尤　亮，　丁東棟，　崔志峰

浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院， 浙江杭州 310032

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乙醇耐受性釀酒酵母菌株選育的研究進(jìn)展

尤亮，丁東棟，崔志峰*

浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院， 浙江杭州 310032

摘要：釀酒酵母是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的重要菌種，但是其發(fā)酵產(chǎn)物乙醇對釀酒酵母有明顯的抑制作用。選育乙醇耐受性釀酒酵母是克服高濃度乙醇的抑制作用，提高乙醇產(chǎn)量的一條重要途徑。本文對近年來國內(nèi)外選育乙醇耐受性酵母的研究作一綜述，旨在為乙醇耐受性酵母的選育提供參考。

關(guān)鍵詞：釀酒酵母； 乙醇發(fā)酵； 耐受性； 菌株選育

隨著環(huán)境污染的加劇和全球石油能源的日漸枯竭，開發(fā)新的清潔能源勢不容緩，生物乙醇作為一種新型的可再生能源，日益成為研究熱點(diǎn)。釀酒酵母以其特有的生理特征以及發(fā)酵性能成為人們廣泛選用的乙醇生產(chǎn)菌[1]。目前提高釀酒酵母乙醇產(chǎn)量的方法主要有兩個：一是乙醇發(fā)酵工藝的優(yōu)化，如高密度發(fā)酵(VHG) ；二是選育乙醇高耐受性和發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株。

乙醇發(fā)酵過程中，釀酒酵母往往會受到各種脅迫因素：包括發(fā)酵過程中的溫度、滲透壓、以及終產(chǎn)物乙醇濃度的影響，其中終產(chǎn)物乙醇對菌株毒性作用是制約釀酒酵母生產(chǎn)乙醇的一大瓶頸[2]。迄今為止應(yīng)用自然選育、誘變育種、基因工程和基因組重排等技術(shù)選育乙醇耐受性酵母菌株是克服此瓶頸的重要途徑之一。本文對近年來國內(nèi)外選育乙醇耐受性高產(chǎn)酵母菌株的研究做一綜述。

1自然選育

自然選育是從自然界存在的自發(fā)突變體中篩選具有優(yōu)良特性的菌株。該方法簡單實用，目前仍是篩選高乙醇耐受性酵母菌株的有效方法之一。如賴穎等[3]以宋河酒廠窖泥、酒槽、酒廠廢水為樣品，用含16%和18%乙醇濃度的平板初篩，2,3,5-氯化苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)顯色平板復(fù)篩和酒精發(fā)酵試驗驗證，最終得到1株耐乙醇濃度為18%的酵母菌株A16。在葡萄糖25%，酵母膏2%，蛋白胨1%的培養(yǎng)基，菌株A16 的酒精得率為70 %。吳華昌等[4]從瀘州老窖的白酒窖槽中分離乙醇耐受性高的酵母菌株，經(jīng)8%乙醇濃度平板初篩，TTC顯色平板復(fù)篩，最終用酒精發(fā)酵試驗驗證得到酵母菌株A2。酵母菌株A2可耐18%乙醇濃度，在優(yōu)化的葡萄糖濃度為20%的發(fā)酵培養(yǎng)基，溫度34 ℃、pH為4.5，發(fā)酵72 h后，發(fā)酵液中乙醇濃度達(dá)到9.5%。費(fèi)文斌等[5]以江蘇省灌南縣湯溝釀酒廠的大曲、窖泥及發(fā)酵酒醅為樣品，經(jīng)過TTC固體平板的一級篩選和杜氏小管產(chǎn)氣觀察的二級篩選，最終通過發(fā)酵試驗得到一株乙醇耐受性酵母菌，命名為NR11。NR11在12%乙醇濃度及55%葡萄糖濃度下可正常發(fā)酵，而且致死溫度可達(dá)60 ℃。在30 ℃、38 ℃、40 ℃和42 ℃，初始葡萄糖濃度為260 g/L條件下，乙醇產(chǎn)量分別可以達(dá)到109.0g/L、93.2 g/L、73.8 g/L和44.0 g/L。NR11是一株有潛在的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用價值的酵母菌株，具有廣闊的應(yīng)用前景。

上述自然選育大都選擇了酒廠窖泥、酒槽或酒廠廢水等為樣品，并且都篩選得到了可耐18%乙醇濃度濃度的酵母菌株。這表明長期的較高乙醇濃度的酒廠周邊環(huán)境非常有利于耐乙醇自然突變酵母菌株的積累，從這些環(huán)境樣品出發(fā)自然選育耐乙醇酵母菌株仍是行之有效的好方法。

