劉斐　賀京軍

廣東省第二人民醫(yī)院VIP體檢中心　廣州 510220

·綜述·

牙切片器官培養(yǎng)模型的建立與應(yīng)用

劉斐賀京軍

廣東省第二人民醫(yī)院VIP體檢中心廣州 510220

牙切片器官培養(yǎng)模式是一種有效的在體外保持了牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體生物學(xué)特性的實驗方法，可用于進行各種生物性，物理性，化學(xué)性組織損傷和修復(fù)的研究。本文就牙切片器官培養(yǎng)模型的建立方法和實驗應(yīng)用進展作一綜述。

牙切片；器官培養(yǎng)；模型

This study was supported by Natural Science Foundation of China（81371137） and Youth Science and Technology Personnel Cultivation Project of Scientific Research Initiative in Southern Medical University（PY2014N051）

［Abstract］The tooth slice organ culture model provides a valuable approach for the in vitro study of biological and physical chemical injury and repair processes in the dentin pulp complex over long periods. This paper introduces recent studies on the establishment and application of the model.

［Key words］tooth slice；organ culture；model

牙髓病是一種常見的口腔疾病，直接危害口腔健康，也是引起疼痛的主要原因。牙髓病臨床表現(xiàn)復(fù)雜，要進一步探討其發(fā)病機制及治療評價，單憑臨床觀察遠遠不夠，需要建立穩(wěn)定、可靠的實驗?zāi)Ｐ?。牙切片器官培養(yǎng)的方法在實驗中能有效地保留牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體，相較于傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)更能真實地模擬臨床中牙髓組織對各種外來刺激的生物學(xué)反應(yīng)，進而逐漸被學(xué)者們應(yīng)用于實驗研究當中。本文將對牙切片模型的建立方法和檢測，以及該類模型在牙髓生物學(xué)中的研究應(yīng)用進行綜述。

1　模型的建立

1996年Magloire等［1］牙切片至厚度約為750 μm后完全浸沒于培養(yǎng)液體中，成功體外培養(yǎng)約30 d。Sloan等［2］在此基礎(chǔ)上改良為厚牙片聯(lián)合應(yīng)用Trowell器官培養(yǎng)法。將Wistar大鼠中切牙在蒸餾水冷卻下，用金剛鉆慢速切割機橫向切割約2.0 mm厚牙片，用含1%低熔點瓊脂培養(yǎng)液包被，冷卻后將被半固體培養(yǎng)基包被的牙切片放置于Trowell的乙酸纖維濾膜上，進行氣液面雙向培養(yǎng)。朱曉茹等［3］采用Sloan的牙切片方法將成年人健康前磨牙處理為厚度2.0 mm后在體外培養(yǎng)，并有效地保持其生物特性約1周。相較于完全浸入培養(yǎng)法，瓊脂半固定培養(yǎng)法加大了實驗的調(diào)控性，可以進行定位施藥技術(shù)，實驗結(jié)果更為真實準確。

2　模型的檢測

在形態(tài)學(xué)方面，通過蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）色觀察在各個培養(yǎng)期牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。如各細胞層的結(jié)構(gòu)形態(tài)；成牙本質(zhì)細胞與牙本質(zhì)連接緊密程度；單位面積內(nèi)細胞的密度。電鏡觀察培養(yǎng)期中細胞內(nèi)和細胞間的超微結(jié)構(gòu)變化。如牙本質(zhì)小管中的成牙本質(zhì)細胞突起的形態(tài)結(jié)構(gòu)；與臨近成牙本質(zhì)細胞間的連接緊密度；在培養(yǎng)后期可能出現(xiàn)的細胞長度縮短，胞內(nèi)的空泡性變，胞間的連接減少或消失。判斷體外培養(yǎng)的牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體形態(tài)的完整性［2-4］。

在生物特性方面，用免疫組化的方法檢測，牙切片體外或體內(nèi)培養(yǎng)各期中前期牙本質(zhì)和成牙本質(zhì)細胞中牙本質(zhì)涎磷蛋白（dentin sialophospho protein，DSPP）表達變化情況，DSPP是與成牙本質(zhì)細胞的分化密切相關(guān)的特異性表達蛋白，是檢測成牙本質(zhì)細胞活性的生化指標。觀察牙切片培養(yǎng)過程中是否保持了正常牙髓組織的生物性能［3-4］。

