洪勝輝，王芊芊，陳曉娟，劉迪文

(浙江大學(xué) 實驗動物中心，浙江 杭州 310058)

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小鼠種質(zhì)資源冷凍保存技術(shù)及研究進(jìn)展

洪勝輝，王芊芊，陳曉娟，劉迪文

(浙江大學(xué) 實驗動物中心，浙江 杭州 310058)

摘要：20世紀(jì)80年代以來，隨著轉(zhuǎn)基因、基因敲除等生物工程技術(shù)的不斷發(fā)展，Cas9等基因編輯技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，由此產(chǎn)生大量的生物工程小鼠。建立一種常規(guī)、安全、可靠的種資保存方法，保存這些極其珍貴的生物資源至關(guān)重要。本文綜述了當(dāng)前廣泛應(yīng)用的冷凍保種技術(shù)方法。

關(guān)鍵詞：小鼠；胚胎冷凍；精子冷凍；卵巢冷凍

動物種質(zhì)保存通常有活體保種、冷凍保種和基因克隆三種方法。長期活體保種，不僅需要大量的空間和維持經(jīng)費，還有可能在繁殖的過程中發(fā)生遺傳漂變和污染?；蚩寺≈荒鼙３治锓N的遺傳信息，但是無法保存種質(zhì)；冷凍保種，可有效的防止種群的遺傳漂變，遺傳資源丟失和污染，還可以減輕繁育工作者的負(fù)擔(dān)，因此成為當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的方法。在長達(dá)半個世紀(jì)的研究中，胚胎冷凍、精子冷凍等技術(shù)取得了快速發(fā)展，為生命科學(xué)研究提供基礎(chǔ)。由于國際資源共享愈來愈頻繁，活體的運輸由于其笨重、易受污染等缺點受到極大限制，以冷凍胚胎和精子形式的運輸發(fā)揮了巨大作用。

1冷凍保存的基本原理

通過一定的保護(hù)措施和降溫程序，將胚胎或者細(xì)胞保存在-196℃條件下，細(xì)胞代謝作用暫時停止或者減弱到足夠小的程度，當(dāng)使用一定的措施和升溫程序，細(xì)胞又能夠恢復(fù)代謝的能力，從而能夠長期保存，這就是冷凍保存技術(shù)。

細(xì)胞冷凍保存的關(guān)鍵是防止在降溫或者解凍的過程中，過多過大冰晶的產(chǎn)生，冰晶能夠刺傷胞質(zhì)或者胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。胚胎是發(fā)育中的細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)含水量高達(dá)80%以上，冷凍過程中會有90%的水分形成游離水而形成冰晶。為了減小細(xì)胞在冷凍過程中的損傷，冷凍保護(hù)劑應(yīng)運而生。常用的冷凍保護(hù)劑分為滲透性冷凍保護(hù)劑和非滲透性冷凍保護(hù)劑。滲透性保護(hù)劑是小分子物質(zhì)，如甘油、乙二醇、DMSO、丙二醇等，可通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與水結(jié)合后，使水的冰點下降，使之不易形成冰晶，從而起到冷凍保護(hù)作用。非滲透性冷凍保護(hù)劑，分子量大，如蔗糖、聚蔗糖、海藻糖和棉子糖等多元醇，在冷凍過程中不進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，通過提高細(xì)胞外液滲透壓，使細(xì)胞內(nèi)的水分充分外流，從而減少冰晶形成，達(dá)到冷凍保護(hù)的目的。

2小鼠胚胎冷凍保種

2.1小鼠胚胎冷凍研究進(jìn)展

小鼠是模式動物，因而小鼠種質(zhì)資源的保存至關(guān)重要。事實上，絕大部分胚胎冷凍技術(shù)的發(fā)展，冷凍保護(hù)劑的研究都是以小鼠胚胎為模型，從早期的慢速冷凍到如今的玻璃化冷凍。