2誘變育種

誘變育種是利用物理和化學(xué)的方法處理供試菌株，提高其突變頻率，并通過定向篩選獲得具有某種優(yōu)良特性的菌株。易戈等[6]以釀酒酵母JL2008為出發(fā)菌株，在10 W的紫外燈下進(jìn)行紫外照射誘變40 s，經(jīng)酒精濃度為8%的固體培養(yǎng)基上初篩和TTC法復(fù)篩，最終篩選得到突變菌株SC1。在30%葡萄糖濃度下發(fā)酵乙醇，64 h后突變菌株SC1的酒精濃度達(dá)到16.54%，比出發(fā)菌株高11.6%，是一株非常有潛力的應(yīng)用于濃醪發(fā)酵的酵母菌株。Dong等[7]以釀酒酵母ATCC 76740為出發(fā)菌株，經(jīng)過硫酸二乙酯(Diethyl sulfate，DES)處理和耐乙醇、糠醛濃度的篩選，最終得到乙醇耐受性突變菌株4D-6。突變菌株4D-6在37 ℃、29 g/L葡萄糖濃度下發(fā)酵乙醇的產(chǎn)量達(dá)到11.2 g/L，是野生型的3.6倍。

李楊等[8]以耐酸性酵母A3為出發(fā)菌株，對其原生質(zhì)體進(jìn)行紫外線(UV)與亞硝基胍(Nitrosoguanidine，NTG)復(fù)合誘變，篩選出一株乙醇高耐受性、高產(chǎn)的酵母菌株UN1-81。30 ℃，pH 4.0酸性條件下，發(fā)酵72 h后測得UN1-81菌株的殘?zhí)橇亢途凭珴舛确謩e為5.76 mg/mL和11.17%vol(v/v)，比出發(fā)菌株提高了16.47%。Zhang等[9]利用高能電子束(high-energy pulse electron beam，HEPE)和原生質(zhì)體融合誘變釀酒酵母YZ1，篩選出一株乙醇耐受性、耐熱性突變菌株YF31，可于42 ℃高溫條件下生產(chǎn)乙醇。突變菌株YF31在34 ℃、20%葡萄糖條件下發(fā)酵乙醇的產(chǎn)量為139.3 g/L相比出發(fā)菌株YZ1提高了40%；在42 ℃、20%葡萄糖條件下發(fā)酵乙醇的產(chǎn)量為(94.2±4.8) g/L，相比出發(fā)菌株YZ1提高了2.48倍。

誘變育種方法是選育乙醇耐受性酵母菌株的常用技術(shù)，該方法簡單易行可提高突變頻率，而且對儀器設(shè)備要求不高。誘變育種不僅能有效獲得乙醇耐受性菌株，而且還有很大的概率能同時獲得耐高糖、耐酸性或耐高溫等性能。

3基因工程育種

酵母菌的乙醇耐受性是受多基因控制的，Yoshikawa等[10]鑒定了釀酒酵母在乙醇壓力下的基因表型，發(fā)現(xiàn)有359個基因與乙醇耐受性有關(guān)。影響酵母乙醇耐受性的重要因子之一是胞內(nèi)海藻糖濃度，Cao等[11]將扣囊復(fù)膜孢酵母的海藻糖合成基因TPS1與載體pMIRSC11連接后導(dǎo)入釀酒酵母Saccharomycessp.W0中表達(dá)，篩選得到菌株Z8。在18%(v/v)乙醇濃度下，3 h后Z8存活率為25.14%，而出發(fā)菌株W0存活率僅為12.09%。在30 ℃、200 g/L葡萄糖、10 g/L硫酸銨條件下發(fā)酵乙醇，Z8的乙醇產(chǎn)量達(dá)到16.4%(v/v)，相比出發(fā)菌株W0乙醇產(chǎn)量提高了15.5%。張曉陽等[12]以工業(yè)釀酒酵母菌株Zd4的兩株優(yōu)良單倍體Z1和Z2為出發(fā)菌株，分別進(jìn)行3種基因操作：(1) 通過強(qiáng)啟動子PGK1過表達(dá)TPS1 ，(2) 敲除海藻糖水解酶基因ATH1 ，(3)同時過表達(dá)TPS1和敲除ATH1。經(jīng)此三種基因工程操作后再將每組的工程菌雜交獲得了三株代謝工程菌株Z12ptps1、Z12Δath1、Z12pTΔA，在270 g/L葡萄糖濃度下乙醇產(chǎn)量分別為122.37 g/L、121.24 g/L、124.82 g/L，與原始出發(fā)菌株Zd4的116.71 g/L分別提高4.9%、3.9%、7.0%。Yang等[13]研究在釀酒酵母中過表達(dá)ATP結(jié)合外排蛋白提高乙醇耐受性，他們將編碼假定的多耐藥性外排蛋白基因ADP1擴(kuò)增后與pYES2載體連接，然后轉(zhuǎn)入釀酒酵母BY4741中獲得工程菌iETS3，可在半乳糖誘導(dǎo)下過表達(dá)ADP1。在添加5%乙醇濃度壓力下，20 g/L半乳糖發(fā)酵28 h后乙醇產(chǎn)量增加了5 g，比對照菌株提高了20%。