3　實驗?zāi)Ｐ偷脑谘浪枭飳W(xué)中的應(yīng)用

3.1生物性刺激

牙髓細胞離體培養(yǎng)是研究外源性生物因子對牙髓組織刺激的最常用的方法，有學(xué)者［5-6］為了在體外培養(yǎng)時更好地保持細胞的生物學(xué)特征，采用了不同材料的支架混合細胞進行三維立體培養(yǎng)。Magloire最早將牙切片至厚度約750 μm，放置于培養(yǎng)皿中，并完全浸沒于培養(yǎng)液體中，在體外培養(yǎng)約30 d。Sloan等［2，7］在此基礎(chǔ)上采用厚牙片聯(lián)合應(yīng)用Trowel 器官培養(yǎng)法，將Wistar大鼠中切牙在蒸餾水冷卻下，用金剛鉆慢速切割機橫向切割約2.0 mm厚牙片，用含1%低熔點瓊脂培養(yǎng)液包被，冷卻后將被半固體培養(yǎng)基包被的牙切片放置于Trowel的乙酸纖維濾膜上，進行氣液面雙向培養(yǎng)；然后使用形態(tài)學(xué)方法觀察到牙片各層組織細胞能維持正常生物形態(tài)2周左右。他們通過在半固定培養(yǎng)基上放置含有外源性因子轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β1、2、3，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-7瓊脂糖微球于牙片上的成牙本質(zhì)細胞區(qū)，觀察其作用因子能否促進成牙本質(zhì)細胞分泌細胞外基質(zhì)，影響前期牙本質(zhì)形成，與作用濃度是否呈相關(guān)性。Gon?alves等［8］在研究血管內(nèi)皮生長因子對（vascular endothelial growth factor，VEGF）人牙髓組織的再生作用時，將48顆健康完整第三磨牙在磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）冷卻下用鋸式切片機橫向切割成厚度為1.5 mm的牙片，實驗組加入定量的VEGF刺激培養(yǎng)后將牙切片植入裸鼠體內(nèi)，7 d后行形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，牙切片在體內(nèi)培養(yǎng)后仍能保持組織的正常形態(tài)結(jié)構(gòu)。

牙切片組織培養(yǎng)法同樣適用于檢測口腔材料的生物相容性。Moseley等［9］在研究氟化物對細胞外基質(zhì)礦化作用的影響時，在PBS冷卻下將Wistar大鼠的中切牙用鋸式切片機橫向切割為厚度2.0～3.0 mm的牙片，置于Trowell上培養(yǎng)，在半固定培養(yǎng)基混入一定濃度的氟化物，培養(yǎng)至1～14 d時行形態(tài)學(xué)觀察，并計算成牙本質(zhì)細胞層和牙髓中心區(qū)域內(nèi)完整細胞的密度，分析胞質(zhì)胞核大小比例以及新形成的前期牙本質(zhì)的寬度，并通過3H-脯氨酸法測定相關(guān)膠原合成情況。Murray等［10］為研究不同的蓋髓材料與牙髓組織間的生物相容性，將新鮮離體的Wistar大鼠中切牙備洞，去除玷污層，將蓋髓材料新鮮調(diào)制后充填，表面涂布一層牙蠟防止材料的溶解，蒸餾水冷卻下慢速橫向切割為厚度2 mm的牙片，置于Trowell上培養(yǎng)，培養(yǎng)至10 d時行形態(tài)學(xué)觀察單位面積內(nèi)的成牙本質(zhì)細胞層、成牙本質(zhì)細胞層下方以及牙髓成纖維細胞層3處的細胞狀態(tài)、數(shù)目和細胞間的連接情況。Saw等［11］采用同樣的培養(yǎng)方法，并使刺激藥物直接或間接接觸牙片，培養(yǎng)48 h后行形態(tài)學(xué)觀察，檢測接觸區(qū)域的細胞形態(tài)、細胞間連接情況，計算單位面積內(nèi)完整細胞的密度；噻唑蘭（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium，MTT）法檢測組織塊內(nèi)細胞增值的數(shù)目，同時比較常規(guī)的標準株L929的體外培養(yǎng)模式。

