焦建華，陳海姣，孫怡燕，沈衛(wèi)東

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬江陰醫(yī)院消化科，江蘇 江陰 214400)

自擬活血化瘀方抑制大鼠非酒精性脂肪肝進(jìn)展的研究

焦建華，陳海姣，孫怡燕，沈衛(wèi)東

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬江陰醫(yī)院消化科，江蘇 江陰 214400)

目的觀察自擬活血化瘀中藥方抑制缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)對(duì)大鼠非酒精性脂肪肝進(jìn)展的影響。方法將48只大鼠按隨機(jī)分層抽樣法分為正常組(8只)、模型組(8只)和處理組(32只)，正常組予以基礎(chǔ)飼料飲食，模型組及處理組予以高脂飲食建立大鼠脂肪肝模型，其中處理組每日予以自擬中藥活血化瘀方灌胃兩次，模型組給于同量生理鹽水灌胃，正常組及模型組在實(shí)驗(yàn)第16周留取大鼠血清及肝組織，并進(jìn)行血脂、肝功能指標(biāo)檢測(cè)及病理組織檢查，處理組分別在干預(yù)后第4周、8周、12周、16周按隨機(jī)抽樣法分別留取8只大鼠血清及肝組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。運(yùn)用Realtime-PCR法檢測(cè)不同組大鼠肝組織中HIF-1α、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARα)及核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的mRNA表達(dá)差異。結(jié)果正常組無(wú)肝臟脂肪變性及纖維化發(fā)生。處理組在干預(yù)8周后，大鼠肝臟脂肪變分期指數(shù)為(1.58±0.14)，炎癥分級(jí)指數(shù)為(0.69±0.38)，與模型組的(2.28±0.34)和(1.36±0.44)比較均明顯好轉(zhuǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；處理組HIF-1α表達(dá)與模型組相比亦得到顯著抑制[(0.892±0.068)vs (1.413±0.139)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在干預(yù)12周后，處理組大鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、三酰甘油(TG)水平分別為(75.17±20.54)U/L、(0.59±0.29)mmol/L，較模型組的(103.17±18.76)U/L、(1.11±0.18)mmol/L明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；大鼠肝臟纖維化程度分級(jí)指數(shù)(0.69±0.31)較模型組(1.76±0.84)也顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；同時(shí)PPARα的mRNA表達(dá)較模型組顯著上升[(1.875±0.187)vs(1.429±0.132)]，而NF-κB的mRNA表達(dá)則顯著下降[(0.983±0.089)vs(1.139±0.079)]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論自擬活血化瘀方能明顯延緩實(shí)驗(yàn)性脂肪肝大鼠的進(jìn)展，其機(jī)制可能與抑制HIF-1α信號(hào)有關(guān)。

活血化瘀湯；缺氧誘導(dǎo)因子-1α；非酒精性脂肪肝；進(jìn)展

非酒精性脂肪肝病(nonacoholic fatty liver disease,NAFLD)的發(fā)病率日益升高，目前已成為嚴(yán)重危害人們的健康疾病之一[1]，主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞脂肪變性和脂肪沉積，臨床過(guò)程主要包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化以及肝硬化。肝細(xì)胞中缺氧會(huì)導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)因子HIF表達(dá)上升，進(jìn)一步加劇肝損傷[2]，相關(guān)研究在酒精性脂肪肝研究中已經(jīng)證實(shí)，但在非酒精性脂肪肝中研究尚少。肝細(xì)胞中的脂肪沉積會(huì)使肝細(xì)胞腫脹，并進(jìn)一步導(dǎo)致肝細(xì)胞缺氧，從而加重脂肪肝的進(jìn)展。本研究筆者擬探討自擬活血化瘀湯能否通過(guò)抑制HIF-1α信號(hào)并延緩非酒精性脂肪肝進(jìn)展。

1 材料與方法

1.1 中藥活血化瘀方組成 桃仁20 g，紅花20 g，郁金20 g，川芎15 g，當(dāng)歸15 g，白芍12 g，三棱10 g，牡丹皮10 g，枳殼12 g。水煎制成湯劑。