上述基因工程育種通常是通過敲除或過表達(dá)與乙醇耐受性有關(guān)的基因，如過表達(dá)TPS1基因提高酵母的乙醇耐受性。與誘變育種相比，基因工程具有很明確的靶標(biāo)位點(diǎn)。但是，釀酒酵母的乙醇耐受性是受多基因控制的，僅改變單個基因的效果有一定的局限性。通過全局轉(zhuǎn)錄方法提高釀酒酵母乙醇耐受性成為一種頗有前景的策略。

4全局轉(zhuǎn)錄工程

Alper等[14]發(fā)現(xiàn)釀酒酵母RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄復(fù)合體TFⅡD成分SPT15基因中3個氨基酸的突變可以大幅提高釀酒酵母對乙醇的耐受性，并首次提出了全局轉(zhuǎn)錄工程(Global transcriptional machinery engineering，gTME)，為提高釀酒酵母對乙醇的耐受性提供了新的思路。Liu等[15]采用全局轉(zhuǎn)錄工程的方法，先用易錯PCR獲得SPT15基因突變體，與pYX212載體連接后，再轉(zhuǎn)化釀酒酵母YPH499，選出乙醇耐受性高并能利用木糖的酵母菌株spt15-29。在含68.41 g/L木糖和7.67 g/L葡萄糖培養(yǎng)基中發(fā)酵，71 h后突變菌株spt15-29對木糖和葡萄糖的利用率分別為65.7%和87.0%，乙醇的濃度為11.9 g/L，相比出發(fā)菌株提高了4倍。Yang等[16]以pT-spt15作為模板使用PCR隨機(jī)突變試劑盒使spt15基因發(fā)生突變，與pRS316- GCYH2gR載體連接，再轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌株L3262。用YSCD-Ura固體缺陷平板初篩，乙醇濃度為12.5%(v/v)和15%(v/v)的固體平板復(fù)篩，最終得到表型最好的兩株突變株iETS2和iETS3。在30 ℃、500 mL YPD培養(yǎng)基發(fā)酵乙醇，24 h后葡萄糖幾乎被消耗完，突變酵母菌株iETS2、iETS3發(fā)酵乙醇的最終濃度都達(dá)到了77 g/L，比原始菌株提高了25.2%。趙清心等[17]研究了另一個轉(zhuǎn)錄因子SPT3的突變對釀酒酵母乙醇耐受性的影響，他們將易錯PCR獲得的SPT3基因突變體與載體pYES2.0連接，轉(zhuǎn)入釀酒酵母S.cerevisiae4126中，成功篩選出一株在10%(v/v)乙醇中生長較好的突變菌株M25。在125 g/L葡萄糖濃度下，突變株M25的乙醇產(chǎn)量為53.6 g/L，比對照株提高了11.7%。

Yu等[18]將SPT3和SPT15與載體pGupCas連接，用GAL10啟動子過表達(dá)SPT3和SPT15，并轉(zhuǎn)化釀酒酵母YPH499，得到重組菌株YPH499(pGupSpt3.15Cas)，用含0.02%半乳糖和2%甘油的SG-甘油培養(yǎng)基發(fā)酵，96 h乙醇的濃度為8.1 g/L，相比對照菌株提高了1.8倍。

全局轉(zhuǎn)錄工程是通過改造全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子來獲得具有某種優(yōu)良性狀的菌株，對于選育乙醇耐受性菌株這種受多基因控制的突變體，全局轉(zhuǎn)錄工程是一種有效的方法。

