張根生++張毅超++程健博++李婷婷++姜艷++姚燁
摘 要:以生鮮豬肉為主要原料,經(jīng)過谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(transglutaminase,TG)反應(yīng)后加熱形成凝膠,通過單因素和正交試驗,并以質(zhì)構(gòu)特性和感官評價為指標(biāo),利用低頻核磁共振技術(shù)對最優(yōu)方案進(jìn)行比較驗證,從而確定肉蛋白凝膠最優(yōu)制備工藝。結(jié)果表明:肉蛋白凝膠最佳配方為:TG添加量1.2 U/g、食鹽添加量2.5%、大豆蛋白添加量1.0%、酪蛋白添加量0.6%、水添加量25%,在此條件下制成的蛋白凝膠硬度達(dá)到3 986.156 g、彈性達(dá)到0.989、凝聚性達(dá)到0.873、回復(fù)性達(dá)到0.579、感官評分達(dá)到89.03 分,形成的肉蛋白凝膠體切面整齊,且富有彈性。
關(guān)鍵詞:肉蛋白凝膠;谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶;低頻核磁共振
Optimization of Meat Protein Gelation and Validation by Low-Frequency Nuclear Magnetic Resonance
ZHANG Gensheng, ZHANG Yichao, CHENG Jianbo, Li Tingting, JIANG Yan, YAO Ye
(Key Laboratory for Food Science and Engineering of Heilongjiang Province, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)
Abstract: The optimization of heat-induced gel formulations prepared from transglutaminse (TG)-treated porcine muscle proteins based on texture properties and sensory evaluation was carried out using single factor and orthogonal array experiments and validated by low-frequency nuclear magnetic resonance (L-NMR). The results showed the optimal formulation was determined as follows: TG 1.2 U/g, salt 2.5%, soy protein 1.0%, casein 0.6%, and water 25%. The formed gel had a hardness of 3 986.156 g, elasticity of 0.989, cohesiveness of 0.873, resilience of 0.579, and sensory score of 89.03. It could be cut into regular sections, having excellent elasticity.
Key words: meat protein gel; transglutaminse (TG); low-frequency nuclear magnetic resonance (L-NMR)
DOI:10.15922/j.cnki.rlyj.2016.02.004
中圖分類號:TS251.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號:1001-8123(2016)02-0015-06
引文格式:
張根生, 張毅超, 程建博, 等. 肉蛋白凝膠工藝優(yōu)化及其低頻核磁共振法的驗證[J]. 肉類研究, 2016, 30(2): 15-20. DOI:10.15922/j.cnki.rlyj.2016.02.004. http://rlyj.cbpt.cnki.net
ZHANG Gensheng, ZHANG Yichao, CHENG Jianbo, et al. Optimization of meat protein gelation and validation by low-frequency nuclear magnetic resonance[J]. Meat Research, 2016, 30(2): 15-20. (in Chinese with English abstract) DOI:10.15922/j.cnki.rlyj.2016.02.004. http://rlyj.cbpt.cnki.net
