及其與各近緣易混品的種間K2P遺傳距離

圖1 基于ITS2序列構(gòu)建紅白二丸藥材及其近緣易混品UPGMA樹

3 討論

3.1 DNA提取與PCR擴增

本實驗采用的是植物DNA試劑盒提取法提取67份樣品總DNA，提取效率高、方便。通過實驗發(fā)現(xiàn)：第一次PCR體系中模板DNA的量是2 μL，PCR成功率為50%，然后將第一次PCR失敗的樣品DNA進行濃度測定，發(fā)現(xiàn)濃度偏高，其中最高的3個樣品濃度達到了1 410 ng·μL-1、911 ng·μL-1和835 ng·μL-1。于是將PCR失敗樣品的DNA模板量改為1 μL，水相應(yīng)的增加1 μL，重新PCR，結(jié)果電泳檢測條帶單一清晰，PCR成功率達到了100%。這表明PCR體系中模板DNA濃度過高會導(dǎo)致PCR擴增失敗。因此，合適的模板DNA濃度是保證PCR擴增成功的重要因素之一。

3.2 紅白二丸藥材及其近緣易混品的鑒定

基于ITS2序列的K2P遺傳距離分析結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的22份中華秋海棠的種內(nèi)最大遺傳距離為0.040 3，中華秋海棠與其近緣易混品掌裂葉秋海棠、柔毛秋海棠、秋海棠間的最小種間遺傳距離為分別為0.095 6、0.144 2、0.000 0。除秋海棠外，中華秋海棠與掌裂葉秋海棠、柔毛秋海棠的最小種間遺傳距離均遠遠大于中華秋海棠的種內(nèi)最大遺傳距離，這表明中華秋海棠與其近緣易混品掌裂葉秋海棠、柔毛秋海棠被很好的區(qū)分；而中華秋海棠與秋海棠則不能被有效區(qū)分。

圖2 基于ITS2序列構(gòu)建紅白二丸藥材及其近緣易混品NJ樹

基于UPGMA法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（UPGMA樹）是在假設(shè)一棵進化樹中所有物種的進化速率是相同的的情況下構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)掌裂葉秋海棠和柔毛秋海棠均單獨分為一支，表現(xiàn)出良好的單系性，而秋海棠和中華秋海棠都聚在一支；而NJ樹不用假設(shè)進化樹中所有物種的進化速率相同，其得到的結(jié)果與UPGMA樹的結(jié)果相似，支持了UPGMA樹的結(jié)果。

通過分析序列變異位點、遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果均表明：中華秋海棠與其近緣易混品掌裂葉秋海棠、柔毛秋海棠能很好的區(qū)分；而中華秋海棠和秋海棠不能有效區(qū)分?！度珖胁菟巺R編》將秋海棠和中華秋海棠定為兩種不同的藥材，而《中國植物志》和Flora Of China將秋海棠和中華秋海棠分別處理為原亞種B. grandis subsp. grandis與亞種 B. grandis subsp. sinensis （A. D.C.） Irmsch.[36，37]。根據(jù)《中國植物志》和Flora Of China分類標準，在實踐中即使是對一株具備全部重要性狀的個體開展鑒定，也無法對秋海棠的種下單元進行準確分類。在考察全國各地館藏標本時也發(fā)現(xiàn)該種的鑒定十分混亂，同一地區(qū)、同一地點、甚至同號的標本往往被鑒定為不同亞種[38]。所以本文希望以形態(tài)學為基礎(chǔ)，結(jié)合分子生物學手段提出新的種下分類處理及標準。考慮到ITS2是一種用于區(qū)分物種間的DNA條形碼，針對秋海棠和中華秋海棠的特異性分子標記仍需要開發(fā)。

4 結(jié)論

本實驗對6個不同產(chǎn)地的67份紅白二丸藥材及其近緣易混品進行DNA條形碼研究，基于ITS2序列的變異位點、最近距離法、系統(tǒng)發(fā)育樹（NJ樹和UPGMA樹）分析結(jié)果均能夠很好地將紅白二丸藥材與其近緣易混品掌裂葉秋海棠、柔毛秋海棠有效區(qū)分，中華秋海棠和秋海棠不能有效區(qū)分。因此，ITS2序列在物種水平上可以準確鑒定紅白二丸藥材及其近緣易混品，證明ITS2條形碼技術(shù)在物種水平上對中草藥具有良好的鑒定能力。該研究為紅白二丸藥材的真?zhèn)舞b別和安全有效用藥提供技術(shù)支持。

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Identification of Hongbaierwan (Begonia Sinensis) and Its Relative Adulterants Based on ITS2 Sequence

Zheng Lihui1,2, Xu Jiang3, Li Xiwen3, Ding Xiaoping2, Xiao Ling2, Wang Bo2, Li Danping2
(1.College of Pharmacy, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China; 2. Hubei Institute for Food and Drug Control, Wuhan 430075, China; 3. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)

This study aimed to establish a molecular identification method for Hongbaierwan (B. sinensis) and its relative adulterants based on ITS2 sequence. The genomic DNAs from sixty seven samples were extracted, and the ITS2 sequences were amplified and bi-directionally sequenced. All sequences were assembled and obtained by CodonCode Aligner V4.2.4. The intra-specific and inter-specific genetic distances were computed and the phylogenetic trees (NJ tree and UPGMA tree) were constructed by MEGA 6.0 based on the Kimura 2-Parameter (K-2P) model. It was found that the maximum intra-specific genetic distance within B. sinensis was lower than the minimum inter- specific distances between B. sinensis and its relative adulterants (B. pedatifida and B. henryi), while the distance was higher than the minimum inter-specific distance between B. sinensis and B. evansiana. The NJ tree and UPGMA tree showed that B. sinensis could be distinguished from B. pedatifida and B. henryi，however, B. sinensis and B. evansiana could not be distinguished. It was concluded that ITS2 sequence could discriminate B. sinensis from its relative adulterants at species level effectively as a molecular identification method of Hongbaierwan and its relative adulterants, which provided a support for safety clinical use of Hongbaierwan.

DNA barcoding, ITS2 sequence, Hongbaierwan, relative adulterants

10.11842/wst.2016.02.014

R282.5

A

（責任編輯：馬雅靜 張志華，責任譯審：朱黎婷 王 晶）

2015-11-29

修回日期：2015-12-07

＊ 湖北省自然科學基金委重點項目（2015CFA098）：湖北常用秋海棠科藥用植物DNA條形碼鑒定及親緣關(guān)系分析，負責人：李丹平。

＊＊ 通訊作者：李丹平，主任藥師，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥資源及其品質(zhì)研究。