1.2 造模及分組 實(shí)驗(yàn)用48只SD大鼠均購(gòu)自南通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。在飼養(yǎng)1周后用隨機(jī)分層抽樣法分為正常組(8只)、模型組(肌注生理鹽水干預(yù)，8只)與處理組(32只，活血化瘀方湯劑灌胃)。正常組給予基礎(chǔ)飼料,模型組給予高脂飲食(配方為：基礎(chǔ)飼料87.8%、膽固醇2%、膽鹽0.2%、豬油10%)。處理組在高脂飲食的基礎(chǔ)上，每日兩次給予活血化瘀方湯劑灌胃，模型組予以等量生理鹽水灌胃。正常組及模型組在實(shí)驗(yàn)第12周，以氯胺酮麻醉大鼠后進(jìn)行靜脈采血，并切取肝臟右葉約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小組織放置于甲醛固定液中，再進(jìn)行石蠟切片,剩余肝臟組織儲(chǔ)存于液氮罐中保存?zhèn)溆谩Ｌ幚斫M分別在干預(yù)后第4周、第8周、第12周、第16周按隨機(jī)抽樣法分別處理8只大鼠，并留取血清及肝組織標(biāo)本。

1.3 組織病理觀察 將肝組織行HE染色后在顯微鏡下觀察。肝組織脂肪變程度(F)按低倍鏡下視野內(nèi)脂肪變肝細(xì)胞占全部肝細(xì)胞的范圍分級(jí)(F0～3)：F0，無(wú)脂肪變；Fl，33%以下肝細(xì)胞脂肪變；F2，33%～66%肝細(xì)胞脂肪變；F3，66%以上肝細(xì)胞脂肪變。

1.4 肝細(xì)胞炎癥分級(jí)和纖維化程度觀察 參照改良的Brunt標(biāo)準(zhǔn)[8]。炎癥程度分為0～3級(jí)：0級(jí)為正常；1級(jí)表現(xiàn)為腺泡呈現(xiàn)少數(shù)氣球樣，散在個(gè)別點(diǎn)灶狀壞死；2級(jí)表現(xiàn)為腺泡明顯氣球樣肝細(xì)胞，腺泡內(nèi)點(diǎn)灶狀壞死增多，門管區(qū)輕、中度炎癥；3級(jí)表現(xiàn)為腺泡廣泛氣球樣肝細(xì)胞，腺泡內(nèi)點(diǎn)灶狀壞死明顯，門脈管區(qū)輕、中度炎癥伴(或不伴)門脈管區(qū)周圍出現(xiàn)炎癥。纖維化程度分期分為0～4期：0期，正常；1期為少量的細(xì)胞周圍或竇周纖維化，2期為局灶或廣泛的門靜脈周圍纖維化，3期表現(xiàn)為局灶或廣泛的橋接纖維化，4期為肝硬化表現(xiàn)。

1.5 血清指標(biāo)測(cè)定 將留取血液標(biāo)本進(jìn)行10 min離心，取上清后通過(guò)運(yùn)用自動(dòng)生化學(xué)分析儀進(jìn)行檢測(cè)，指標(biāo)包括天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、三酰甘油(triglyceride，TG)、膽固醇(cholesterol，CHOL)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、血糖(glucose，GLU)[3]。