蛋白凝膠是指蛋白質(zhì)分子的聚集現(xiàn)象,在這種聚集過程中,吸引力和排斥力處于平衡,以至于形成能保持大量水分子的高度有序穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)或者基體[1]。近年來發(fā)現(xiàn)利用谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(transglutaminase,TG)可以很好地處理肉蛋白凝膠,王順風(fēng)[2]、孫高軍[3]、翁航萍[4]、胡斌[5]等對此都有過很好的研究,國外如Schaake[6]、Berry[7]等對凝膠的研究大都集中在改善產(chǎn)品的組織結(jié)構(gòu)和外觀。過去一些學(xué)者對凝膠保水性的測定停留在基本的方法,如Grau等[8]用濾紙吸水法,Honikel[9]用離心法。而低頻核磁共振(low-frequency nuclear magnetic resonance,L-NMR)技術(shù)作為一種新型快速無損檢測得到了人們的認(rèn)可[10-11],通過測定弛豫時間T2,利用弛豫時間的不同進(jìn)行分析區(qū)別物理化學(xué)作用下結(jié)合的水[12],間接反應(yīng)水分自由度[13]。
本研究利用TG在較低溫下的反應(yīng),將肉糜中的肉蛋白與非肉蛋白重新組合加熱后形成凝膠,通過單因素及正交試驗確定最優(yōu)工藝,再利用L-NMR技術(shù)對最優(yōu)工藝進(jìn)行比較驗證,為實驗結(jié)果提供可靠的依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
一級豬肉 市售;TG(500 U/g) 日本味之素株式會社;大豆蛋白 吉林不二蛋白有限公司;酪蛋白 蘭州同健生物科技有限公司;食用鹽(食品級) 市售。
1.2 儀器與設(shè)備
GB204電子天平 上海天普分析儀器有限公司;HHS-12型電熱恒溫水浴鍋 上海東星建材試驗設(shè)備有限公司;TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀 英國SMS公司;NM 120型核磁共振分析儀 上海紐邁電子科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 熱凝膠混合體系的工藝流程
原料肉→預(yù)處理→絞碎→混拌→成型→反應(yīng)→熟制→冷卻→測定
1.3.2 蛋白質(zhì)熱凝膠混合體系的操作要點
1)預(yù)處理:去除生鮮豬肉中的脂肪、筋腱等組織;2)絞碎:將預(yù)處理好的豬肉通過絞肉機(jī)攪碎,制成肉糜;3)混拌:稱取肉糜,50 g為一組,放入燒杯中,然后將事先稱量好的TG、食鹽、大豆蛋白、酪蛋白加入,攪拌均勻;4)成型:將攪拌均勻的材料放入模具中成型;5)反應(yīng):將成型后的產(chǎn)品放入溫度為25 ℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)4 h;6)煮制:將反應(yīng)完成的肉糜從恒溫水浴鍋中取出,放入80~90 ℃水浴中煮制20~30 min,直至中心溫度達(dá)到85 ℃;7)冷卻:然后將熟制好的樣品取出,冷卻至室溫。
1.3.3 質(zhì)構(gòu)特性(texture profile analysis,TPA)的測定[14]
制成的熱凝膠冷卻后切成1 cm×1 cm×1 cm方塊,用質(zhì)構(gòu)儀測定其硬度、彈性、凝聚性和回復(fù)性。TPA測定前探頭速率:2.0 mm/s,測試探頭速率:1.0 mm/s,測定后探頭速率:1.0 mm/s,測定距離:10.00 mm,壓縮比:30%,探頭兩次測定時間間隔:5.00 s,每個樣品重復(fù)3 次取平均值。
1.3.4 感官評價
結(jié)合本產(chǎn)品特點,評分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。由12 名經(jīng)培訓(xùn)的人員對樣品進(jìn)行感官評定并評分滿分為100 分。
表 1 肉蛋白凝膠感官評價標(biāo)準(zhǔn)
Table 1 Criteria for sensory evaluation of meat protein gel
項目 偏好 得分 評分標(biāo)準(zhǔn)
口感
(20 分) 好 14~20 汁多鮮嫩,入口有嚼勁