張丹等［12］為研究不同蓋髓劑對牙髓的修復(fù)作用，將健康完整的30顆前磨牙備洞后露髓后隨機分組，用自酸蝕黏結(jié)劑和氫氧化鈣蓋髓，復(fù)合樹脂充填窩洞，冷卻下用鋸式切片機縱向切割為厚度2.0 mm的牙片；普通培養(yǎng)14 d后行HE檢測，免疫組化監(jiān)測DSPP和氫氧化鈣的染色情況。朱曉茹等［13］為研究尼莫地平對人牙本質(zhì)的形成和礦化作用的影響，采用健康完整的成年磨牙，用慢速切片機橫向切割為厚度2.0 mm的牙片，置于Trowel上培養(yǎng)。相較于用標準株L929細胞系來與生物材料共培養(yǎng)的方法，牙切片培養(yǎng)法充分綜合利用了其形態(tài)學(xué)和生物性的優(yōu)勢，能更加有效地真實模擬臨床效果，實驗結(jié)果更為準確。

3.2物理性刺激

牙切片的模型同樣適用于物理因素的干擾實驗，在保留了牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的模型上更能真實有效地反映牙髓情況。Seux等［14］為了研究脈沖Nd：YAG激光照射對牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體的反應(yīng)，將36顆健康完整的第三磨牙統(tǒng)一備洞后用不同頻率和能量值的脈沖Nd：YAG激光照射。隨后在PBS冷卻下用鋸式切片機將組織切割為厚度約0.75 mm的牙片，普通培養(yǎng)至4 d時，行形態(tài)學(xué)觀察實驗各組的細胞形態(tài)改變以及不同的照射頻率和能量值的影響下，洞底區(qū)細胞裂解的程度和范圍和微膿腫的形成頻率的變化過程，并通過免疫組化的方法檢測洞底下方及髓核處Ⅳ和Ⅲ型膠原的表達變化以及伴隨新生血管的形成過程。Brucoli等［15］在Seux等［14］的基礎(chǔ)上對牙切片進行X線攝影像行光密度值分析，觀察受輻照區(qū)域的牙片細胞的密度值改變，進一步證明經(jīng)脈沖Nd：YAG激光能促進組織的礦化程度并加強牙髓組織的防御修復(fù)機制。

Al-Daghreer等［16-17］為檢測治療性低強度脈沖超聲（low intensity pulsed ultrasound，LIPUS）對牙髓的長期和短期的修復(fù)作用，分別將92和63顆健康完整的前磨牙在PBS沖洗下用慢速切片機橫向切割厚度為0.6 mm的牙切片，隨機分組后LIPUS照射處理。普通培養(yǎng)1、5 d后行形態(tài)學(xué)觀察完整成牙本質(zhì)細胞密度和前期牙本質(zhì)的厚度，并通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（reverse transcription poly-merase chain reaction，RT-PCR）檢測人牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白（dentin matrix protein，DMP）1、DSPP、骨保護蛋白（osteoprote-gerin，OPG）等先關(guān)指標的變化情況。

李昊妍等［18］為研究牙體熱損傷后牙本質(zhì)牙髓組織中基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2和9的表達變化，將30顆健康完整的第三磨牙在面統(tǒng)一制備直徑2.0 mm、深度為牙本質(zhì)厚度的1/2的窩洞，PBS冷卻下500 HC金剛砂磨片縱向切割為厚度2.0 mm的牙片，普通培養(yǎng)14 d后，行免疫組化染色、實時PCR和蛋白質(zhì)印跡法，檢測模型組MMP-2、MMP-9在成牙本質(zhì)細胞和牙髓細胞中表達情況。Murray等［19］為研究不同的備洞和處理條件下對牙髓的影響，在Wistar大鼠中切牙上直接進行備洞處理后直接拔出并切片，置于Trowel培養(yǎng)2周，通過形態(tài)學(xué)方法觀察牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體的反應(yīng)情況，分析不同的刺激因素及修復(fù)因素對牙髓組織的影響。

