陳賢華，胡宏波，孫秀娟，劉大鷹，馮金

(柳州市柳鐵中心醫(yī)院檢驗(yàn)科1、病理科2、呼吸內(nèi)科3，廣西 柳州 545007)

Reprimo基因3′非翻譯區(qū)824位點(diǎn)G＞C單核苷酸多態(tài)性與肺癌易感性研究

陳賢華1，胡宏波1，孫秀娟2，劉大鷹3，馮金1

(柳州市柳鐵中心醫(yī)院檢驗(yàn)科1、病理科2、呼吸內(nèi)科3，廣西 柳州 545007)

目的 探討Reprimo基因3′非翻譯區(qū)824位點(diǎn)G＞C單核苷酸多態(tài)性改變與肺癌發(fā)生的關(guān)系。方法基因分型用TaKaRa的MightyAmp DNA聚合酶法，分別檢測(cè)36例肺癌患者(癌癥組)及其癌旁正常組織(對(duì)照組)的Reprimo基因3′非翻譯區(qū)824位點(diǎn)G＞C分布，運(yùn)用χ2檢驗(yàn)和Armitage′s趨勢(shì)檢驗(yàn)等分析其與肺癌發(fā)生的相關(guān)性。結(jié)果兩組標(biāo)本經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)，對(duì)照組在Reprimo基因3′非翻譯區(qū)824位點(diǎn)G＞C基因型觀測(cè)(理論)頻數(shù)為34、1、1(33.06、2.88、0.06)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.042)，癌癥組的基因型觀測(cè)(理論)頻數(shù)為33、1、2(33.17、4.56、0.17)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)；Reprimo基因3′非翻譯區(qū)824位點(diǎn)G＞C單核苷酸多態(tài)性與肺癌易感性的Armitage′s趨勢(shì)檢驗(yàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.31，P=0.581)。結(jié)論對(duì)照組接近符合Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態(tài)，而肺癌組不符合該規(guī)律；Reprimo基因3′非翻譯區(qū)824位點(diǎn)G＞C單核苷酸位點(diǎn)多態(tài)性可能與肺癌發(fā)生不具有相關(guān)性。

肺癌；Reprimo；多態(tài)性；相關(guān)性

癌現(xiàn)在是臨床最常見惡性腫瘤之一。在相同致癌條件下，暴露人群只有一些人會(huì)得肺癌，病因?qū)W研究表明不同個(gè)體對(duì)致癌物的易感性有差異；分子流行病學(xué)研究提示遺傳傾向在大多數(shù)肺癌中可能起到一個(gè)重要作用[1]；Fasching等[2]發(fā)現(xiàn)人群中許多基因都存在遺傳多態(tài)性，并在個(gè)體腫瘤易感性中起重要決定作用。因此，單核苷酸多態(tài)性改變可能導(dǎo)致Reprimo基因3′非翻譯區(qū)824位點(diǎn)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，進(jìn)而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展。本研究旨在探討人群中Reprimo基因3′非翻譯區(qū)824位點(diǎn)G＞C與肺癌易感性之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 36例肺癌患者(肺癌組)和其癌旁正常組織(對(duì)照組)標(biāo)本取自2006-2010年本院和外院手術(shù)切除或纖支鏡取得的肺(癌)組織，質(zhì)地均一，經(jīng)10%中性福爾馬林固定后石蠟包埋，室溫存檔至今；對(duì)照組標(biāo)本為同一患者遠(yuǎn)端配對(duì)正常肺組織(距腫瘤邊界灶≥3 cm)。

1.2 提取DNA方法 選取TaKaRa DEXPAT?試劑。組織切片為5 μm，加入0.3 mlTaKaRa DEXPAT?提取液，恒溫100℃加熱10 min，12 000 rpm，4℃離心10 min形成分層，吸取水層就可以得到PCR擴(kuò)增用DNA。具體操作按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 擴(kuò)增試劑 選取TAKARA試劑MightyAmp DNA Polymerase，擴(kuò)增Reprimo基因，引物由上海生工合成，堿基序列為R1：5′-AGAGGGCGATTAGGGCGC AG-3′；R2：5′-AGAGGGCGATTAGGGCGCAC-3′，R3：5′-AGGAGAAGAGTGGGAGCGC-3，R1R3針對(duì)824位點(diǎn)為G的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物249 bp；R2R3針對(duì)824位點(diǎn)為C的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物249 bp。