一般 7~13 汁略少,略有嚼勁
差 0~6 汁少僵硬,毫無嚼勁
組織狀態(tài)
(70 分) 好 47~70 肉質(zhì)切面整齊,結(jié)構(gòu)整密結(jié)實,
有彈性
一般 24~46 肉質(zhì)切面略有空隙,結(jié)構(gòu)整密
結(jié)實度不高,較有彈性
差 0~23 肉質(zhì)切面有較大空隙,
結(jié)構(gòu)不整密,無彈性
色澤
(10 分) 好 8~10 色澤鮮亮
一般 4~7 有光澤、顏色較暗
差 0~3 無光澤、顏色灰暗
1.3.5 LF-NMR的測定[15-16]
硬脈沖FID參數(shù)為P1=14,TW=4 000,TD=8 000 032,SW=200,DRG=3,SF=18,O1=430 811.1,RG=20,NS=4。SF(MHz)和O1(KHz)共同表示中心頻率,其中O1(KHz)每次檢測均需重新調(diào)節(jié)。P1(μs)90度脈沖寬度對于同一類樣品基本不變,然后進(jìn)入硬脈沖CPMG序列測定。硬脈沖CPMG序列各項參數(shù)為:P1=14,P2=28,TW=4 000,DRG=3,SW=200,DFW=30.0,SF1=18,O1=430 811.1,RG1=20,NS=4。SF(MHz)和O1(KHz)即為硬脈沖FID序列中所調(diào)的中心頻率,將準(zhǔn)備好的樣品放入磁場開始采樣,采樣結(jié)束后進(jìn)行T2擬合,保存實驗結(jié)果,然后進(jìn)入T2反演,經(jīng)核磁分析軟件反演出實驗結(jié)果。每個樣品重復(fù)3 次取平均值。
1.3.6 肉蛋白凝膠單因素試驗
取絞碎后的肉糜放入燒杯,基礎(chǔ)參考配方為TG添加量1.0 U/g、鹽添加量2.5%、大豆蛋白添加量1.0%、酪蛋白添加量0.5%、水添加量25%,在25 ℃條件下反應(yīng)4 h,將熟制好的凝膠取出冷卻,以硬度、彈性、凝聚性、回復(fù)性和感官評價為評價指標(biāo)[17],分別探討TG、鹽、大豆蛋白、酪蛋白和水的添加量對蛋白熱凝膠的硬度、彈性、凝聚性、回復(fù)性和感官評價的影響。各因素水平取值見表2。
1.3.7 肉蛋白凝膠正交試驗
在單因素試驗的基礎(chǔ)上,選取TG、大豆蛋白、酪蛋白、水添加量這4 個影響較大的因素,以硬度、彈性、凝聚性、回復(fù)性和感官評價為指標(biāo),對其進(jìn)行L9(34)正交試驗,并用低頻核磁共振技術(shù)對最佳方案進(jìn)行驗證,確定最佳工藝配方。因素表取值見表2。
2 結(jié)果與分析
2.1 肉蛋白凝膠單因素試驗
2.1.1 TG添加量對肉蛋白凝膠TPA和感官評價的影響
由表3可知,隨著TG添加量的增加,在0.6~1.4 U/g
的范圍內(nèi),肉蛋白凝膠硬度、彈性、凝聚性、回復(fù)性和感官評分都出現(xiàn)了先上升后下降的趨勢,除了回復(fù)性在1.0 U/g取得最大值,其他皆在1.2 U/g時取得最大值。TG能催化蛋白分子之內(nèi)和分子之間形成穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu),使產(chǎn)品的交聯(lián)度增大,致密性提高,凝膠孔徑變小。因此選擇TG的最適添加量為1.2 U/g。
2.1.2 食鹽添加量對肉蛋白凝膠TPA和感官評價的影響
表 4 食鹽添加量對肉蛋白凝膠TPA和感官評價的影響
Table 4 Effect of salt concentration on TPA and sensory evaluation of porcine protein gels
食鹽添加量/% 硬度/g 彈性 凝聚性 回復(fù)性 感官評分
1.5 950.359±68.207a 0.836±0.004a 0.751±0.005a 0.406±0.006a 56.8±2.10a
2.0 1 737.748±71.765b 0.889±0.007b 0.768±0.003b 0.413±0.004a 65.0±1.68b
2.5 2 234.968±198.678c 0.942±0.010c 0.814±0.006d 0.468±0.004c 82.9±2.63e
3.0 1 911.165±98.303b 0.932±0.004c 0.795±0.004c 0.437±0.003b 76.6±3.06d
3.5 1 741.188±82.831b 0.907±0.024b 0.785±0.016c 0.430±0.002b 70.6±1.27c
