周代兵　張凌云　許國(guó)雄

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piRNA/PIWI在肝癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制研究進(jìn)展

周代兵張凌云許國(guó)雄

人類全基因組中僅約1%～2%的核苷酸能夠被轉(zhuǎn)錄并翻譯成蛋白質(zhì)，余下98%以上均為非編碼RNA (non-coding RNA，ncRNA)，可在基因水平上發(fā)揮其生物學(xué)功能[1]。在ncRNA中，核苷酸序列長(zhǎng)度小于200bp的稱為短鏈非編碼RNA (short non-coding RNA，sncRNA)，占全部ncRNA的10%～20%[2, 3]，包括PIWI蛋白結(jié)合RNA (PIWI-interacting RNAs， piRNAs)、微小RNA (microRNA，miRNA)、重復(fù)相關(guān)小RNA(repeat associated small interfering RNAs，rasiRNA)以及小干擾RNA (small interference RNA，siRNA)[4]。肝臟惡性腫瘤是常見的消化系統(tǒng)腫瘤，發(fā)生率和死亡率居我國(guó)惡性腫瘤的前五位[5]。盡管2016年美國(guó)癌癥總死亡率下降23%，但肝癌的發(fā)病率和死亡率卻呈上升趨勢(shì)[6]。肝癌的早期篩查與診斷對(duì)肝癌的治療和預(yù)后的改善至關(guān)重要。piRNA可以在分子水平調(diào)控肝癌的發(fā)生發(fā)展，可以為肝癌的早期篩查和靶向治療提供新的思路。

一、piRNA概述

(一)piRNA/PIWI的發(fā)現(xiàn)、結(jié)構(gòu)特征以及生物學(xué)功能2006年，Aravin等[7]利用離心淘析和免疫共沉淀技術(shù)在雄性小鼠睪丸組織分離出一段小RNA。研究發(fā)現(xiàn)，此小RNA主要與Argonaute家族PIWI蛋白成員(Argonaute3、Piwi、Aubergine)[8]相互作用而將其命名為piRNA。PIWI蛋白作為piRNA/PIWI復(fù)合物中的核心組分，結(jié)合其他重要功能分子，在piRNA發(fā)揮生物功能過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[9]。piRNA主要是作為PIWI的“信使”調(diào)控靶基因的穩(wěn)定性表達(dá)、轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后水平的修飾[10]。

piRNA是一類長(zhǎng)約30 nt的單鏈小RNA，5′端含有一個(gè)單磷酸其團(tuán)，并具有強(qiáng)烈的尿嘧啶傾向性，3′端2-OH呈現(xiàn)甲基化[9]。piRNA主要存在于基因間隔區(qū)，具有成簇分布特點(diǎn)，基因區(qū)或重復(fù)序列區(qū)較少見[11, 12]。piRNA以高度特異鏈的方式對(duì)應(yīng)于單鏈基因組位點(diǎn)，正義鏈或反義鏈專一性較好，在生物體內(nèi)表達(dá)具有組織特異性。在果蠅實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，生殖細(xì)胞中piRNA基因在Zucchini核酸酶的參與下，由lncRNA前體加工而來(lái)；轉(zhuǎn)錄成的初級(jí)piRNA穿過(guò)核膜到胞漿后，經(jīng)定位在核周體NUAGE上的Aub和AGO3的核酸內(nèi)切酶Slicer激活PIWI蛋白內(nèi)切酶活性，剪切形成次級(jí)piRNA，并且通過(guò)“乒乓循環(huán)”機(jī)制使細(xì)胞中的piRNA大量擴(kuò)增，最后PIWIL4蛋白結(jié)合piRNA進(jìn)入核內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[13-15]。

