趙蓓，官功昌，劉紅梅

(陜西省人民醫(yī)院醫(yī)保辦1、心臟內(nèi)科2、護(hù)理部3，陜西 西安 710068)

VitaePro抑制線粒體通路對心肌細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用

趙蓓1，官功昌2，劉紅梅3

(陜西省人民醫(yī)院醫(yī)保辦1、心臟內(nèi)科2、護(hù)理部3，陜西 西安 710068)

目的 探討VitaePro對心肌細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法將大鼠心肌細(xì)胞H9c2分為四組：正常對照組(H9c2)、缺氧損傷模型組(Hypoxia+H9c2)、紅花油組(Safflower oil+hypoxia+H9c2)和VitaePro組(VitaePro+hypoxia+H9c2)。MTT和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測心肌細(xì)胞增殖和凋亡情況；Western blot檢測線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，包括B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)蛋白X(BAX)、凋亡蛋白-3(Caspase-3)和裂解后的Caspase-3(Cleaved caspase-3)；試劑盒檢測各組心肌細(xì)胞硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBARS)水平、丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。最后，Western blot檢測心血管損傷標(biāo)志蛋白的表達(dá)，包括心肌肌鈣蛋白T(cTnT)、肌紅蛋白(Mb)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)和乳酸脫氫酶(LDH)。結(jié)果缺氧損傷模型組與對照組比較，細(xì)胞增殖顯著下降，凋亡率顯著增高(4.2%～14.6%，P＜0.05)，Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯降低，Bax和Cleaved caspase-3的表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，TBARS水平和MDA含量升高(P＜0.05)，SOD活性從44.9 U/mg降低到13.2 U/mg，心血管損傷標(biāo)志蛋白cTnT、Mb、CK-MB和LDH的表達(dá)顯著升高(P＜0.05)。VitaePro組與缺氧組相比，細(xì)胞的增殖升高(P＜0.05)，凋亡率降低到6.4%，Bcl-2的表達(dá)升高，Bax和Cleaved caspase-3的表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，TBARS水平和MDA含量明顯降低(P＜0.05)，SOD活性增大到41.0 U/mg，cTnT、Mb、CK-MB和LDH的表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。結(jié)論VitaePro可以通過抑制線粒體凋亡通路和通過抗氧化作用減輕缺氧誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞損傷。

大鼠心肌細(xì)胞H9c2；VitaePro；缺氧；線粒體通路；機(jī)制

心肌組織對缺氧具有高度敏感性，與缺氧有關(guān)的心血管疾病包括心肌缺血、腦卒中和心肌梗塞等[1]。缺氧引發(fā)心肌組織大量的氧化自由基堆積，造成心肌細(xì)胞的損傷和凋亡[2-3]。目前已有一些抗氧化自由基的藥物被用于心血管疾病治療的研究中，如銀丹心腦通可通過增強(qiáng)抗氧化酶活性和降低丙二醛水平增加抗氧化能力，從而保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺血再灌注損傷[4]；紅景天甙也能激活Bcl-2有關(guān)的生存信號通路，抑制心肌細(xì)胞中過度的氧化壓力[5]。VitaePro是蝦青素、葉黃素和玉米黃素三種類胡蘿卜素溶解在紅花油(Safflower oil)中形成的新型抗氧化劑[6]。已有研究證實(shí)葉黃素和玉米黃素能抵抗活性氧和自由基的形成，具有強(qiáng)抗氧化作用[7]。蝦青素比斑蝥黃質(zhì)、葉黃素、玉米黃素和β-胡蘿卜素的抗氧化力強(qiáng)[8]，能保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[9]。已報道蝦青素的抗氧化作用能通過抑制線粒體信號通路阻止細(xì)胞凋亡[10]。本實(shí)驗(yàn)通過建立心肌細(xì)胞缺氧模型，探究VitaePro對缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，從而為心血管梗塞的防治提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 大鼠心肌細(xì)胞H9c2(2-1)購于美國模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC)；DMEM-F12培養(yǎng)基、D-Hanks培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；胎牛血清購自HyClone公司；山羊抗鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cleaved caspase-3、cTnT、MB、CK-MB、LDH和β-actin一抗以及HRP標(biāo)記的兔抗山羊二抗購自Pierce公司；硫代巴比妥酸反應(yīng)物(Thiobarbituric reactive substances，TBARS)檢測試劑盒購自Abnova公司；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(Maleic dialdehyde，MDA)檢測試劑盒購自德國Sigma-Aldrich公司；VitaePro購自美國NIMIX公司。

