吳國志，歐積壯，吳昌新

(海南省農(nóng)墾總醫(yī)院骨二科，海南 ?？?570311)

·論 著·

巴戟天水提取物對間充質(zhì)干細胞成骨分化中OPG/RANKL表達的影響

吳國志，歐積壯，吳昌新

(海南省農(nóng)墾總醫(yī)院骨二科，海南 ?？?570311)

目的 在成骨誘導條件下，探討巴戟天水提取物對骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)中骨保護素(OPG)和核因子κB受體活化因子配體(RANKL)表達的影響。方法取原代大鼠MSCs，行堿性磷酸酶(ALP)和茜素紅染色，確定其成骨分化能力；使用0(對照組)、10 g/L(M1組)及100 g/L(M2組)濃度的巴戟天水提取物處理MSCs細胞，在成骨誘導的條件下干預7 d，收集細胞培養(yǎng)液，并提取細胞的總RNA及總蛋白，采用ELISA法檢測培養(yǎng)液中OPG/RANKL的分泌水平，采用Real-time PCR及Western Blot檢測MSCs的OPG/RANKL基因和蛋白表達水平。結果經(jīng)ALP和茜素紅染色可見MSCs著色明顯。M1處理組和M2處理組OPG/RANKL基因表達水平較對照組上升，分別為(29.0±6.3)%和(60.0±5.4)%；同時M1及M2組細胞培養(yǎng)液中OPG/RANKL的蛋白分泌水平分別較對照組上升(17.0±4.1)%和(39.0±6.4)%；通過Western Blot檢測，M1組及M2組OPG/RANKL的蛋白表達較對照組上升(20.0±4.3)%和(35.0±4.3)%。以上結果經(jīng)統(tǒng)計學分析，其差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結論巴戟天水提取物可以提升MSCs細胞分泌的OPG/RANKL水平，改善骨質(zhì)疏松患者OPG/RANKL比例失衡狀況，這是巴戟天抗骨質(zhì)疏松的主要機制。

巴戟天；水提取物；間充質(zhì)干細胞；骨保護素；核因子κB受體活化因子配體；骨質(zhì)疏松

原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥(OP)是以骨量減少、骨的微觀結構退化、骨的脆性增加以及容易發(fā)生骨折為特征的一種全身性骨骼疾病，多發(fā)生于65歲老年人以及絕經(jīng)后的婦女[1-2]。我國是世界上擁有OP患者最多的國家，約有9 000萬患者，占總人口的7%。骨質(zhì)疏松癥患者更容易發(fā)生股骨頸骨折、肱骨近端骨折及脊柱壓縮性骨折，骨折給患者帶來痛苦和困擾，并帶來巨大社會經(jīng)濟負擔[3]。在骨代謝的過程中，正常的骨重建是破骨細胞和成骨細胞兩種細胞在骨代謝中達到舊骨吸收與新骨形成之間的動態(tài)平衡的過程，這種平衡被打破是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的重要原因。近來的研究發(fā)現(xiàn)OPG/RANKL細胞因子系統(tǒng)在骨重建過程中發(fā)揮著至關重要的作用[4]。前期有學者研究發(fā)現(xiàn)：巴戟天醇提取物對原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥有明顯的防治作用，然而巴戟天水提取物的作用以及對OPG/RANKL系統(tǒng)的影響尚不明確。本研究旨在通過實驗手段，探討巴戟天水提取物促進間充質(zhì)干細胞的成骨分化的具體機制是否與OPG/RANKL系統(tǒng)有關。