隨著轉(zhuǎn)基因、基因敲除技術(shù)的發(fā)展，各種遺傳修飾小鼠的數(shù)量越來越多，長期保存這些珍貴的品系是一項復(fù)雜而重大的工程。普遍認(rèn)為，玻璃化冷凍技術(shù)無論在速度、操作難度以及復(fù)蘇后胚胎的存活率方面都更為先進(jìn)。1985年，Rall和Fahy用高濃度的二甲基亞砜(DMSO)、乙酰胺(AC)、丙二醇(PG)和聚乙二醇(PEG)混合組成玻璃化液，對8細(xì)胞期小鼠胚胎進(jìn)行一步冷凍獲得成功，胚胎解凍后培養(yǎng)發(fā)育率達(dá)87.5%。1989年，Nakagata將DMSO、AC、PG按照2 mol/L、1 mol/L、3 mol/L混合成冷凍保護(hù)劑，簡稱DAP213法[2]。1990年，Kasai等[3]利用乙二醇(Ethylene glycol，EG)代替DMSO，加上聚蔗糖(Ficoll70)和蔗糖制備了EFS40冷凍保護(hù)劑冷凍胚胎，取得了很好的效果，隨后發(fā)展的EFS20/40冷凍胚胎，效果更佳，稱為EFS方法[4]。此外，還有Schefen的GP25法(用甘油和丙三醇制備冷凍保護(hù)液)[5]。

近20年來，為了尋找高效、低毒的冷凍保護(hù)劑，研究人員做了大量的研究。Liu等[6]分別用PROH、EG和甘油作為冷凍保護(hù)劑，并分別采取慢速冷凍和玻璃化冷凍方法凍存小鼠8細(xì)胞胚胎。實驗結(jié)果為，當(dāng)采用慢速冷凍時，PROH冷凍的8細(xì)胞復(fù)蘇存活率、囊胚發(fā)育率明顯高于DMSO和甘油，和EG相比沒有明顯差別。當(dāng)采用玻璃化法冷凍時，EG作為冷凍保護(hù)劑，8細(xì)胞的存活率和囊胚發(fā)育率明顯高于PROH、EG和甘油，而后三者之間沒有明顯差別。結(jié)果表明PROH更適合8細(xì)胞慢速冷凍，而EG更適合于玻璃化冷凍。2011年，Ogura實驗室對Kasai 的EFS方法做了一些改進(jìn)，他們將塑料麥管替換成凍存管，先將少量EFS40溶液加入凍存管中，然后在室溫下將胚胎置于EFS20中平衡2 min，之后將脫水的胚胎吹入凍存管中，投入液氮中保存(如圖1)。這種方法凍存復(fù)蘇操作方便，胚胎復(fù)蘇存活率能達(dá)到95%以上，囊胚發(fā)育率在90%左右，移植生仔率在50%～60%[5]。

2.2胚胎冷凍的方法

常規(guī)的胚胎冷凍方法有慢速冷凍法、快速冷凍法和玻璃化冷凍方法。1971年Whittingham等建立了緩慢冷凍法[6]。將胚胎置于冷凍保護(hù)劑(cryoprotectiveagent，CPA)中，利用不同溫差的冰箱分階段降溫或者程控降溫儀勻速降溫，一般降溫速度為0.2～0.8℃/min，降到-80℃時，放入液氮中(-196℃)保存。在此基礎(chǔ)上發(fā)展了誘導(dǎo)結(jié)晶冷凍法，先以1℃/min的速度降溫至-6℃～-7℃時植冰誘導(dǎo)結(jié)晶，再以0.1～0.3℃/min 的速率降溫至-30℃～-35℃后投入液氮保存。這種冷凍程序方法比較成熟，廣泛應(yīng)用在牛、羊、馬等動物。慢速冷凍法采用的冷凍保護(hù)劑毒性小，胚胎復(fù)蘇存活率和移植率較高，但是操作繁瑣，費時較長，且需控溫儀器，實驗成本較高。Wood等于1980年提出了二步冷凍法，即在室溫下，將胚胎置于冷凍保護(hù)劑中平衡脫水一定時間后，先迅速降溫至-20℃～-60℃，平衡一段時間后直接投入液氮中保存。此種方法在小鼠、牛、兔上試驗都獲得成功。在二步冷凍法的基礎(chǔ)上又發(fā)展了一步冷凍法，此法采用滲透性保護(hù)劑和非滲透性保護(hù)劑組合的混合液(主要是甘油和蔗糖)，在室溫下平衡脫水一定時間后，直接在液氮蒸汽中停留片刻后投入液氮保存[7]。在這些方法的基礎(chǔ)上，在簡化操作步驟，節(jié)省時間的原則下，研究人員不斷改進(jìn)優(yōu)化，發(fā)展了玻璃化冷凍方法。玻璃化冷凍方法是將滲透性保護(hù)劑與非滲透性保護(hù)劑按照一定的比列，組成玻璃化的保護(hù)劑，這種溶液在低溫下呈現(xiàn)黏稠透明的狀態(tài)，不發(fā)生結(jié)晶即可固化，此固體物質(zhì)能保持分子和離子正常的液態(tài)分布，是一種超快速冷凍模式[2，8]。 Rall 和Fahy 1985年首先報道了這種方法。玻璃化冷凍使用高濃度的低溫保護(hù)劑，操作簡單，不需要昂貴的設(shè)備。只需將胚胎用玻璃化液處理，短暫平衡脫水，然后直接投入液氮。 玻璃化冷凍保護(hù)劑最主要的是DMSO和乙二醇。自玻璃化冷凍發(fā)現(xiàn)以來，人們在不斷的探索簡單、高效、低毒的冷凍保護(hù)劑。