1.2 心肌細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 大鼠心肌細(xì)胞H9c2(2-1)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中，置于37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取生長密度相似，生長狀況良好的對數(shù)期心肌細(xì)胞進(jìn)行隨機(jī)分組：(1)正常細(xì)胞對照組(H9c2)：未經(jīng)缺氧處理，在含5%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；（2)缺氧損傷模型組(Hypoxia+H9c2)：心肌細(xì)胞在不含血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)12 h后，用預(yù)先充入95%N2+5%CO2混合氣體30 min的無糖D-Hanks培養(yǎng)液替代正常培養(yǎng)基，在經(jīng)過95%N2+5%CO2混合氣平衡的單向氣流缺氧裝置中，于37℃培養(yǎng)6 h；(3)紅花油組(Safflower oil+ hypoxia+H9c2)：預(yù)處理的D-Hanks培養(yǎng)液中添加入終濃度為0.25 mg/mL紅花油后缺氧處理6 h，作為加藥組的溶劑對照；(4)VitaePro處理組(VitaePro+hypoxia+ H9c2)：預(yù)處理的D-Hanks培養(yǎng)液中加入終濃度為0.25 mg/mL的VitaePro抗氧化劑混合物(蝦青素2%、葉黃素8.1%、玉米黃素1.23%溶解于紅花油中)做同樣的缺氧處理。細(xì)胞培養(yǎng)至48 h后半量換液，待細(xì)胞長至90%左右，按1:3的比例傳代，以后每3 d進(jìn)行一次全量換液，倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)并拍照記錄。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖率 各組細(xì)胞在5% CO2于37℃培養(yǎng)條件下同步孵育，每組細(xì)胞設(shè)3個復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后給藥處理繼續(xù)培養(yǎng)48 h再取出各組樣本，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，棄去培養(yǎng)液，37℃繼續(xù)孵育4 h后棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)裂解，振蕩15 min使結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞吸光度值A(chǔ)570(630 nm校準(zhǔn))，計算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率=處理組A570/對照組A570× 100%。

1.4 流式細(xì)胞法檢測心肌細(xì)胞凋亡 取分組處理后的心肌細(xì)胞，用4℃預(yù)冷的PBS緩沖液將細(xì)胞洗滌兩次，加入0.25%胰酶消化，收集后迅速加入0.5 mL 1×Annexin V結(jié)合緩沖液，低速離心后棄掉上清，另加入結(jié)合緩沖液10 μL和PI 5 μL并混勻，37℃避光孵育30 min，在488 nm的激發(fā)波長和530 nm的發(fā)射波長的條件下，用流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞H9c2的凋亡率。

1.5 Western blot檢測蛋白表達(dá) 將各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)皿置于冰上，PBS漂洗兩次，加入4℃預(yù)冷的RIPA細(xì)胞蛋白裂解液65 μL，低溫條件下超聲破碎得到細(xì)胞總蛋白，蛋白定量檢測采用BCA法?？偟鞍捉?jīng)SDS-PAGE電泳后用恒流濕法轉(zhuǎn)膜。加入5%脫脂奶粉-TBST封閉液于室溫封閉1 h，再分別加入1:3 000稀釋的山羊抗鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cleaved caspase-3、cTnT、MB、CK-MB、LDH和β-actin一抗，4℃輕搖過夜；隨后加入相應(yīng)的HRP-標(biāo)記的兔抗山羊二抗(1：100稀釋)，37℃恒溫?fù)u床孵育1 h。X線膠片曝光顯影，Image-Pro Plus分析結(jié)果。蛋白的相對表達(dá)量用待測蛋白與β-actin的灰度值比值計算。

