賀瑩++高曉麗++段利強++喬元彪

摘 要： 從菌中的酶含量和酶活力兩方面對微生物酶催化水解的最佳條件進行了探究。結(jié)果顯示，通過對試驗菌種生長曲線的測定，發(fā)現(xiàn)該菌在22 h之內(nèi)為對數(shù)期，22～36 h為穩(wěn)定期，36 h后進入衰退期。在此基礎(chǔ)上檢測前期誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌種內(nèi)的酶含量為3.6%，然后對該菌破胞后的酶粗提物和不破胞的菌體（全細胞）進行了不同溫度和pH值梯度下的水解情況對比，得到兩者酶活力最高時的最佳溫度和pH值，前者最佳溫度為40 ℃，pH值為8，后者則最佳溫度為40 ℃，pH值為6。最后通過對比得出，酶粗提物的水解效果比全細胞的更佳。

關(guān)鍵詞：D-對羥基苯甘氨酸；D-海因酶；N-氨甲酰水解酶；微生物酶催化法

中圖分類號：O643.32 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.03.021

D-對羥基苯甘氨酸（D-HPG）主要用作合成青霉素和半合成頭孢霉素類藥物的重要中間體。用其生產(chǎn)的主要藥品有羥氨芐青霉素·阿莫西林、羥氨芐青霉素克拉維酸鹽、羥氨芐頭孢、羥氨芐唑頭孢、頭孢哌酮等，這些藥物用途廣泛，對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、弓形菌、螺旋體等均有殺滅作用。此外，還被用于感光領(lǐng)域和用作鐵、磷、硅等的分析試劑，需求量呈逐年遞增趨勢。

我國作為青霉素生產(chǎn)大國，青霉素母核（6-APA）來源十分豐富，但是中國D-對羥基苯甘氨酸生產(chǎn)技術(shù)一直沒有很好解決，主要原料仍然依靠進口，從而嚴重制約了半合成抗生素的發(fā)展，產(chǎn)品供求緊張、生產(chǎn)成本高、沒有競爭力。傳統(tǒng)的D-對羥基苯甘氨酸（D-HPG）的合成主要是化學(xué)合成和生物酶催化法。然而，化學(xué)合成D-HPG的方法污染較大，會產(chǎn)生氰化物，毒性高，污染嚴重，污水處理復(fù)雜，這種方法現(xiàn)在已經(jīng)很少使用。與化學(xué)合成相比，生物酶催化法的污染較小，反應(yīng)條件相對溫和，而且選擇性和轉(zhuǎn)化效率都有一定的優(yōu)勢。所以，人們漸漸重視生物催化法的研究，主要集中在利用D，L-對羥基苯海因（D，L-HPH）為原料的經(jīng)酶催化合成 D-HPG 的方法上[5]。因此，發(fā)展我國自主原料D-p-HPG有極其深遠的現(xiàn)實意義[1-2]。

目前有報道稱土壤桿菌（Agrobacterium sp），梭菌（Clostridium sp），消化球菌P（Petococus sp）、節(jié)桿菌（Arthrobacter sp）、賽氏桿菌（Serratia sp）、棒桿菌（Corynebacterium sp）具有D-p-對羥基苯海因酶活性，假單胞菌（Pseudomonas sp）和芽胞桿菌（Bacillus sp）具有D-p-對羥基苯海因酶和N-氨甲酰對羥基苯甘氨酸水解酶雙酶活性。

酶法合成對羥基苯甘氨酸的反應(yīng)先后經(jīng)過兩個過程，即D-海因酶先催化底物DL-對羥基苯海因生成N-氨甲?；?D-對羥基苯甘氨酸，然后產(chǎn)物再在D-N-氨甲?；被崴饷傅淖饔孟律蒁-對羥基苯甘氨酸[3-4]。

1 材料和方法

1.1 試 劑

酵母浸膏，胰蛋白胨，NaCl，D-對羥基苯海因，標準品D-對羥基苯甘氨酸， DL-對羥基苯海因，氫氧化鈉，鹽酸，水合茚三酮，正丁醇為天津市天力化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

Boxun潔凈工作臺（上海博訊有限公司），HZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司），cence湘儀TDZ4-WS臺式低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），cenceTGL-16臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），WiseMix VM-10漩渦混合器（Daihan scientific），弘祥隆DCTZ/W系列多用途恒溫超聲提取機，UV-2100雙光束紫外可見分光光度計（上海棱光有限公司），1 mL和200 μL移液器，SY-8100高效液相色譜儀（北京北分瑞利分析儀器有限責任公司），LGJ-10冷凍干燥機（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）。

1.3 方 法

1.3.1 生長曲線的制作 根據(jù)所測得的不同培養(yǎng)時間段的OD值，計算出不同培養(yǎng)時間的5號菌的生長狀況的實際值，并制作成該菌的生長曲線[5]。