由表4可知,剛開始隨著食鹽的添加量增加,肉蛋白凝膠硬度、彈性和感官評分迅速增加,凝聚性和回復(fù)性也隨之逐漸增加,當(dāng)食鹽的添加量超過2.5%時繼續(xù)添加,硬度、彈性等和感官評分都逐漸降低。食鹽的添加使得蛋白質(zhì)的狀態(tài)從非溶解態(tài)變成溶解態(tài),提高了肉蛋白的含量,但溶解達(dá)到飽和后繼續(xù)加食鹽會反過來影響酶反應(yīng)。因此選擇食鹽的最適添加量為2.5%。
2.1.3 大豆蛋白添加量對肉蛋白凝膠TPA和感官評價的影響
由表5可知,在0.5%~2.5%的范圍內(nèi),肉蛋白凝膠硬度、彈性、回復(fù)性和凝聚性都出現(xiàn)了先上升后下降的趨勢,硬度、回復(fù)性在1.5%取得最大值,彈性、凝聚性在2.0%取得最大值,感官評分開始略微下降后迅速上升,并在1.5%取得最大值,而后逐漸下降。大豆蛋白分子遇水后能令其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)松弛下來,使更多的水分子被包圍在這個網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)里,改善表面形態(tài)和組織特性,提高產(chǎn)品的質(zhì)地。因此大豆蛋白的最適添加量為1.5%。
2.1.4 酪蛋白添加量對肉蛋白凝膠TPA和感官評價的影響
由表6可知,在0.2%~1.0%的范圍內(nèi),肉蛋白凝膠硬度、彈性、回復(fù)性、凝聚性和感官評分都出現(xiàn)了先上升后下降的趨勢,并在0.6%取得最大值。酪蛋白對水分的截留作用,它通過TG與肉蛋白發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),能達(dá)到很大的黏合度,增強(qiáng)穩(wěn)定性。因此酪蛋白的最適添加量為0.6%。
2.1.5 水添加量對肉蛋白凝膠TPA和感官評價的影響
由表7可知,在5%~45%的范圍內(nèi),肉蛋白凝膠硬度、回復(fù)性和感官評分都出現(xiàn)了先上升后下降的趨勢,并在25%取得最大值,彈性隨著添加量的增加也一直增加,而凝聚性剛開始增加后就基本保持不變。添加水能有效改變蛋白凝膠含水量,但若加水量超過它的持水能力,被鹽溶解出的肉蛋白會被稀釋沖淡,黏合強(qiáng)度會大幅下降,因此水的最適添加量為25%。
2.2 肉蛋白凝膠正交試驗結(jié)果
由表8可知,各因素對肉蛋白凝膠的硬度影響大小次序為:A>B>C>D,最優(yōu)方案為A1B2C3D2,這個組合并不在9 次試驗中,所以對其進(jìn)行驗證,結(jié)果顯示,此方案下感官評分為86.8 分;各因素對肉蛋白凝膠的彈性影響大小次序為:D>B>C=A,最優(yōu)方案為A1B1C3D1,這個組合并不在9次試驗中,所以對其進(jìn)行驗證,結(jié)果顯示,此方案下感官評分為85.9 分;各因素對肉蛋白凝膠的凝聚性影響大小次序為:B>A>D>C,最優(yōu)方案為A2B1C2D1,這個組合并不在9次試驗中,所以對其進(jìn)行驗證,結(jié)果顯示,此方案下感官評分為83.4 分;各因素對肉蛋白凝膠的回復(fù)性影響大小次序為:A>B=C>D,最優(yōu)方案為A1B1C1D1 ,此方案下感官評分為84.2 分;各因素對肉蛋白凝膠的感官評價影響大小次序為:A>D>B>C,最優(yōu)方案為A2B1C2D2 ,這個組合并不在9 次試驗中,所以對其進(jìn)行驗證,結(jié)果顯示,此方案下感官評分為89.0 分。綜合考慮極差分析結(jié)果,以感官評價為主導(dǎo),即TG添加量>水添加量>大豆蛋白添加量>酪蛋白添加量,選擇最優(yōu)方案為A2B1C2D2,即TG添加量
1.2U/g、大豆蛋白添加量1.0%、酪蛋白添加量0.6%、水添加量25%,此方案下硬度為3 986.156 g、彈性為0.989、凝聚性為0.873、回復(fù)性為0.579、感官評分為89.0 分。
2.3 L-NMR法比較驗證
用低頻核磁共振技術(shù)對這5 個方案進(jìn)行檢測,橫向馳豫時間(T2)分別對應(yīng)有結(jié)合水、不易流動水和自由水3 種形態(tài)水。其中T21(0~10 ms)表示蛋白質(zhì)分子表面的極性基團(tuán)與水分子緊密結(jié)合的水分子層,也稱為結(jié)合水。T22(10~100 ms)表示存在于肌纖絲、肌原纖維及膜之間的不易流動水,占總水分的80%左右,T23(100~1 000 ms)表示存在于細(xì)胞外的間隙中能自由流動的水[18],橫向弛豫時間可以表明水分的自由度[19]。弛豫時間越小水分越不易流動,弛豫時間越大流動性越高,峰面積越小水分含量越少,峰面積越大水分含量越大。
圖 1 各方案組對弛豫時間T2的影響