1 材料與方法

1.1 主要的試劑和儀器 巴戟天水提取物(西安潤澤生物科技公司，中國)；F12-DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國)；胎牛血清(Gibco，美國)；Trizol試劑盒，逆轉錄試劑盒(Invitrogen，美國)；堿性磷酸酶染色試劑盒(碧云天，中國)；成骨誘導培養(yǎng)基、茜素紅染液(Cyagen，中國)；SYBRGreen染料(Fermentas，美國)；胰蛋白酶、OPG及RANKL Elisa試劑盒(博士德，中國)；兔抗OPG、RANKL多克隆抗體(Abcam，美國)；5%二氧化碳培養(yǎng)箱(ThermoForma，美國)；臺式水平離心機(Heal Force，中國)；實時定量聚合酶鏈式反應儀(BIO-RAD，美國)。

1.2 實驗動物 8周齡雄性SD大鼠30只，由海南醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.3 大鼠間充質(zhì)細胞(MSCs)的分離和培養(yǎng) 取8周齡SD大鼠，脫頸處死后使用75%酒精浸泡20 min，取出股骨并去除周圍軟組織，使用充滿F12-DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)的10 ml注射器沖洗骨髓至骨髓發(fā)白，吹打成細胞懸液，1 500 r/min，離心半徑6 cm，離心5 min，收集有核細胞，調(diào)整細胞濃度至5×105/ml，接種于細胞培養(yǎng)瓶，并置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d換液一次，當細胞生長至鋪滿瓶底70%～80%時，使用0.25%的胰酶消化，按照1∶3的比例進行傳代，取第3代細胞進行實驗。

1.4 MSCs成骨分化的鑒定 使用第三代的細胞，0.25%的胰酶消化后，細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度至5×105/ml，接種至24孔板培養(yǎng)，使用成骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d和28 d。分別行ALP染色和茜素紅染色。ALP染色方法按照碧云天ALP染色試劑盒所述方法實施，茜素紅染色使用Cyagen成骨誘導培養(yǎng)基附贈之茜素紅染液，按照Cyagen的染色說明進行染色。

1.5 實驗分組及處理 按照5×105/ml的密度，接種MSCs于6孔板，待細胞長滿后，分為三組：0 g/L巴戟天水提取物(空白對照組，C組)，10 g/L巴戟天水提取物(M1組)，100 g/L巴戟天水提取物(M2組)，干預7 d，收集細胞及細胞培養(yǎng)基。

1.6 熒光定量PCR檢測基因的表達 使用Trizol試劑提取各組細胞的總RNA：每孔加1 ml Trizol進行裂解，隨后加入200 μl氯仿，劇烈混勻，12 000×g離心15 min；吸取上層水相400 μl，加入等體積異丙醇，12 000×g離心10 min，棄上清；使用75%乙醇7 500×g離心5 min進行洗滌，然后加入50 μl DEPC水。按照Invitrogen說明書的方法將總RNA逆轉錄形成cDNA，使用用美國BIO-RAD公司實時定量PCR儀進行PCR擴增，檢測OPG及RANKL的基因表達；PCR反應體系(20μl)，反應條件：95℃，3 min變性；95℃，30 s，62℃，40 s，共40個循環(huán)。讀取各基因的Ct值，采用2-△△CT方法進行相對定量分析。實驗結果均重復3次。

1.7 ELISA法檢測細胞上清中蛋白的表達 按照博士德OPG及RANKL ELISA試劑盒的說明，檢測細胞培養(yǎng)上清中OPG及RANKL的蛋白濃度，每個樣本設三個復孔。

1.8 總蛋白提取及Western Blot檢測 收獲細胞，提取總蛋白(參照博士德蛋白抽提試劑盒)。按照1∶4比例加入上樣緩沖液，混勻后置于100℃水浴5 min，使蛋白變性。上樣蛋白量為20 μg，使用垂直電泳進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜，使用5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入一抗并4℃過夜，TBST漂洗3次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫放置1 h，TBST再洗滌3次，使用谷歌生物公司ECL顯影液進行顯影，暗室內(nèi)曝光。