4　展望

牙切片體外培養(yǎng)模式有效保留了釉質(zhì)、牙本質(zhì)以及牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體的器官完整性，更好地體現(xiàn)了原有的細胞與細胞、細胞與基質(zhì)、細胞與牙齒硬組織的三維關(guān)系［20］。在形態(tài)和功能上，均能更為真實地模擬體內(nèi)環(huán)境，為牙體組織損傷修復(fù)的研究、細胞與基質(zhì)間相互作用的研究以及修復(fù)性牙本質(zhì)形成的研究提供了一個實驗?zāi)Ｐ汀６夷茉谕粚嶒瀸ο笾性O(shè)立參照組，減少因個體差異性所產(chǎn)生的誤差［12-13］。以人類的牙髓組織為研究對象，避免了研究對象的種屬差異性，使實驗結(jié)果更具有臨床意義。

通常在器官培養(yǎng)的過程中都存在有培養(yǎng)液的有效成分不能充分滲入到組織塊中，造成實驗培養(yǎng)周期不長的問題。牙體組織在薄切片的過程中不可避免地會存在機械性損傷和軟硬組織分離的情況，組織片越薄，損傷越明顯。此外，由于牙體組織的硬度值較高，慢速切割機和切割條件的同樣限制了此類實驗方法的應(yīng)用和開展。Téclès等［21］和張金艷等［22］分別建立了人和大鼠全牙器官的體外培養(yǎng)模式，有效避免了在切片過程中對組織形成的機械性損傷，但與培養(yǎng)環(huán)境接觸有限，僅能在體外保持正常組織形態(tài)約1周?，F(xiàn)有的牙切片培養(yǎng)模式大都采用的是牙切片聯(lián)合應(yīng)用Trowel器官培養(yǎng)方法，而Trowel器官培養(yǎng)方法中瓊脂以及乙酸纖維濾膜的平展性均有可能對組織細胞的生長產(chǎn)生影響。牙切片厚度值多少為最佳，才能夠最大程度地延長體外培養(yǎng)時間，并將切片過程中對實驗?zāi)Ｐ捅旧碓斐傻臋C械性損傷降到最低，仍是需要進一步研究的問題。

［1］Magloire H，Joffre A，Bleicher F. An in vitro model of human dental pulp repair［J］. J Dent Res，1996，75（12）：1971-1978.

［2］Sloan AJ，Shelton RM，Hann AC，et al. An in vitro approach for the study of dentinogenesis by organ culture of the dentine-pulp complex from rat incisor teeth［J］. Arch Oral Biol，1998，43（6）：421-430.

［3］朱曉茹，趙守亮，唐榮銀，等. 人牙齒切片器官培養(yǎng)模型的建立［J］. 現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志，2007，21（6）：600-602. Zhu XR，Zhao SL，Tang RY，et al. Establishment of human tooth slice organ culture model in vitro［J］. J Modern Stomatol，2007，21（6）：600-602.

［4］陳穎，王曉春，李昊妍，等. 牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體體外培養(yǎng)模型的建立［J］. 上海交通大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2006，26（11）：1256-1259. Chen Y，Wang XC，Li HY，et al. Establishment of dentine-pulp complex model cultured in vitro［J］. J Shanghai Jiaotong Univ（Med Sci），2006，26（11）：1256-1259.

［5］Niu LN，Sun JQ，Li QH，et al. Intrafibrillar-silicified collagen scaffolds enhance the osteogenic capacity of human dental pulp stem cells［J］. J Dent，2014，42（7）：839-849.

［6］Galler KM，D'Souza RN，Hartgerink JD，et al. Scaffolds for dental pulp tissue engineering［J］. Adv Dent Res，2011，23（3）：333-339.

［7］Sloan AJ，Smith AJ. Stimulation of the dentine-pulp complex of rat incisor teeth by transforming growth factor-beta isoforms 1-3 in vitro［J］. Arch Oral Biol，1999，44（2）：149-156.

［8］Gon?alves SB，Dong Z，Bramante CM，et al. Tooth slice-based models for the study of human dental pulp angiogenesis［J］. J Endod，2007，33（7）：811-814.

［9］Moseley R，Waddington RJ，Sloan AJ，et al. The influence of fluoride exposure on dentin mineralization using an in vitro organ culture model［J］. Calcif Tissue Int，2003，73（5）：470-475.