2.3胚胎解凍方法

胚胎解凍的方法一般依據(jù)冷凍時的速度，通常慢速冷凍采用慢速解凍法，解凍速度不超過25℃/min?？焖倮鋬霾捎檬覝鼗蛘?7℃水浴解凍，然后用蔗糖溶液洗脫。玻璃化冷凍法一般用37℃快速解凍，而后用梯度蔗糖溶液洗脫保護(hù)劑[9]。

3小鼠精子冷凍保存技術(shù)

3.1小鼠精子冷凍的研究進(jìn)展

與胚胎冷凍保存相比，精子冷凍保種更加方便、快速，不需要通過繁殖更多的母鼠來超排獲取胚胎，只需要2～3只雄鼠，因而成本更低。

自1949年P(guān)olge 和Smith等[10]偶然發(fā)現(xiàn)低溫保存的精子具有活力以來，精子冷凍保種技術(shù)已經(jīng)廣泛運用于家畜的繁殖、人不育癥的治療和瀕危動物的保存。但是由于精子結(jié)構(gòu)的特殊性，小鼠精子膜具有較低的水滲透性和較長的尾巴，且精子的遺傳物質(zhì)高度濃縮于精子頭部，胞外物質(zhì)極少，因而精子極易受損，對冷凍損傷也極為敏感。如今，實驗室廣泛采用Nakagata的R18S3法冷凍小鼠的精子[11]，獲得了較好的結(jié)果。與此同時，各個實驗室在原有R18S3方法的基礎(chǔ)上，不斷優(yōu)化發(fā)展，使小鼠冷凍精子體外受精的受精率不斷提高，為建立遺傳工程小鼠精子庫提供基礎(chǔ)。下文將從精子冷凍的保護(hù)劑、冷凍方法、解凍和復(fù)蘇方法，以及影響精子冷凍保存的因素來闡述精子冷凍方法的發(fā)展。

3.2精子冷凍保護(hù)劑

與胚胎冷凍原理類似，精子的冷凍保存同樣要克服冷凍過程中冰晶的產(chǎn)生及高溶質(zhì)產(chǎn)生的“溶液效應(yīng)”。因而，選擇一種恰當(dāng)?shù)睦鋬霰Ｗo(hù)劑對于冷凍精子復(fù)蘇后活力的恢復(fù)至關(guān)重要。R18S3是目前冷凍精子較為成熟的方法，它是由18%的棉子糖和3%脫脂奶粉組成[11]。這種冷凍保護(hù)劑可以冷凍不同品系的小鼠，包括轉(zhuǎn)基因小鼠。2008年，美國Jackson實驗室研究12個常用遺傳工程背景鼠精子冷凍發(fā)現(xiàn)，在R18S3溶液中添加477μm/L的硫代甘油能夠提高小鼠冷凍精子體外受精率到70%[12]。2010年，Nakagata研究發(fā)現(xiàn)在R18S3溶液中添加100 mol/L的 L-谷氨酰胺，能夠提高冷凍精子復(fù)蘇后的體外受精率。分析認(rèn)為：冷凍保護(hù)劑中添加L-谷氨酰胺能夠減少精子在冷凍過程中的損傷，從而提高冷凍精子的活力，而精子獲能液中添加MBCD能夠促使精子釋放更多的膽固醇，調(diào)控精子膜表面的離子通道[13]。

