張 哲

(牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心,黑龍江 牡丹江 157011)

?

細(xì)胞存活和生長的檢測方法探討

張 哲

(牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心,黑龍江 牡丹江 157011)

MTT是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。該技術(shù)現(xiàn)已廣泛用于生物和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域?；诖?，針對該法進(jìn)行探討，以期與同行探討，更好地推動生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

MTT法；細(xì)胞；檢測

MTT是一種粉末狀化學(xué)試劑，化學(xué)名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名為噻唑藍(lán)。是一種黃顏色的染料。其用途主要有兩方面，包括藥物(也包括其他處理方式如放射線照射)對體外培養(yǎng)細(xì)胞毒性的測定以及細(xì)胞增殖和細(xì)胞活性測定。該法在生物、醫(yī)藥等研究中具有重要作用[1-2]，鑒于此，以下針對該法進(jìn)行深入探討。

1 檢測原理

活性細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死亡細(xì)胞則無此功能。二甲基亞砜能溶解細(xì)胞中的甲瓚，使用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的數(shù)量值與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測得的吸光度值，來判斷活性細(xì)胞數(shù)量，吸光度值越大，表明細(xì)胞活性越強(qiáng)。若是測藥物毒性，則表示藥物毒性越小。

2 藥品和儀器

MTT 配成的終質(zhì)量濃度為5 mg/mL，須用PBS或生理鹽水做溶劑。在配制和保存的過程中，容器應(yīng)采用鋁箔紙包住，確保其無菌。MTT甲瓚溶解液，二甲基亞砜和三聯(lián)溶解液。酶標(biāo)儀、分光光度計(jì)、倒置顯微鏡。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞計(jì)數(shù)

使用胰酶消化對數(shù)期細(xì)胞，終止后離心收集，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整其濃度。細(xì)胞密度在長到80%至90%，消化離心收集后，將上清液去掉，加入3 mL培養(yǎng)基并混勻。取另一支新的15 mL無菌離心管，裝入培養(yǎng)基。從第一步準(zhǔn)備的3 mL細(xì)胞懸液中取出1 mL，加入上管混勻后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，該濃度相當(dāng)于細(xì)胞計(jì)數(shù)板4個大格內(nèi)，其中每大格平均5～10個細(xì)胞；如果該濃度不夠，應(yīng)再根據(jù)計(jì)數(shù)的結(jié)果滴加細(xì)胞懸液，每滴按50 μL計(jì)算。細(xì)胞數(shù)量因?qū)嶒?yàn)?zāi)康牟煌瑧?yīng)做相應(yīng)調(diào)整，如一般細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔2 000個，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔5 000～10 000個。此外，還應(yīng)根據(jù)細(xì)胞本身特性，如生長快慢等因素來決定細(xì)胞數(shù)量。

2.2 96孔平底板鋪細(xì)胞

制備好細(xì)胞懸液后，輕輕混勻，每孔加入100 μL，確保待測細(xì)胞的密度為5 000～10 000/孔，用無菌PBS填充邊緣孔。因?yàn)榧?xì)胞在混勻后仍要繼續(xù)沉降，所以接種的過程中要反復(fù)多次混勻，例如每加6個孔時就應(yīng)混勻一次，用以確保各孔間接種的細(xì)胞密度完全相同，進(jìn)而保證MTT結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.3 藥物處理

在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)已接種好的細(xì)胞培養(yǎng)板，在孔板底部鋪滿單層細(xì)胞時(96孔平底板)，加入不同濃度梯度的藥物。細(xì)胞貼壁后即可加藥，時間為2 h即可。

2.4 觀察藥效

于培養(yǎng)箱中5% CO2，37 ℃ 孵育16～48 h后，在倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果。

2.5 MTT反應(yīng)

在每孔中加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。如果藥物與MTT能夠反應(yīng)，可在離心后棄去培養(yǎng)液，之后小心用PBS沖2至3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。