［10］Murray PE，Lumley PJ，Ross HF，et al. Tooth slice organ culture for cytotoxicity assessment of dental materials［J］. Biomaterials，2000，21（16）：1711-1721.

［11］Saw TY，Cao T，Yap AU，et al. Tooth slice organ culture and established cell line culture models for cytotoxicity assessment of dental materials［J］. Toxicol In Vitro，2005，19（1）：145-154.

［12］張丹，李昊妍，梁景平，等. 黏結(jié)劑直接蓋髓體外實驗研究［J］. 牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2008，18（11）：611-614. Zhang D，Li HY，Liang JP，et al. A histopathological study of direct pulp capping with adhesive systems in vitro［J］. Chin J Conserv Dent，2008，18（11）：611-614.

［13］朱曉茹，張蓉，李玉成，等. 尼莫地平對人牙本質(zhì)形成的影響［J］. 華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2008，26（5）：563-566. Zhu XR，Zhang R，Li YC，et al. Effects of nimodipine on human dentinogenesis［J］. West Chin J Stomatol，2008，26（5）：563-566.

［14］Seux D，Roméas A，Antoine B，et al. In vitro study of a neodynium：yttrium aluminum perovskite laser on human nonexposed pulp after cavity preparation ［J］. Clin Oral Investig，2004，8（3）：145-150.

［15］Brucoli HC，Arita ES，Eduardo CP. In vitro radiographic analysis of Nd：YAG-laser-irradiated dentin［J］. Lasers Med Sci，2005，20（2）：89-94.

［16］Al-Daghreer S，Doschak M，Sloan AJ，et al. Long term effect of low intensity pulsed ultrasound on a human tooth slice organ culture［J］. Arch Oral Biol，2012，57（6）：760-768.

［17］Al-Daghreer S，Doschak M，Sloan AJ，et al. Shortterm effect of low-intensity pulsed ultrasound on an ex-vivo 3-d tooth culture［J］. Ultrasound Med Biol，2013，39（6）：1066-1074.

［18］李昊妍，陳穎，張丹，等. 牙體機械損傷后牙本質(zhì)牙髓組織MMP-2和MMP-9表達變化［J］. 上海交通大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2009，29（5）：504-508. Li HY，Chen Y，Zhang D，et al. Expression of mmp-2 and mmp-9 in dentin-pulp complex after mechanical injury［J］. J Shanghai Jiaotong Univ（Med Sci），2009，29（5）：504-508.

［19］Murray PE，Smith AJ，Garcia-Godoy F，et al. Comparison of operative procedure variables on pulpal viability in an ex vivo model［J］. Int Endod J，2008，41（5）：389-400.

［20］Dhopatkar AA，Sloan AJ，Rock WP，et al. British orthodontic society，chapman prize winner 2003. A novel in vitro culture model to investigate the reaction of the dentine-pulp complex to orthodontic force ［J］. J Orthod，2005，32（2）：122-132.

［21］Téclès O，Laurent P，Aubut V，et al. Human tooth culture： a study model for reparative dentinogenesis and direct pulp capping materials biocompatibility［J］. J Biomed Mater Res Part B Appl Biomater，2008，85（1）：180-187.

［22］張金艷，雷港，于金華，等. 應(yīng)用牙器官培養(yǎng)模型評價粘結(jié)劑的生物相容性［J］. 牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2012，22（7）：395-398. Zhang JY，Lei G，Yu JH，et al. Biocompatibility assessment of two dental bonding agents with a rat tooth organ culture model［J］. Chin J Conserv Dent，2012，22（7）：395-398.

（本文編輯張玉楠）

Advances in establishment and application of tooth slice organ culture model

Liu Fei，He Jingjun.（VIP Medical Center，The Second People's Hospital of Guangdong Province，Guangzhou 510220，China）

R 322.4+1

A

10.7518/gjkq.2016.05.010

2016-01-22；［修回日期］2016-05-09

國家自然科學(xué)基金（81371137）；南方醫(yī)科大學(xué)科研啟動計劃青年科技人員培育項目（PY2014N051）

劉斐，主治醫(yī)師，碩士，Email：kqliufei@126.com

賀京軍，副主任醫(yī)師，學(xué)士，Email：hjjs2@126.com