1.3.2 標準品D-對羥基苯甘氨酸（D-HPG）的標準曲線的制作 參照文獻[6]。

1.3.3 全細胞與酶粗提物的制備 發(fā)酵后離心，然后倒掉上清液，用超濾水重復(fù)上述步驟離心洗滌3次，洗滌完后，用該緩沖液將菌體配制成 1∶3 的菌懸液，置于合適的大塑料試管內(nèi)備用（全細胞）。

將大塑料試管置于冰浴中，采用恒溫超聲提取機超聲波破碎，破碎液于12 000 r·min-1下高速冷凍離心30 min，收集上清夜備用（粗酶液）。

1.3.4 酶活力的測定 酶活力單位：每1 mL發(fā)酵液收集的菌體每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol底物定義為1活力單位，參照文獻[7-8]。

1.3.5 溫度對酶活力的影響 取28個干凈的10 mL試劑瓶按表1分成14組，每組兩個重復(fù)，按表2稱取底物和細胞或酶粗提物，然后向每個試劑瓶中添加10 mL超濾水，pH值=7，封口，用保鮮膜包裹，放入不同溫度的搖床中水解4 h。

4 h后，將試劑瓶從搖床取出，用1 mL移液器按編號從試劑瓶中各取1 mL試劑移入1.5 mL離心管中，10 000 r·min-1，10 min離心。然后用高效液相色譜儀檢測產(chǎn)物的峰電平并記錄。

根據(jù)標準品的標準曲線計算出不同溫度下全細胞和酶粗提物的酶活力，制作曲線，進行對比。

1.3.6 pH值對酶活力的影響 試驗方法與1.3.5相同，將 45 ℃培養(yǎng)并經(jīng)過分步誘導(dǎo)的5號菌液產(chǎn)生的全細胞和酶粗提物在40 ℃和pH值分別為4，5，6，7，8，9，10條件下進行酶活力測定，并制作對比曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 5號菌的生長曲線

通過對37 ℃培養(yǎng)的菌液每2 h測1次OD值，做出5號菌的生長曲線，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，5號菌的基本生長情況，因為接的菌是對數(shù)期的菌，所以從培養(yǎng)開始到22 h這一段是菌的對數(shù)生長期，22～36 h是穩(wěn)定期，36 h后菌開始衰落。

2.2 標準品D-對羥基苯甘氨酸（D-HPG）的標準曲線

標準品D-對羥基苯甘氨酸（D-HPG）的標準曲線如圖2所示。

2.3 溫度對酶活力的影響

將 45 ℃分步誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h的菌液產(chǎn)生的全細胞和酶粗提物在pH值為7.0和溫度分別為30，35，40，45，50，55 ℃條件下水解進行酶活力測定，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，等量的5號菌的全細胞和酶粗提物在水解溫度為40 ℃時酶活力最高，酶粗提物的酶活力為15.23 μmol·g-1·h-1。然而從整個趨勢看來，在pH值=7的條件下，隨著溫度的變化，酶粗提物的水解酶活力要比全細胞水解的酶活力高。由此表明，在pH值=7，溫度為40 ℃的條件下，適合做酶粗提物水解。

2.4 pH值對酶活力的影響

將 45 ℃分步誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h的菌液產(chǎn)生的全細胞和酶粗提物在溫度為40 ℃和pH值分別為4，5，6，7，8，9，10條件下水解進行酶活力測定，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，等量的5號菌的全細胞和酶粗提物在40 ℃水解時，隨著pH值的升高，全細胞和酶粗提物的水解酶活力先升高后降低，在pH值=6時全細胞活力達到最高，酶粗提物酶活力達到最高時的pH值為8。由此表明，在溫度為40 ℃，pH值=8的條件下，適合做酶粗提物水解。

通過以上的試驗數(shù)據(jù)可以得出，5號菌中的蛋白含量占到細胞的3.6%，在此前提下，取等量的細胞一部分破胞，一部分保留全細胞做水解，檢測出兩者酶活力最高的最佳溫度和pH值，前者為40 ℃，pH值=8，后者為40 ℃，pH值=6。然后在兩者各自酶活力最高的最佳條件下做水解，仍然是取等量的細胞一部分破胞，一部分保留全細胞，檢測得出在水解相同時間后，只占細胞3.6%的酶粗提物的水解效果更好，反應(yīng)速度更快。

3 結(jié) 論

筆者通過試驗，利用自選菌種，從菌的酶含量和酶活力兩方面對微生物酶催化水解的最佳條件進行了研究。通過對試驗菌種生長曲線的測定，發(fā)現(xiàn)該菌在22 h之內(nèi)為對數(shù)期，22～36 h為穩(wěn)定期，36 h后進入衰退期。在此基礎(chǔ)上檢測前期誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌種內(nèi)的酶含量為3.6%，然后對該菌破胞后的酶粗提物和不破胞的菌體（全細胞）進行了不同溫度和pH值梯度下的水解情況對比，得到兩者酶活力最高時的最佳溫度和pH值，前者最佳溫度為40 ℃，pH值為8，后者則最佳溫度為40 ℃，pH值為6。研究認為，酶粗提物的水解效果比全細胞的更佳。

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