1.4 PCR反應(yīng)體系 反應(yīng)體系為25 μl：2×PCR Buffer(MightyAmp DNA Polymerase)12.5 μ l，模板DNA4 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，重蒸水7 μl，酶(5 U/μl)0.5 μl。反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性5 min以后，擴(kuò)增溫度98℃10 s、60℃15 s、68℃60 s循環(huán)，循環(huán)次數(shù)分別為40次，最后68℃延伸4 min；PCR擴(kuò)增目的基因DNA的檢測(cè)：取10 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行2.0%瓊脂糖凝膠電泳。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用χ2檢驗(yàn)評(píng)估病例組和對(duì)照組中各基因型的分布差異，t檢驗(yàn)評(píng)估年齡組差異，所用統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS15.0，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)；哈迪一溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium)檢測(cè)、Armitage′s趨勢(shì)檢驗(yàn)、計(jì)算比值比(OR)及95%可信區(qū)間(CI)，利用在線軟件(http∶//ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/ hwa1.pl)進(jìn)行計(jì)算，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 研究對(duì)象基本資料 肺癌患者36例，其中大細(xì)胞癌組10例，腺癌組9例，鱗癌組7例，小細(xì)胞癌組10例；男性26例，平均年齡(58.81±10.42)歲，女性10例，平均年齡(54.40±9.58)歲，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t= 1.161，P=0.254)。

2.2 Reprimo基因分型 Reprimo基因3′非翻譯區(qū)824G＞C位點(diǎn)各個(gè)基因型在瓊脂糖凝膠電泳顯示的條帶分別為GG：249 bp；CC：249 bp，具體見圖1。

圖1 Reprimo基因3′非翻譯區(qū)824G＞C位點(diǎn)基因型條帶圖譜

2.3 對(duì)照組和肺癌組經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)結(jié)果 各組在Reprimo基因3′非翻譯區(qū)824G＞C位點(diǎn)基因型頻數(shù)(觀測(cè)/理論)GG、GC、CC和Hardy-Weinberg檢驗(yàn)情況見表1，精確檢驗(yàn)(自由度=1)，P≥0.05，判斷其基因分布符合Hardy-Weinberg平衡。

表1 各組標(biāo)本的Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)結(jié)果

2.4 Reprimo基因3′非翻譯區(qū)824位點(diǎn)G＞C單核苷酸多態(tài)性與肺癌易感性的Armitage′s趨勢(shì)檢驗(yàn) 與G等位基因相比，C等位基因的患者肺癌發(fā)病率更低；與GG基因型相比，GC、CC及GC+CC基因型的患者肺癌發(fā)病率明顯降低；Armitage′s趨勢(shì)檢驗(yàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表2 Reprimo基因3′非翻譯區(qū)824位點(diǎn)各基因模型Armitage′s趨勢(shì)檢驗(yàn)

3 討 論

肺癌在國(guó)內(nèi)發(fā)病率及患病絕對(duì)人數(shù)均占全世界的第一位，早期肺癌的5年生存率可達(dá)90%，但由于早期無(wú)特異性癥狀，很難被早期發(fā)現(xiàn)。肺癌早期診治仍是醫(yī)學(xué)界的一個(gè)重大課題。

基因Reprimo是一種胞漿糖蛋白，由109個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為12 kD，位于人類染色體2q23，可由細(xì)胞經(jīng)X線照射后分離出。其作為p53基因的下游靶基因參與抑制細(xì)胞周期，機(jī)理可能是通過(guò)抑制Cdc2/cyclinB1以及Cdc2活性核轉(zhuǎn)位的途徑來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[3]。國(guó)內(nèi)外研究Reprimo基因甲基化與腫瘤關(guān)系的論文很多，認(rèn)為Reprimo基因甲基化與腫瘤發(fā)生、治療方面存在一定的相關(guān)性[4-6]。而Reprimo基因多態(tài)性與腫瘤關(guān)系論述較少，Ye等[7]研究發(fā)現(xiàn)Reprimo基因3′非翻譯區(qū)的824位點(diǎn)存在G＞C多態(tài)性，并用Hardy-weinberg平衡檢驗(yàn)高加索人群，證明該位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布均符合遺傳平衡規(guī)律。Beasley等[8]在研究Reprimo基因3′非翻譯區(qū)824位點(diǎn)G＞C多態(tài)性與大腸癌的關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)健康組和大腸癌組在該位點(diǎn)也符合遺傳平衡規(guī)律，憩室病組不符合此規(guī)律；824位點(diǎn)G＞C多態(tài)性與大腸癌不存在相關(guān)性。