1.6 檢測(cè)不同組大鼠肝組織中HIF-1α、PPARα、NF-κB mRNA表達(dá) 運(yùn)用TRIzol法提取肝臟組織中總RNA。在將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后配制反應(yīng)體系，置入7900HT熒光定量PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增和熒光定量(擴(kuò)增條件為：95℃1 min；95℃15 s，60℃60 s，40個(gè)循環(huán)；再60℃15 s，最后95℃15 s)。熒光定量數(shù)據(jù)分析采用參照基因的△Ct法計(jì)算每個(gè)樣本目的基因的表達(dá)值(△Ct值表示基因反應(yīng)產(chǎn)物的熒光值達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)的反應(yīng)循環(huán)數(shù))。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用整數(shù)表示，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠非酒精性脂肪肝模型建立及結(jié)果 正常大鼠肝組織細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、結(jié)構(gòu)完整；高脂飲食喂養(yǎng)大鼠后第4周、第8周、第12周可分別形成輕度、中度、重度脂肪肝，喂養(yǎng)第16周后形成明顯脂肪性肝炎；在自擬活血化瘀方治療組，各時(shí)間點(diǎn)大鼠肝組織脂肪變性程度較模型組明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及壞死灶明顯減少。在連續(xù)給予活血化瘀湯灌胃8周后，大鼠肝臟脂肪變較模型組亦明顯減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.58，P＜0.05)，炎癥程度也明顯好轉(zhuǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.79，P＜0.05)；活血化瘀湯灌胃12周后大鼠肝臟纖維化程度較模型組也顯著下降(t=7.86，P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠脂肪變性程度分級(jí)、炎癥分級(jí)及纖維化分期(±s)

表1 各組大鼠脂肪變性程度分級(jí)、炎癥分級(jí)及纖維化分期(±s)

注：與模型組比較，aP＜0.05。

組別模型組16周3.00±0.00 3.00±0.00 2.45±0.59 3.00±0.00 2.17±0.24a2.05±0.43a0 0 4周1.24±0.34處理組變性脂肪變炎癥纖維化脂肪變炎癥纖維化1.13±0.25 0 0 8周2.28±0.34 1.36±0.44 0 1.58±0.14a0.69±0.38a0 12周3.00±0.00 2.50±0.24 1.76±0.84 2.16±0.17a1.39±0.29a0.69±0.31a

2.2 不同組大鼠脂肪肝組織中HIF-1α、PPARα、NF-κB的mRNA表達(dá)差異 運(yùn)用Realtime-PCR檢測(cè)肝臟組織中HIF-1α、PPARα、NF-κB的mRNA表達(dá)水平(引物序列見(jiàn)表2)。在給予自擬活血化瘀湯灌胃干預(yù)4周后，大鼠肝臟中HIF-1α mRNA表達(dá)抑制并不明顯，而在連續(xù)灌胃給藥8周后，HIF-1α mRNA表達(dá)得到顯著抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.38，P＜0.05)；在連續(xù)給藥12周及16周后，NF-κB mRNA的表達(dá)則顯著下降(t=8.82，P＜0.05；t=7.93，P＜0.05)，而PPARα mRNA的表達(dá)顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.87，P＜0.05；t=10.16，P＜0.05)，見(jiàn)圖1。

表2 熒光定量PCR引物序列表

圖1 HIF-1α、PPARα、NF-κB在不同程度脂肪肝組織中的mRNA表達(dá)

2.3 不同程度脂肪肝大鼠的肝功能及血脂、血糖水平 與模型組相比，活血化瘀湯治療組在連續(xù)給藥12周后，大鼠血清ALT、TG水平明顯下降(t=8.89、9.98，P＜0.05)；但GLU、HDL-C及CHOL較模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，藥物干預(yù)沒(méi)有明顯改善作用，見(jiàn)表3。

表3 不同組各時(shí)間點(diǎn)大鼠肝功能及血脂水平(±s)

表3 不同組各時(shí)間點(diǎn)大鼠肝功能及血脂水平(±s)

注：與模型組比較，aP＜0.05。

組別正常組模型組CHOL(mmol/L) 0.39±0.18 0.44±0.19 0.48±0.27 2.61±0.87 2.89±0.69 0.46±0.19 0.38±0.16 2.49±0.67 2.68±0.35時(shí)間治療組4周8周12周16周4周8周12周16周ALT(U/L) 73.50±11.25 93.50±10.65 92.00±19.06 103.17±18.76 92.13±20.18 77.00±14.13 106.50±18.98 75.17±20.54a58.50±19.87aGLU(mmol/L) 8.50±1.24 8.90±1.35 8.59±2.01 9.20±3.35 9.52±1.54 9.09±1.37 8.12±2.01 8.55±1.84 10.16±2.18 TG(mmol/L) 0.75±0.59 0.94±0.51 0.67±0.38 1.11±0.18 1.66±0.32 0.78±0.15 0.63±0.37 0.59±0.29a0.83±0.61aHDL-C(mmol/L) 2.15±0.29 2.4±1.02 2.00±0.68 0.61±0.18a0.56±0.25a2.25±0.65 1.77±0.76 0.65±0.36 0.49±0.39