5基因組重排育種

基因組重排是通過多親本之間的DNA重組和全基因組片段交換，將各親本優(yōu)良性狀重組在一起。Wang等[19]以釀酒酵母Y12出發(fā)得到Y(jié)1和Y2單倍體菌株，先分別進(jìn)行紫外照射和甲基磺酸乙酯突變操作，用含乙醇濃度為10%的YNB平板初篩并收集耐乙醇突變株。突變株交配進(jìn)行融合重組后再通過兩次融合重組并分別經(jīng)12%和14%乙醇濃度的YNB平板復(fù)篩，最終得到表型最好的融合子TS5。在葡萄糖濃度為285 g/L下發(fā)酵，乙醇濃度達(dá)到127.54 g/L，相比釀酒酵母Y12提高了約7.6%。Zheng等[20]以釀酒酵母ZTW1為出發(fā)菌株，先用50 μg/L的甲基苯并咪唑-2-基-氨基甲酸叔丁酯(benzimidazole-2-yl-carbamate，MBC)處理，然后在孢子形成培養(yǎng)基上(1%NaAc,0.2%酵母提取物,0.1%葡萄糖,0.2%KCl,pH 6.0)收集孢子并隨機(jī)雜交，用50 g/L乙醇濃度的起始篩選培養(yǎng)基初篩，收集其中乙醇產(chǎn)量最高的三株菌的孢子后再進(jìn)行兩次孢子交配，最后篩選出了9株乙醇耐受性和產(chǎn)量都很高的釀酒酵母菌株，其中S3-110菌株的乙醇產(chǎn)量最高。在285 g/L葡萄濃度下發(fā)酵75 h后的乙醇濃度為130 g/L，相比出發(fā)酵母ZTW1提高了11%。另外，Snoek等[21]從318株不同的釀酒酵母中選育出8株異源的釀酒酵母菌株作為親本菌株，以孢子交配的方式經(jīng)行了三循環(huán)基因組重組，經(jīng)5%和12%乙醇濃度的篩選平板進(jìn)行初篩，18%和22%乙醇濃度的篩選平板復(fù)篩，最后得到釀酒酵母菌株融合子H1，在32%(w/v)葡萄糖濃度下發(fā)酵乙醇濃度為18.7%(v/v)，乙醇產(chǎn)率為0.45 g/g。

基因組重排技術(shù)是對整個微生物全基因組進(jìn)行重排的定向育種技術(shù)，它將通過誘變改良的突變菌株進(jìn)行雜交育種，經(jīng)過遞推式的多次融合使不同的正向突變整合到一個重組子中[22]。因此，利用基因組重排技術(shù)更容易獲得高乙醇耐受性，而且更適用于實際的高密度發(fā)酵工藝生產(chǎn)乙醇的酵母菌株。

6小結(jié)與展望

釀酒酵母產(chǎn)乙醇的研究經(jīng)久不衰，自上世紀(jì)爆發(fā)石油危機(jī)以來，燃料短缺及環(huán)境惡化問題日趨嚴(yán)重，使得作為清潔能源的生物乙醇受到密切關(guān)注。釀酒酵母目前依然是生產(chǎn)乙醇的主要菌株，經(jīng)過長達(dá)40多年的育種研究，不同的育種技術(shù)在其發(fā)展的各個時期都發(fā)揮了非常重要的作用。自然選育和誘變育種簡單易行，對儀器設(shè)備的要求不高，是選育乙醇耐受性酵母不可或缺的手段?；蚬こ逃N具有靶標(biāo)明確的優(yōu)點(diǎn)，克服了傳統(tǒng)育種中存在的盲目性，但是由于乙醇的耐受性機(jī)制很復(fù)雜，幾百種基因參與其中，使其存在自身的局限性。全局轉(zhuǎn)錄工程通過改造全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子達(dá)到對多基因控制的性狀進(jìn)行有效的改造，改變了單個基因操作的局限性，使其成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一?；蚪M重排育種使酵母基因組在較大范圍內(nèi)發(fā)生交換和重排，與傳統(tǒng)誘變育種結(jié)合能明顯提高獲得乙醇高產(chǎn)酵母的機(jī)會，極大的提高了酵母育種的效率。

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doi:10.3969 /j.issn.1001-6678.2016.03.010

作者簡介：尤亮(1991～)，男，碩士研究生。E-mail:youliang_0501@163.com。 *通訊作者: 崔志峰，Tel:86-571-88320741，E-mail:zfcui@zjut.edu.cn。

Research progress in breeding of ethanol tolerance strain fromSaccharomycescerevisiae

YOU liang, DING Dong-dong, CUI Zhi-feng

College of Biological Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310032, China

AbstractSaccharomyces cerevisiae is one of the important strains for ethanol production by industrial fermentation, but its product ethanol has obvious inhibitory effect on producer. Breeding of the ethanol tolerance strain from S. cerevisiae is an important way to overcome the inhibition and increase the ethanol production. In this paper, researches on breeding of ethanol tolerance strains from S. cerevisiae in recent years were outlined. It would provide reference for the breeding of ethanol tolerance strains from S. cerevisiae.

Key wordsSaccharomyces cerevisiae; ethanol fermentation; tolerance; breeding