1.6 氧化應(yīng)激指標(biāo)TBARS含量測定 每組細(xì)胞用0.01 M PBS溶解制成細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2× 107cells/mL。將1 mL TBA：TCA：HCl=1:1:1的溶液混勻(其中含0.37%硫代巴比土酸、15%三氯乙酸和0.25 N HCl)，沸水加熱15 min后冷卻，室溫1 000 r/min離心10 min。將一系列2～10 nm的標(biāo)準(zhǔn)溶液(甲氧基丙烷)做類似處理，上清在535 nm波長處檢測吸光值。

1.7 SOD活性測定 SOD的活性檢測按照試劑盒的說明測定。酶工作液與水溶性四氮唑鹽(WST)工作液加入每組心肌細(xì)胞中，37℃恒溫孵育20 min，于540 nm波長處測吸光值。

1.8 MDA活性測定 MDA含量用酶聯(lián)法測定，加入20%三氯乙酸(TCA)到各組細(xì)胞并孵育20 min，隨后加入0.1 mol/L鹽酸(HCl)和0.67%硫代巴比妥酸(TBA)于95℃水浴1 h。過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA能縮合TBA，生成紅色產(chǎn)物，離心后在532 nm波長處測吸光值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS15.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)除心肌細(xì)胞形態(tài)圖為定性資料外，均為定量資料，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，校驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05；多組間比較，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差齊性檢驗(yàn)符合方差整齊的假設(shè)，行單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VitaePro處理抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖率 各組細(xì)胞分別在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，由圖1A可以看出，與正常細(xì)胞對照組相比，缺氧組細(xì)胞數(shù)目明顯降低，部分細(xì)胞形態(tài)由長梭狀皺縮為三角形或片狀。紅花油組細(xì)胞數(shù)目與缺氧損傷模型組無明顯差異，VitaePro處理組細(xì)胞較缺氧組數(shù)目明顯增多。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比，缺氧損傷模型組細(xì)胞增殖率明顯下降(P＜0.05)。與缺氧組比較，VitaePro處理組細(xì)胞增殖率明顯升高(P＜0.05)，紅花油組與缺氧損傷模型組細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖1B。

圖1 VitaePro對缺氧誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞增殖的影響

2.2 VitaePro處理抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率升高 缺氧損傷模型組與正常細(xì)胞對照組比較細(xì)胞凋亡率顯著增加，從4.2%提高到14.6%(P＜0.05)；與缺氧損傷模型組比較，VitaePro處理組處理缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡受到明顯抑制，凋亡率降低至6.4% (P＜0.05)，且VitaePro處理組與正常細(xì)胞對照組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖2。

圖2 VitaePro對缺氧誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

2.3 VitaePro抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞線粒體凋亡信號通路中Bax表達(dá)升高，Bcl-2表達(dá)降低和凋亡標(biāo)志蛋白Cleaved caspase-3的表達(dá)升高 為進(jìn)一步研究VitaePro抑制缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，通過Western Blot檢測各組細(xì)胞中線粒體凋亡信號通路標(biāo)志蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3和Cleaved caspase-3的表達(dá)。與正常細(xì)胞對照組相比，缺氧損傷模型組中Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)顯著升高，分別升高5.0倍和6.2倍(P＜0.05)，Bcl-2的表達(dá)顯著降低11.0倍 (P＜0.05)，caspase-3的表達(dá)無明顯變化；VitaePro處理組與缺氧損傷模型組相比，Bax和Cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)水平分別降低2.1和2.4倍(P＜0.05)，Bcl-2水平顯著升高，提高5.5倍(P＜0.05)，且VitaePro處理組與正常細(xì)胞對照組各通路蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖3。

2.4 VitaePro抑制缺氧誘導(dǎo)的受損心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)TBARS升高，MDA水平升高，SOD水平降低 與正常細(xì)胞對照組比較，缺氧損傷模型組TBARS和MDA含量顯著增加(P＜0.05)，SOD活性明顯降低(P＜0.05)，TBARS水平從23.1 mmol/mg升高到74.2 mmol/mg，MDA含量從0.84 mmol/mg提高到2.9 mmol/mg，SOD活性從44.9 U/mg降低到13.2 U/mg。VitaePro處理可抑制缺氧引起的TBARS和MDA含量的增加(P＜0.05)，并顯著提高SOD的活性(P＜0.05)，TBARS水平降低到31.2 mmol/mg，MDA含量降低到1.22 mmol/mg，SOD活性增大到41.0 U/mg，見圖4。