3 討 論

NAFLD與肥胖、高血脂、糖尿病等多種代謝性疾病密切相關(guān)，長(zhǎng)期的NAFLD可引起肝纖維化甚至肝硬化，從而產(chǎn)生嚴(yán)重并發(fā)癥。在NAFLD疾病演變過(guò)程中，肝細(xì)胞在脂肪沉積后導(dǎo)致肝細(xì)胞腫脹，并會(huì)進(jìn)一步引起肝竇變形及微循環(huán)障礙，血流變慢，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞缺血缺氧[4]，更易在氧化應(yīng)激狀態(tài)下發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致肝細(xì)胞的進(jìn)一步損傷。在酒精性脂肪肝中研究表明，缺氧會(huì)誘導(dǎo)肝細(xì)胞HIF-1α表達(dá)上調(diào)，并參與調(diào)控下游基因，進(jìn)一步促進(jìn)NAFLD進(jìn)展為脂肪性肝炎、肝纖維化甚至肝硬化[5]。

中醫(yī)觀點(diǎn)認(rèn)為，NAFLD與外感濕熱疫毒、飲食不節(jié)、情志失調(diào)等關(guān)系非常密切。肝郁脾虛是NAFLD早期的主要病機(jī)，長(zhǎng)時(shí)間缺乏運(yùn)動(dòng)、飲食失調(diào)等均會(huì)導(dǎo)致脾胃內(nèi)傷，脾失健運(yùn)，水濕內(nèi)停，聚生痰濁，痰、瘀則與肝纖維化的進(jìn)展關(guān)系密切。NAFLD早期多表現(xiàn)為肝郁脾虛，而后期血瘀證愈加突出[6]。隨著疾病進(jìn)展，NAFLD會(huì)產(chǎn)生濕濁內(nèi)阻，氣滯血瘀，痰瘀互結(jié)于肝而導(dǎo)致痹阻脈絡(luò)，引起肝纖維化甚至肝硬化。

中醫(yī)活血祛瘀療法是改善機(jī)體缺血缺氧并促進(jìn)血液循環(huán)的有效方法，但在治療NAFLD中研究尚少，機(jī)制也尚不明確。本活血化瘀方劑中三棱、川芎、自芍、郁金、桃仁、紅花均為活血祛瘀之藥。川芎為血中氣藥，活血之力強(qiáng)。當(dāng)歸補(bǔ)血活血，自芍具有斂陰、解痙緩急止痛功效；三棱破血行氣，配合枳殼理氣；牡丹皮瀉血中伏火，散熱壅血瘀；梔子清氣分之熱。本方藥物具有改善血液動(dòng)力、降低血液粘聚，改善肝臟血液微循環(huán)的功效[7]。本研究結(jié)果表明，在連續(xù)給予活血化瘀湯4周時(shí)，大鼠脂肪肝的嚴(yán)重程度并未有明顯減輕，但在連續(xù)給藥8周后，脂肪肝程度明顯減輕。同時(shí)在給藥12周后，脂肪性肝炎及纖維化程度也得到明顯抑制，同時(shí)AST、TG也有顯著好轉(zhuǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)用活血化瘀方第8周，大鼠肝臟中HIF-1α表達(dá)亦顯著下降，到第12周后，PPARα的表達(dá)的表達(dá)顯著上升，同時(shí)NF-κB表達(dá)顯著下降。NF-κB可調(diào)節(jié)多種炎癥因子，如TNFα、IL-1、IL-6，單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)等，導(dǎo)致肝細(xì)胞炎癥發(fā)生，并參與脂肪性肝炎的形成[8]。NF-κB信號(hào)與肝纖維化關(guān)系密切，可誘導(dǎo)肝細(xì)胞纖維化相關(guān)的因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、纖溶酶原激活物抑制因子-1等表達(dá)明顯上升，從而促進(jìn)膠原沉積及新生血管形成，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生[8]。因此，本研究中自擬的活血化瘀方能抑制NAFLD進(jìn)展，其機(jī)制可能與抑制HIF-1α的表達(dá)，并通過(guò)上調(diào)PPARα表達(dá)從而下調(diào)NF-κB信號(hào)，減少脂肪性肝炎、肝纖維化的發(fā)生。