Fig.1 Relaxation time T2 of selected meat protein gel formulations
由圖1可知,弛豫時間T21由高到低的順序為A1B1C1D1>
A1B2C3D2>A1B1C3D1>A2B1C2D1>A2B1C2D2,結(jié)合水的流動性依次逐漸降低,說明方案A2B1C2D2的結(jié)合水最為穩(wěn)定,這是由于TG能使谷氨酰胺殘基與水分子結(jié)合發(fā)生脫氨基反應(yīng),增加TG的量可以使得更多的水分子與蛋白分子結(jié)合,提高結(jié)合水的穩(wěn)定性。弛豫時間T22由高到低的順序為A1B1C1D1>A2B1C2D1>A1B1C3D1>A1B2C3D2>A2B1C2D2,不易流動水的流動性依次逐漸降低,說明方案A2B1C2D2的不易流動水最偏向于結(jié)合水,這是由于充足的酶反應(yīng)形成高度有序的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)鎖住了大量的水分子,同時較密的凝膠結(jié)構(gòu)增大了蛋白與孔徑的水的接觸面積,它們之間的相互作用降低了流動性[20],弛豫時間T23由高到低的順序為A1B1C1D1>A2B1C2D1>A1B2C3D2>A1B1C3D1>A2B1C2D2,自由水的流動性依次逐漸降低,說明方案A2B1C2D2的自由水流動性最低,這是因為交聯(lián)反應(yīng)形成的凝膠孔徑較小,水分在凝膠網(wǎng)絡(luò)中沒有足夠自由移動的空間[21]。
圖 2 各方案組對T2峰面積的影響
Fig.2 T2 peak areas of selected meat protein gel formulations
由圖2可知,T21的峰面積由高到低的順序為
A2B1C2D2>A2B1C2D1>A1B2C3D2>A1B1C3D1>A1B1C1D1,其中方案A2B1C2D2的峰面積最大,其結(jié)合水的含量最高,這是由于TG能使谷氨酰胺殘基與水分子結(jié)合發(fā)生脫氨基反應(yīng),增加TG的量可以使得更多的水分子與蛋白分子結(jié)合,有效地增加了結(jié)合水的量。T22的峰面積由高到低的順序為A2B1C2D2>A1B2C3D2>A1B1C1D1>
A1B1C3D1>A2B1C2D1,其中方案A2B1C2D2的峰面積最大,其不易流動水的含量最高,這是因為增加水的添加量能有效地提高水分含量,且交聯(lián)形成的凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使得大量的水分子充斥其中,另一方面大豆蛋白分子遇水后能令其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)松弛下來,使更多的水分子被包圍在這個網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)里,但這也會導(dǎo)致它搶奪一定量的水分子,酪蛋白在一定程度上對水分子具有截留作用[22]。T23的峰面積由高到低的順序為A1B1C3D1>A2B1C2D1>A1B1C1D1>A1B2C3D2>A2B1C2D2,其中方案A2B1C2D2的峰面積最小,其自由水的含量最低,這是由于交聯(lián)反應(yīng)形成的凝膠致密性好,孔徑較小,水分在凝膠網(wǎng)絡(luò)中沒有足夠多余的空間[23]。
a~e.依次為A1B2C3D2、A1B1C3D1、A2B1C2D1、A1B1C1D1、A2B1C2D2方案。
圖 3 各方案組的低頻核磁成像
Fig.3 L-NMR images of selected meat protein gel formulations
由圖3可知,方案A2B1C2D2的成像最清楚,完整性也最好,結(jié)合以上弛豫時間和峰面積的分析可以判斷出方案A2B1C2D2的保水性和持水能力是這5 個方案里最優(yōu)秀的,因此選擇最佳方案為A2B1C2D2,即TG添加量1.2 U/g、大豆蛋白添加量1.0%、酪蛋白添加量0.6%、水添加量25%。
3 結(jié) 論
通過單因素及正交試驗得出肉蛋白熱凝膠最佳配方為TG添加量1.2 U/g、食鹽添加量2.5%、大豆蛋白添加量1.0%、酪蛋白添加量0.6%、水添加量25%,并通過L-NMR技術(shù)驗證了該配方為最佳配方。在此條件下制成的蛋白凝膠硬度達(dá)到3 986.156 g、彈性達(dá)到0.989、凝聚性達(dá)到0.873、回復(fù)性達(dá)到0.579、感官評分達(dá)到89.03 分,形成的凝膠凝固有形,且富有彈性。
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