本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌對(duì)照組在Reprimo基因3′非翻譯區(qū)824位點(diǎn)G＞C基因分布不符合Hardy-weinberg平衡(P=0.042)，但其P值很接近0.05，可認(rèn)為其接近符合遺傳平衡規(guī)律；肺癌組不符合該規(guī)律(P=0.003)；但肺癌組中大細(xì)胞癌組、腺癌組、鱗癌組符合該規(guī)律(P＞0.05)，小細(xì)胞癌組不符合該規(guī)律(P＜0.05)；各肺癌組之間的基因型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.949，P=0.429)。不符合遺傳平衡規(guī)律的原因可能是基因發(fā)生突變引起，也可能是基因分型錯(cuò)誤所致，還可能是樣本含量不足。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C等位基因的患者肺癌發(fā)病率低于G等位基因的患者，GC、CC及GC+CC基因型的患者肺癌發(fā)病率比GG基因型的也明顯降低，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；Armitage′s趨勢(shì)檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說(shuō)明Reprimo基因3′非翻譯區(qū)824位點(diǎn)基因改變，肺癌發(fā)生率不呈線性增加的趨勢(shì)。

綜上所述，Reprimo基因3′非翻譯區(qū)824位點(diǎn)G＞C單核苷酸多態(tài)性與肺癌的發(fā)生不具有顯著的相關(guān)性(P＞0.05)。本文不足：本實(shí)驗(yàn)樣本含量有限，而且該位點(diǎn)并不能代表Reprimo基因所有功能性位點(diǎn)，在后續(xù)研究中有必要增加樣本含量和其他位點(diǎn)研究，以期明確Reprimo基因單核苷酸多態(tài)性改變?cè)诜伟┌l(fā)生發(fā)展中的作用。

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Association of Reprimo gene 3′-untranslated region 824 G＞C polymorphism with lung cancer.

CHEN Xian-hua1, HU Hong-bo1,SUN Xiu-juan2,LIU Da-ying3,FENG Jin1.Department of Clinical Laboratory1,Department of Pathology2, Department of Respiratory Medicine3,Liuzhou Municipal Liutie Central Hospital,Liuzhou 545007,Guangxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the relationship between 824 G＞C polymorphism in the 3′-untranslated region of Reprimo gene and lung cancer.MethodsGenotyping was performed by MightyAmp DNA Polymerase(Ta-KaRa)with samples of cancerous tissues(cancer group)and pericarcinous tissues(control group)from 36 lung cancer patients to detect the 824 G＞C polymorphism in the 3′-untranslated region of Reprimo gene.χ2test and Armitage′s trend test were applied to analyze the correlation between 824 G＞C polymorphism and the risk of lung cancer.ResultsAccording to Hardy-Weinberg equilibrium detection,824 G＞C genotype observation(theory)frequency was 34,1,1 (33.06,2.88,0.06)in the control group(with statistically significant difference,P=0.042)and 33,1,2(31.17,4.56,0.17) in the cancer group(with statistically significant difference,P=0.003).Armitage′s trend test revealed no significant correlation between 824 loci G＞C single nucleotide polymorphisms and susceptibility to lung cancer(χ2=0.31,P=0.581).ConclusionThe control group was nearly accord with Hardy-Weinberg genetic equilibrium state,but lung cancer group was not.No association was found between 824 G＞C polymorphism in the 3′-untranslated region of Reprimo gene and lung cancer.

Lung cancer;Reprimo;Polymorphism;Association

R734.2

A

1003—6350（2016）03—0348—03

2015-09-04)

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳計(jì)劃課題(編號(hào)：Z2010138)；廣西壯族自治區(qū)柳州市科學(xué)技術(shù)局技術(shù)研究與開發(fā)計(jì)劃課題(編號(hào)：2011J0302031)

陳賢華。E-mail：chenren200@163.com

doi∶10.3969/j.issn.1003-6350.2016.03.002