1.9 統(tǒng)計學方法 應用SPSS13統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用one-way ANOVO中的Dunnet t法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 間充質(zhì)干細胞的成骨分化鑒定 堿性磷酸酶和鈣結節(jié)分別為成骨分化的早期和晚期指標，可分別使用ALP和茜素紅染色鑒定。如圖1所示，ALP染色主要著色在細胞膜，呈紫色；茜素紅染色主要在鈣沉積部位呈紅色。

圖1 MSC成骨誘導7 d后ALP染色和茜素紅染色結果

2.2 基因表達的測定 熒光定量PCR檢測各實驗組OPG和RANKL mRNA的表達，如圖2所示，M1組及M2組OPG和RANKL基因表達水平經(jīng)計算后以OPG/RANKL的形式與對照組進行比較，分別較對照組上升(29.0±6.3)%和(60.0±5.4)%，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。這樣的結果表明巴戟天的水提取物可以促進成骨細胞OPG mRNA的表達和抑制RANKL的表達，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。

圖2 MSC成骨誘導7 d OPG和RANKL基因的表達

2.3 蛋白水平的測定 ELISA法檢測細胞上清中分泌蛋白的表達，計算M1組、M2組及對照組細胞培養(yǎng)的上清中OPG、RANKL水平，OPG/RANKL的比值對照組為(1.01±0.02)，M1組為(1.17±0.06)，M2組為(1.39±0.08)。M1組和M2組分別較對照組上升(17.0±4.1)%和(39.0±6.4)%。Western Blot結果如圖3所示，可見GAPDH、OPG和RANKL的蛋白條帶，利用Image proplus進行灰度分析，所得的灰度值與GAPDH進行標準化后再計算OPG/RANKL的比值，M1組和M2組分別與對照組比較，OPG/RANKL蛋白水平分別上升了(20.0±4.3)%和(35.0±4.3)%。

圖3 MSC成骨誘導7 d OPG和RANKL蛋白的表達

3 討 論

已有文獻報道，巴戟天的提取物和含藥血清均能促進成骨細胞的增殖、分泌ALP與骨鈣素、增加成骨細胞的礦化，其中巴戟天水提取物可促進轉化生長因子β1mRNA的表達[5-6]，但巴戟天對骨髓間充質(zhì)干細胞的作用卻報道較少。本研究表明，巴戟天水提取物能影響MSCs細胞分泌OPG/RANKL的水平，從基因水平和蛋白水平都得到很好的驗證。巴戟天水提取物能促使MSCs分泌OPG升高，RANKL相對下降，OPG/ RANKL比值增高。這些結果表明巴戟天水提取物能改善骨質(zhì)疏松患者OPG/RANKL比例失衡狀況，OC的數(shù)量和活性降低，從而改變骨質(zhì)疏松的發(fā)展，減少老年患者骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)生的概率。

骨髓間充質(zhì)干細胞在體外可表現(xiàn)為多向分化潛能，特別是在成骨分化中得到了廣泛的應用。MSCs的成骨和成脂分化能力失衡也成為骨質(zhì)疏松的一個重要原因，最近的研究表明MSCs還通過直接接觸和旁分泌的形式影響破骨細胞的分化和功能，從而改變骨代謝[7]。OPG/RANKL是近年來研究發(fā)現(xiàn)的骨代謝重要通路之一，OPG/RANKL均可由MSCs分泌。許多細胞因子、激素等均直接或間接影響成骨細胞(OB)、破骨細胞(OC)的成熟、分化。RANKL是TNF超家族成員之一，主要由成骨細胞及間充質(zhì)干細胞分泌，RANKL可與破骨前體細胞膜受體RANK結合，刺激破骨前體細胞分化并可以使成熟的破骨細胞活化，增強其骨吸收能力[8]。骨保護素(OPG)屬于TNF受體超家族。OPG與膜受體RANK競爭性結合RANKL，阻斷RANKL與破骨細胞系細胞表面的RANK結合，從而抑制骨吸收[9]。OPG/RANKL比率的改變可以直接影響破骨細胞的發(fā)育，當比率上升時OC的數(shù)量和活性降低?？傊５墓侵亟ê凸橇康姆€(wěn)定依賴于OPG和RANKL的平衡。