2.5 VitaePro抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌損傷標(biāo)志蛋白的表達(dá)升高 Western blot檢測心肌損傷標(biāo)志蛋白cTnT、Mb、CK-MB和LDH的表達(dá)，結(jié)果表明，與正常細(xì)胞對照組比較，這四種標(biāo)志蛋白的表達(dá)在缺氧組中顯著升高(P＜0.05)，分別提高了15.2、8.5、1.7和9.2倍，VitaePro處理組與缺氧損傷模型組相比明顯降低(P＜0.05)，分別降低5.4、3.2、2.0和3.6倍，且VitaePro處理組與正常細(xì)胞對照組的蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖5。

圖3 各組心肌細(xì)胞中Bax，Bcl,Caspase-3和Cleaved caspase-3的表達(dá)水平

圖4 VitaePro對缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞TBARS與MDA含量以及SOD活性的影響

圖5 VitaePro對心肌損傷標(biāo)志蛋白表達(dá)水平的影響

3 討 論

缺氧一直是心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。研究表明，氧自由基增多是缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的重要因素，它們能直接損傷生物大分子，造成線粒體DNA (mtDNA)突變，引發(fā)線粒體代謝功能障礙[11]，從而導(dǎo)致抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，促凋亡蛋白Bax蛋白表達(dá)升高，并且激活Caspases凋亡蛋白引起心肌細(xì)胞凋亡[12]。因此能抵抗氧自由基增多，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子表達(dá)的抗氧化物質(zhì)在抑制缺氧引起的細(xì)胞損傷中具有重要作用。VitaePro是一種新型抗氧化物質(zhì)，由蝦青素、葉黃素和玉米黃素三種抗氧化物質(zhì)組成，其中蝦青素已被證實(shí)能通過抗氧化作用降低四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病鼠淋巴球細(xì)胞質(zhì)中Ca2+水平，減少超氧陰離子、一氧化氮和過氧化氫的含量，從而抑制細(xì)胞凋亡[13]。本研究首先通過MTT和流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞的增殖和凋亡，發(fā)現(xiàn)與缺氧心肌細(xì)胞相比，經(jīng)VitaePro處理的細(xì)胞增殖率顯著提高，凋亡降低。推測VitaePro能抑制缺氧引起的心肌細(xì)胞損傷。

線粒體凋亡通路是心肌細(xì)胞凋亡的標(biāo)志性通路之一，主要包括Bcl-2家族的激活，細(xì)胞色素C(Cytc)的釋放以及Caspase級聯(lián)反應(yīng)[14-15]。缺氧致使心肌細(xì)胞受損后，凋亡信號因子Bax可能改變線粒體外膜電壓依賴性陰離子通道(VDAC)構(gòu)象，開放線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(MPTP)，使細(xì)胞凋亡因子釋放到胞漿[16]，Bax也可能發(fā)生多聚化，形成膜通道口，使Cytc從線粒體釋放到胞漿，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡升高[17]。當(dāng)缺氧使心肌細(xì)胞中凋亡因子作用于線粒體時，Bcl-2可與線粒體外膜的VDAC結(jié)合，關(guān)閉MPTP，抑制Bax在線粒體的定位和寡聚化，抵抗Cytc誘導(dǎo)的Caspase級聯(lián)激活，從而抑制細(xì)胞凋亡[18]。研究表明蝦青素能阻止促凋亡蛋白Bax和Bad的易位，影響B(tài)cl蛋白從線粒體轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)中，從而抑制細(xì)胞凋亡[10]。本研究結(jié)果表明，缺氧心肌細(xì)胞經(jīng)VitaePro處理能下調(diào)Bax和Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)，并上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)。證明VitaePro可以抑制缺氧心肌細(xì)胞中的線粒體凋亡通路，與Shen等[19]報道一致。