研究發(fā)現(xiàn)，piRNA主要存在于老鼠[7]、果蠅[16]、斑馬魚、人等哺乳動(dòng)物體內(nèi)的生殖細(xì)胞和干細(xì)胞中。其中，人類已發(fā)現(xiàn)的PIWI蛋白主要有PIWIL1(HIWI、piwi homology), PIWIL2 (PIWIL1L、CT80、Miwi like、鼠科Mili)，PIWIL3(HIWI3)和PIWIL4 (HIWI2、 MIWI2)四種亞型[17, 18]。piRNA通過(guò)與PIWI蛋白結(jié)合形成piRNA復(fù)合物，識(shí)別并結(jié)合轉(zhuǎn)座子，裂解轉(zhuǎn)座子基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA或沉默胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)座子基因，從而調(diào)控著生殖細(xì)胞自我更新和干細(xì)胞的增殖分化[19]。除此之外，piRNA在表觀遺傳控制、腫瘤發(fā)生發(fā)展以及維系基因的穩(wěn)定性等方面也起著重要作用[12]。

(二)piRNA/PIWI與腫瘤關(guān)系近年來(lái)，短鏈非編碼RNA與實(shí)體腫瘤細(xì)胞增殖分化和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的研究取得很大進(jìn)展，在乳腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌等癌癥中均有大量短鏈非編碼RNA的相關(guān)報(bào)道。自2006年發(fā)現(xiàn)piRNA后，piRNA/PIWI蛋白與癌癥的關(guān)系引起了研究者們的關(guān)注[20]，piRNA作為短鏈非編碼RNA成員之一，主要是通過(guò)PIWI蛋白形成piRNA/PIWI復(fù)合體參與到機(jī)體的生命活動(dòng)中。短鏈非編碼RNA可在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上通過(guò)RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)調(diào)控基因表達(dá)，還可作為“免疫警察”監(jiān)控外源核酸類似物，免遭外來(lái)威脅。Argonaute家族蛋白作為RISC重要成員之一，有三個(gè)重要RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，即PAZ (Piwi/Argonaut/Zwille)、MID(Middle)和Piwi (P-element-induced wimpy testis)結(jié)構(gòu)域，piRNA/PIWI復(fù)合體與RISC PAZ結(jié)構(gòu)域相互作用,結(jié)合到靶mRNA上進(jìn)行剪切或抑制翻譯[21]。

PIWI蛋白缺失后，RNA聚合酶II在染色體區(qū)域富集，導(dǎo)致RNA合成能力增強(qiáng)，促使表觀遺傳發(fā)生改變[9]，包括DNA高度甲基化、組蛋白去乙?；⒁种妻D(zhuǎn)座子激活、染色質(zhì)異構(gòu)化等，這些表觀遺傳學(xué)的改變?cè)谀[瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。例如DNA甲基化可引起癌基因的激活和抑癌基因的沉默，促使腫瘤失控性增生；組蛋白去乙?；蓪?dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控紊亂，DNA損傷修復(fù)受阻；休眠轉(zhuǎn)座子的激活則導(dǎo)致基因失活等。

大量研究發(fā)現(xiàn)，piRNA/PIWI除在正常人體內(nèi)的睪丸和造血干細(xì)胞大量表達(dá)外，在很多腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞株均有異常表達(dá)[22]。例如在胰腺癌[23]、乳腺癌[24]和卵巢癌[25, 26]等腫瘤中，PIWI在腫瘤表達(dá)量越高，惡性程度越大，預(yù)后越差。敲低PIWI基因后，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制、惡性程度降低，暗示了piRNA/PIWI可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用[27]。近年來(lái)，也有研究者將PIWI蛋白作為腫瘤惡性程度和預(yù)后判斷的一個(gè)監(jiān)測(cè)指標(biāo)[28]。

二、piRNA/PIWI與肝癌關(guān)系

肝癌病情進(jìn)展快、療效差、早期易轉(zhuǎn)移，臨床診斷時(shí)多數(shù)患者已處于中晚期，失去了最佳治療時(shí)機(jī)。目前對(duì)肝癌的治療主要是以手術(shù)治療為主，輔以介入、免疫、化療等綜合治療，但總體效果仍不理想。研究發(fā)現(xiàn)，piRNA/PIWI可能與肝癌的增殖[27]、抗凋亡[29]以及侵襲轉(zhuǎn)移[30]等發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