原發(fā)性骨質(zhì)疏松分為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松和老年性骨質(zhì)疏松，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者主要是由于絕經(jīng)后雌激素分泌減少，Eghbali-Fatourechi等[10]發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后婦女體內(nèi)骨髓基質(zhì)細胞RANKL表達增高，且與雌激素水平呈負相關，雌激素缺乏時，抗骨吸收的因子如TGF-β合成減少，引起OPG基因表達下降；老年性骨質(zhì)疏松患者，隨著年齡的增加存活的成骨細胞逐漸減少以及ROS系統(tǒng)激活導致成骨細胞核骨髓基質(zhì)細胞分泌的RANKL增加、OPG表達下降。這些均造成OPG/RANKL比例失衡，成為原發(fā)性骨質(zhì)疏松的主要機制[11-13]。

同時本研究也有一些局限性。巴戟天水提取物激動后細胞內(nèi)相關的信號通路的變化我們并沒有關注，間充質(zhì)干細胞對破骨細胞的直接影響未得到驗證。但由于OPG/RANKL系統(tǒng)在骨質(zhì)疏松中的重要作用，我們的研究也有著一定骨科基礎和臨床意義。

綜上所述，我們能得出這樣的結論，巴戟天水提取物通過增加MSCs細胞分泌的OPG/RANKL水平來間接影響骨髓微環(huán)境中破骨細胞的生成，改善骨質(zhì)疏松患者OPG/RANKL比例失衡狀況，從而達到治療原發(fā)骨質(zhì)疏松的目的。

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Effect of Morinda Root aqueous extract on the expression of OPG/RANKL in mesenchymal stem cells.

WU Guo-zhi,OU Ji-zhuang,WU Chang-xin.Department of Orthopedics,Hainan Provincial Nongken General Hospital,Haikou 570311,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of Morinda Root aqueous extract on the expression of osteoprotegerin/receptor activator of nuclear factor Kappa B ligand(OPG/RANKL)in mesenchymal stem cells(MSCs)under osteogenic induction.MethodsThe primary cultured rat MSCs was stained by alkaline phosphatase(ALP)and alizarin red to identify the osteogenic differentiation ability.MSCs were cultured in the medium containing 0(control group),10 g/L(M1 group)and 100 g/L(M2 group)Morinda Root aqueous extract for seven days.Culture supernatant and cells were collected,and total RNA and total protein were extracted.The secretion level of OPG/RANKL was detected by using ELISA,and the expression levels of OPG/RANKL gene and protein were detected by Real-time PCR and Western Blot.ResultsMSCs were stained after treatment with ALP and alizarin red.Compared with the control group, the mRNA expression of OPG/RANKL in M1 group and M2 group were increased by(29.0±6.3)%and(60.0±5.4)%, and the secretion level of OPG/RANKL protein in cell culture fluid were increased by(17.0±4.1)%and(39.0±6.4)%. Western Blot showed the protein expression of OPG/RANKL were increased by(20.0±4.3)%and(35.0±4.3)%.These differences were all statistically significant(P＜0.05).ConclusionMorinda Root aqueous extract can up-regulate the expression of OPG/RANKL in MSCs,and improve the imbalance of RANKL/OPG in patients with osteoporosis,which is the main mechanism of Morinda officinalis in treatment of osteoporosis.

Morinda Root;Aqueous extract;Mesenchymal stem cells(MSCs);Osteoprotegerin(OPG);Receptor activator of nuclear factor Kappa B ligand(RANKL);Osteoporosis

R-332

A

1003—6350（2016）03—0345—04

2015-10-18)

海南省衛(wèi)計委普通科研項目(編號：14A200077)

吳國志。E-mail：wuguozhi0898@163.com