3.3冷凍方法

精子冷凍時，當(dāng)溫度下降到-6℃～ -10℃，原生質(zhì)會發(fā)生結(jié)晶樣硬化，原生質(zhì)的結(jié)構(gòu)受到破壞，精子死亡，而當(dāng)精子溫度接近0℃時，采用迅速冷凍，使精子迅速越過結(jié)晶硬化期，形成玻璃化，精子就不會死亡。因此，冷凍精子時，使用快速降溫比緩慢降溫效果更好[14]。R18S3法的過程是：先取出附睪，除去血液和脂滴，用手術(shù)剪剪開附睪，置于冷凍保護(hù)劑中37℃熱臺上平衡3 min，然后去除附睪組織，平均分成若干份，吸入麥管，封口后置于浮在液氮表面的浮標(biāo)上平衡10 min，最后直接投入液氮中保存。

3.4解凍和復(fù)蘇方法

近年的研究表明，冷凍精子的解凍快速升溫是最佳的。Jackson實驗室比較了54℃水浴和37℃水浴解凍精子的效果。結(jié)果表明，37℃解凍復(fù)蘇的精子體外受精后2細(xì)胞胚胎發(fā)育率比54℃水浴解凍高很多。其原因37℃水浴解凍復(fù)蘇能夠減少精子在復(fù)蘇過程中所受的熱損害[15]。解凍后精子的獲能時間對體外受精率也有影響。Liu Ling 等[16]以TYH為精子獲能液，研究了C57BL/6J小鼠冷凍精子復(fù)蘇后獲能時間對體外受精率的影響。實驗結(jié)果表明，獲能20 min 或者獲能45min體外受精率沒有明顯差別，但都顯著高于60 min。Nakagata 的R18S3法冷凍的精子獲能液為TYH加MBCD，冷凍精子經(jīng)過37℃水浴10 min后，獲能時間為30 min時，體外受精率最佳[13]。Jackson實驗室的研究人員認(rèn)為，由于冷凍過程影響了精子的發(fā)育，在體外獲能過程中需要更多的時間才能發(fā)育成熟，因而他們采取的方法是解凍時間短暫，37℃水浴5 s后，直接加入獲能液中獲能60 min，通過延長獲能時間使精子成熟后受精[12]。此外，不同的品系實驗結(jié)果也不同，這需要研究者根據(jù)獲能液、解凍時間等因素來確定后續(xù)的獲能時間。

4小鼠卵巢冷凍保存

卵巢是雌性哺乳動物生殖系統(tǒng)的重要組成部分。在保種過程中，對于衰老或者突然死去以及遺傳工程修飾的繁殖能力低的珍貴雌鼠的卵巢予以及時冷凍保存。需要時，可通過解凍卵巢，移植入其他小鼠體內(nèi)發(fā)育獲得成熟卵泡。

4.1卵巢冷凍的方法

卵巢冷凍的基本原理與胚胎冷凍的原理類似，在20世紀(jì)90年代初期，小鼠、大鼠、兔、猴、牛等的卵巢組織玻璃化冷凍均獲得成功。但是目前世界上卵巢玻璃化冷凍方法還未形成一個標(biāo)準(zhǔn)的方法可參考，通常的做法是將卵巢組織切成1 mm的小塊，也有將卵巢整個進(jìn)行冷凍。先在較低濃度的玻璃化冷凍保護(hù)劑中平衡數(shù)分鐘，然后加到高濃度的冷凍保護(hù)劑中，投入液氮中保存。

常用的卵巢組織冷凍保護(hù)劑有甘油、乙二醇、丙二醇、二甲基亞砜等小分子滲透性保護(hù)劑以及蔗糖、棉子糖等大分子非滲透性保護(hù)劑。滲透性與非滲透性保護(hù)劑的聯(lián)合使用，制成高效低毒的玻璃化冷凍保護(hù)劑是卵巢組織冷凍的研究方向[17]。

4.2卵巢移植技術(shù)

理論上的移植方法有異種移植、異位自體移植、原位移植。目前采用的卵巢移植方法為異體原位移植：將衰老或者突然死亡的雌鼠卵巢整個取出，冷凍后移植或者新鮮移植入近交系小鼠卵巢覆膜內(nèi)。移植前選擇健康發(fā)情正常的小鼠受體，摘除整個卵巢，然后將要移植的卵巢移進(jìn)卵巢覆膜，縫口飼養(yǎng)一定時間后，用雄鼠與受體雌鼠交配，檢查見栓及產(chǎn)仔情況。

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中圖分類號：S865.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：1005-2739(2016)03-0008-04

作者簡介：洪勝輝(1986-)，男，碩士，初級實驗員。通訊作者：劉迪文(1957-)，男，研究員。

收稿日期：2016-02-15