前期研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中存在一種多潛能分化的干細(xì)胞，使得肝癌細(xì)胞具有無(wú)限增殖及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控特性。干細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞的起始細(xì)胞,它具有自我更新分化的能力。PIWIL2作為人PIWI蛋白家族成員之一，在干細(xì)胞分化和腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，肝癌干細(xì)胞這種無(wú)限分化能力很有可能與PIWIL2有關(guān)[31]。PIWIL2過(guò)表達(dá)引起信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3 (Stat3)表達(dá)量增加，通過(guò)Stat3/Bcl-xL和Stat3/CyclinD1兩種途徑，激活Stat3下游靶基因CyclinD1和抗凋亡基因Bcl-xL，導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控紊亂，G1期不斷向S期轉(zhuǎn)換，抑制凋亡；Law等[32]發(fā)現(xiàn)，相比鄰近正常肝臟組織，piRNA piR-Hep1在原發(fā)性肝癌細(xì)胞中上調(diào)46.6%；Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)PIWIL2與piR-Hep1呈現(xiàn)正相關(guān)(r=0.424，P=0.025)；PIWIL2可激活PI3K/AKT信號(hào)通路，使得下游基因AKT過(guò)度磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞增殖；敲低piR-Hep1后，細(xì)胞增殖能力下降，侵襲力減弱。Zhao等[30]也發(fā)現(xiàn)，相比正常肝細(xì)胞L02,在高侵襲性的肝癌細(xì)胞HCCLM3，MHCC97H和MHCC97L中HIWI mRNA及HIWI蛋白表達(dá)增高，組織水平也顯示瘤內(nèi)HIWI表達(dá)量明顯高于臨近正常肝組織，統(tǒng)計(jì)分析顯示HIPI表達(dá)與增殖細(xì)胞核抗原、腫瘤大小以及轉(zhuǎn)移方式正相關(guān)(P<0.05)；敲低HIWI后，細(xì)胞增殖和侵襲能力均明顯下降。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，HIWI高表達(dá)(尤其低甲胎蛋白和病理Edmondson-Steiner分級(jí)為低級(jí)患者)是肝癌患者總生存期和無(wú)復(fù)發(fā)生存期縮短的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與患者的預(yù)后密切相關(guān)。

調(diào)控肝癌生物學(xué)行為的機(jī)制異常復(fù)雜，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間相互作用可影響肝癌的發(fā)生進(jìn)展和預(yù)后，這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)信號(hào)通路、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)信號(hào)通路、核化因子NF-κB信號(hào)通路等。在Baek等[33]構(gòu)建的MT1/TGFα轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α(transforming growth factor -alpha，TGF-α)的過(guò)表達(dá)可使TGF-β失活，并使正常肝細(xì)胞獲得具有惡性肝腫瘤無(wú)限增殖的特性，從而誘變?yōu)楦伟┘?xì)胞。與此同時(shí)，PIWI蛋白可通過(guò)與分子伴侶蛋白如熱休克蛋白90(HSP90)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中TGF-βI型受體，抑制下游的Smad2和Smad3磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞周期素依賴激酶抑制物p21和纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)的表達(dá)下調(diào)，引起細(xì)胞周期調(diào)控紊亂，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖與分化[34]。也有學(xué)者研究認(rèn)為PAI-1可能是通過(guò)Fas/Fas-L介導(dǎo)的凋亡途徑產(chǎn)生抑制效應(yīng)[35]。但是以上兩項(xiàng)研究并沒(méi)有闡明PIWI蛋白在促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖分化中是否受到TGF-β信號(hào)通路的調(diào)控，因此還需進(jìn)一步研究。另外，Ye等發(fā)現(xiàn)PIWI樣蛋白PIWIL2可與NF-κB相互作用，通過(guò)NF-κB信號(hào)通路參與腫瘤細(xì)胞增殖分化[36]。最近也有研究發(fā)現(xiàn)，具有NF-κB1基因多態(tài)性的HCV(Hepatitis C virus)肝病患者罹患肝癌風(fēng)險(xiǎn)明顯高于正常組[37]。同樣PIWI蛋白是否參與NF-κB1基因突變誘導(dǎo)肝癌發(fā)生還需深入研究。