總之，HIF-1α信號(hào)在NAFLD進(jìn)展中起著重要作用，并且與PPARα/NF-κB信號(hào)有關(guān)?；钛龇侥芤种艸IF-1α能延緩NAFLD的進(jìn)展，減少NASH及肝纖維化的發(fā)生。

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Effect of huoxue huayu tang on the progress of NAFLD targeting on HIF-1α in rats.

JIAO Jian-hua,CHEN Hai-jiao,SUN Yi-yan,SHEN Wei-dong,Department of Gastroenterology,the Affiliated Jiangyin Hospital of Medical College of Southeast University,Wuxi 214400,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo observe the effect of huoxue huayu tang on the progress of nonalcoholic fatty liver disease(NAFLD)targeting on hypoxia-induced factor 1α(HIF-1α)in rats.MethodsA total of 48 rats were randomly divided into the normal group(n=8),model group(n=8)and treatment group(n=32)according to random stratified sam-pling method.The rats in the normal group were fed with normal basic diet,and the rats in model group and treatment group were fed with high fat diet to establish the rat model of fatty liver.The rats of the treatment group were treated with huoxue huayu tang,and the rats of the model group were treated with the same amount of normal saline,with intragastric administration twice a day.The serum and liver tissues were collected from the normal group and the model group at the 16thweek of the experiment for blood lipids,liver function test and histopathological examination.In the treatment group,specimens of serum and liver tissue of 8 rats,which were randomly selected according to random sampling method,were respectively collected at the 4thweek,8thweek,12thweek and 16thweek after the intervention for further test.The serum biochemical parameters and fiver histological examinations were observed,and the HIF-1α,nuclear factor-κB(NF-κB)and peroxisome proliferator-activated receptor-α(PPARα)mRNA of liver tissue were detected with Realtime-PCR.ResultsThere was no hepatic steatosis and fibrosis in the normal group.After 8 weeks of intervention,the liver steatosis index and inflammation grade index of the treatment group were(1.58±0.14)and(0.69±0.38), which were significantly improved compared with(2.28±0.34)and(1.36±0.44)of the model group(P＜0.05).The expression of HIF-1α in the treatment group was(0.892±0.068),which was significantly inhibited compared with (1.413±0.139)in the model group(P＜0.05).After 12 weeks of intervention,the levels of alanine aminotransferase (ALT)and triglyceride(TG)in the treatment group were(75.17±20.54)U/L and(0.59±0.29)mmol/L,which were significantly decreased compared with(103.17±18.76)U/L and(1.11±0.18)mmol/L in the model group(P＜0.05).The degree of fibrosis was(0.69±0.31),which also significantly decreased compared with(1.76±0.84)in model group(P＜0.05).The PPAR-α mRNA expression in the treatment group was(1.875±0.187),which was significantly higher than (1.413±0.139)in the model group(P＜0.05),and the NF-κB mRNA expression in treatment group was(0.983±0.089), which was significantly lower than(1.139±0.079)in model group(P＜0.05).ConclusionThese results indicate that huoxue huayu tang can effectively delay the progression of NAFLD in rats,and the mechanism may be related to inhibition of HIF-1α signaling.

Huoxue huayu tang;Hypoxia-induced factor 1 α(HIF-1 α);Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD);Progress

R-332

A

1003—6350（2016）23—3813—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.23.009

2016-05-23)

中國(guó)肝炎防治基金會(huì)-天晴肝病研究基金資助課題(編號(hào)：cfhpc20132026)；江蘇省無(wú)錫市科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：CSZ00N1249)

焦建華。E-mail：jjhjyjs@163.com