2.6 溶解結(jié)晶

終止培養(yǎng)，準(zhǔn)備溶解結(jié)晶。溶解結(jié)晶的方法有兩種，一種方法是使用二甲基亞砜溶解。在MTT加入培養(yǎng)4 h后，可充分形成結(jié)晶。去掉上清液，注意不能把藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚移走。每孔中加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm波長處檢測各孔的吸光值。另一種方法是使用三聯(lián)溶解液，在MTT加入培養(yǎng)4 h后，可充分形成結(jié)晶。直接在每孔中加入100 μL溶解液。因?yàn)樵撊芙庖汉蠸DS，在低溫保存時易產(chǎn)生結(jié)晶，所以在使用之前必須提前幾小時置于室溫中，待SDS結(jié)晶全部溶解后方可使用。放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4～6 h，于鏡下觀察，待結(jié)晶全部溶解后于570 nm波長處測定其吸光度值。

2.7 吸光度測定

應(yīng)同時設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)，對照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，測定各孔吸光度值。

3 結(jié)果統(tǒng)計(jì)方法

采用改良寇式法計(jì)算IC50。

4 總 結(jié)

檢測細(xì)胞生長、存活和增值的方法有很多種，如BrdU標(biāo)記法、結(jié)晶紫法、酸性磷酸酶法等。每種方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，而本研究針對MTT檢測細(xì)胞存活和生長的方法進(jìn)行了深入探討。正確掌握該法并將其應(yīng)用于醫(yī)藥研究和生物醫(yī)學(xué)研究中[3-4]，可以更好地進(jìn)行科學(xué)研究工作，為生物和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展提供可靠的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

[1]ZUPANIC A, BURMAOGLU S, ALGUL O, et al. Synthesis and anti-proliferative activity of fluoro-substituted chalcones[J]. Bioorg Med Chem Lett, 2016, 26(13):3172-3176.

[2]BORGES I P, CASTANHEIRA L E, BARBOSA B F, et al. Anti-parasitic effect on toxoplasma gondii induced by BnSP-7, a Lys49-phospholipase A2 homologue from bothrops pauloensis venom[J]. Toxicon, 2016, 1(119):84-91.

[3]SEEIL D S, DHIVYS S, SELVAMURUGAN N, et al. Guar gum succinate-sodium alginate beads as a pH-sensitive carrier for colon-specific drug delivery[J]. Int J Biol Macromol, 2016, 10(91):45-50.

[4]SADEGHI A R, NOKHASTEH S, MOLAVI A M, et al. Surface modification of electrospun PLGA scaffold with collagen for bioengineered skin substitutes[J]. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl, 2016, 1(66):130-137.

補(bǔ)充鈣(Ca)元素的食療方法

若缺鈣，身有害，大小人，不自在。一歲兒，不能行，再發(fā)展，佝僂病，成年人，體減形，

身無力，腿軟疼，逐漸變，殘廢人，食療法，是先行。其一法：取石膏，加滑石，灶心土，

布包后，放水缸，或水井，水飲用，鈣速增。其二法：取滑石，二十克，海螵蛸，一百克，

經(jīng)炮制，研為末，米湯引，日三次，每十克，半月愈。其三法：石決明，二十克，加蛋殼，

一百克，經(jīng)炮制，研為末，豆?jié){引，日三次，每次服，二十克，一月愈。其四法：取龍骨，

五十克，加黃豆，五百克，經(jīng)炮制，研為末，日三次，骨頭湯，每次服，十五克，半月愈。

其五法：海產(chǎn)品，各種蝦，加小魚，經(jīng)炮制，研為末，或酥脆，經(jīng)常吃，數(shù)日愈。還要忌，

事三件，凡屬于，鉛化物，氧化鉛，氧化鋁，氧化鎘，各種類，數(shù)類藥，要警惕，切勿用。

摘自《頭發(fā)診斷與食物調(diào)節(jié)》

The Detection of Cell Survival and Growth

ZHANG Zhe

(Mudanjiang Medical University, Heilongjiang Mudanjiang 157011, China)

The cell survival and growth could be detected by MTT. The technology is now widely used in biological and medical fields. Based on this, this study was used to detect the efficiency of it, and further the development of biomedical science would be promoted.

MTT; cell; detection

1006-446X(2016)11-0069-03

2016-05-27

張哲(1987—)，男，助理實(shí)驗(yàn)師，學(xué)士，主要從事分子生物學(xué)方向研究。

Q 2.33

A