侵襲和轉(zhuǎn)移是肝癌預(yù)后差、復(fù)發(fā)率高的最重要原因。側(cè)重于肝癌的一、二級(jí)預(yù)防可為肝癌的早期診斷和預(yù)防打下基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)早期肝癌生物標(biāo)志物對(duì)于提高肝癌切除率和生存期有重要意義。目前盡管還未見在肝癌患者中檢測(cè)外周血piRNA的相關(guān)報(bào)道，但在胃癌研究中已發(fā)現(xiàn)外周血piR-651和piR-823通過(guò)qRT-PCR方法檢測(cè)出來(lái)，且具有較高的靈敏度和特異性，可作為循環(huán)胃癌細(xì)胞檢測(cè)與診斷的一個(gè)分子標(biāo)志物[38, 39]用于篩查胃癌患者。從這些研究中看出對(duì)于研究肝癌相關(guān)的piRNA作為肝癌發(fā)生發(fā)展的標(biāo)志物具有重要的借鑒意義。

三、總結(jié)與展望

piRNA/PIWI與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如：piRNA-651[39]、piR-Hep1[32]等,但它們與PIWI在肝癌發(fā)生發(fā)展中的具體調(diào)控機(jī)制尚不明了[40]。目前，piRNA通過(guò)Argonaute蛋白家族影響著癌癥的發(fā)生發(fā)展已廣泛地受到研究者的關(guān)注[41]。有研究者根據(jù)Argonaute蛋白家族在癌癥中的作用，對(duì)piRNA/PIWI在肝癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制進(jìn)行了推測(cè)：(1) piRNA/PIWI激活上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子如：Twist1/2和Zeb1/2[42]，使得E-鈣黏著蛋白、波形蛋白等過(guò)表達(dá)，促進(jìn)了肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移；(2) piRNA/PIWI通過(guò)DNA甲基化、組蛋白乙?；缺碛^途徑在轉(zhuǎn)錄水平上抑制轉(zhuǎn)座子表達(dá)，導(dǎo)致基因不穩(wěn)定性增加，雙鏈DNA斷裂后損傷修復(fù)異常，促使肝癌的發(fā)生；(3) piRNA與miRNA均屬于非編碼小RNA成員。miRNA與Argonaute蛋白相互作用以形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)，并結(jié)合到mRNA的互補(bǔ)序列導(dǎo)致mRNA降解，在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用，故而有理由認(rèn)為piRNA與miRNA具有相似的調(diào)控效應(yīng)[43-45]。另外，piRNA還可沉默miRNA 3'-UTR區(qū)的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，削弱miRNA的抑瘤效應(yīng)[46]；(4) piRNA在轉(zhuǎn)錄后水平上通過(guò)Slicer酶切調(diào)控lncRNA的表達(dá)量，導(dǎo)致原癌基因激活或者是抑癌基因滅活，進(jìn)而誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生[46]。

PIWI依賴性piRNA基因生物合成機(jī)制及其在癌癥中作用尚未完全明了。有研究者發(fā)現(xiàn)，機(jī)體內(nèi)還存在一種非PIWI依賴性的piRNA通路參與機(jī)體生物調(diào)控[47]，但其是否參與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為還需進(jìn)一步研究。piRNA/PIWI在肝癌發(fā)生發(fā)展中的具體機(jī)理尚處在初步階段，借助新型高通量測(cè)序技術(shù)及后續(xù)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，將會(huì)發(fā)現(xiàn)更多與肝癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的piRNA，給肝癌治療提供新的方向，并將有可能作為新型分子標(biāo)志物用于肝癌的早期診斷、治療以及預(yù)后判斷。

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(本文編輯：張苗)

201508上海復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室

許國(guó)雄，Email：gboxu@163.com

2016-04-08)