TBARS、MDA和SOD等氧化指標(biāo)常用來反映機(jī)體氧化應(yīng)激水平[20]。很多抗氧化劑已被證實(shí)能降低細(xì)胞中氧化應(yīng)激水平，促進(jìn)細(xì)胞存活[21-22]。研究表明，類胡蘿卜素、葉黃素和玉米黃素是具有強(qiáng)抗氧化力的單藥[23]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺氧心肌細(xì)胞經(jīng)VitaePro處理能降低細(xì)胞中的TBARS與MDA的含量，并顯著提高SOD的活性。表明VitaePro的抗氧化作用可以顯著降低缺氧引起的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激，從而保護(hù)心肌細(xì)胞。

綜上所述，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了缺氧會引起心肌細(xì)胞的損傷，但VitaePro可通過抑制心肌細(xì)胞內(nèi)的線粒體凋亡通路，降低細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖并減少細(xì)胞凋亡。說明VitaePro對缺氧引起的心肌細(xì)胞損傷有明顯的對抗和保護(hù)作用。由于時間有限，本實(shí)驗(yàn)僅在體外建立心肌缺氧損傷模型，進(jìn)一步研究計劃建立心肌缺氧損傷的動物模型，探究VitaePro在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

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Protective effects of VitaePro inhibiting the mitochondrial pathways on hypoxia-induced cardiomyocytes injury.

ZHAO Bei1,GUAN Gong-chang2,LIU Hong-mei3.Department of Medical insurance1,Department of Cardiology2, Department of Nursing3,Shaanxi Provincial People's Hospital,Xi'an 710068,Shaanxi,CHINA

Objective To study the protective effect and mechanism of VitaePro on hypoxia-induced cardiomyocytes injury.MethodsRat myocardial cells H9c2 were randomly divided into four groups:H9c2 group(the control group),Hypoxia+H9c2 group,Safflower oil+hypoxia+H9c2 group and VitaePro+hypoxia+H9c2 group.Cell proliferation and cell apoptosis were detected by MTT and flow cytometry,respectively.The expression levels of mitochondrial apoptotic pathway related proteins were measured by Western blot,including B cell lymphoma 2(Bcl-2),Bcl-2-associated X(Bax),Caspase-3 and Cleaved caspase-3.The thiobarbituric acid reactive substance(TBARS)level,malondialdehyde(MDA)content and superoxide dismutase(SOD)activity were measured by corresponding kits.Finally,the expression of cardiovascular injury markers protein were measured by Western blot,including cardiac troponin T(cTnT),myohemoglobin(Mb),creatine kinase isozyme MB(CK-MB)and lactic dehydrogenase(LDH).ResultsCompared with control group,the cell proliferation in Hypoxia+H9c2 group was significantly decreased(P＜0.05),and the cell apoptosis was significantly increased(4.2%～14.6%,P＜0.05).The expression level of Bcl-2 was significantly decreased,while Bax and Cleaved caspase-3 were significantly increased(P＜0.05).The level of TBARS and the content of MDAwere increased,and the activity of SOD was decreased from 44.9 U/mg to 13.2 U/mg.The expressions of cardiovascular injury markers cTnT,Mb,CK-MB and LDH were significantly increased(P＜0.05).Compared with Hypoxia+H9c2 group,the cell proliferation in VitaePro+hypoxia+H9c2 group was increased(P＜0.05),and the cell apoptosis was decreased to 6.4%.The expression level of Bcl-2 was increased,while Bax and Cleaved caspase-3 were significantly decreased(P＜0.05).The level of TBARS and the content of MDA was significantly decreased(P＜0.05),and the activity of SOD was increased to 41.0 U/mg.The expressions of cardiovascular injury markers cTnT,Mb,CK-MB and LDH were significantly decreased(P＜0.05).ConclusionVitaePro can reduce hypoxia-induced myocardial cell injury in rats via inhibiting mitochondrial apoptosis pathway and through antioxidant effect.

Rat myocardial cells H9c2;VitaePro;Hypoxia;Mitochondrial pathways;Mechanism

R-332

A

1003—6350（2016）12—1900—06

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.12.003

2015-12-31)

官功昌。E-mail：huiqingguohn@163.com