許紅玲,張萍,李笛悠,孫中鋒,林亞英
(1.安慶市立醫(yī)院婦科,安徽 安慶 246000;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院婦科,上海 200090)
下調(diào)PAK5抑制紫杉醇誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞自噬現(xiàn)象的研究
許紅玲1,張萍2,李笛悠2,孫中鋒2,林亞英2
(1.安慶市立醫(yī)院婦科,安徽 安慶 246000;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院婦科,上海 200090)
目的 初步探討下調(diào)PAK5的表達(dá)對化療藥物紫杉醇誘導(dǎo)CAOV-3卵巢癌細(xì)胞發(fā)生自噬和凋亡的影響。方法通過RT-qPCR檢測PAK5在卵巢癌細(xì)胞中的mRNA表達(dá)情況。在CAOV-3卵巢癌細(xì)胞中通過下調(diào)PAK5表達(dá)后,CCK8實驗檢測紫杉醇對腫瘤細(xì)胞毒性改變,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率的改變,以及免疫印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3B的表達(dá)變化。結(jié)果PAK5在不同卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá);在CAOV-3卵巢癌細(xì)胞中,與陰性對照siRNA組比較,PAK5 siRNA組中無論是PAK5的mRNA水平還是蛋白表達(dá)水平均明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);隨著紫杉醇濃度的逐漸遞增,紫杉醇對CAOV-3卵巢癌細(xì)胞毒性逐漸增加,而下調(diào)PAK5表達(dá)后,紫杉醇對卵巢癌細(xì)胞毒性增加更為明顯,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);在紫杉醇處理的CAOV-3卵巢癌細(xì)胞中,下調(diào)PAK5的表達(dá)后可明顯增加細(xì)胞的凋亡率,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);在紫杉醇處理的CAOV-3卵巢癌細(xì)胞中,下調(diào)PAK5的表達(dá)后可減少自噬相關(guān)蛋白LC3B蛋白的表達(dá)。結(jié)論P(yáng)AK5過表達(dá)于不同的卵巢癌細(xì)胞中,下調(diào)PAK5基因可以促使自噬相關(guān)蛋白LC3B表達(dá)減弱,可能是通過抑制CAOV-3卵巢癌細(xì)胞發(fā)生自噬,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,從而提高了CAOV-3卵巢癌細(xì)胞對紫杉醇化療的敏感性,減少紫杉醇獲得性耐藥的發(fā)生。
PAK5;卵巢癌;自噬;紫杉醇
卵巢癌在我國女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中死亡率高居首位。隨著我國老齡化人口的加劇,卵巢癌在我國的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢[1],卵巢癌的經(jīng)典化療方案包括紫杉醇,但應(yīng)用紫杉醇治療過程中出現(xiàn)的獲得性耐藥卻明顯降低卵巢癌治療的成功率。PAK5是絲氨酸/蘇氨酸激酶(PAKs)家族成員之一,細(xì)胞中高表達(dá)的PAK5可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抗凋亡、遷移、降低腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性等多種惡性生物學(xué)行為的發(fā)生。前期研究表明,PAK5的過表達(dá)可促進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞耐藥的形成[2]。而PAK5的上調(diào)可激活MAPK/ERK信號通路,后者在調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬(autophagy)過程中起到關(guān)鍵作用[3-4]。目前認(rèn)為自噬在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展中起著雙向效應(yīng)[5]。研究表明,紫杉醇可以誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性自噬,抑制自噬可以提高卵巢癌細(xì)胞對紫杉醇的敏感性[6]。而關(guān)于PAK5基因、自噬以及化療之間的關(guān)系鮮有報道。本研究通過檢測PAK5在卵巢癌中的表達(dá)情況,檢測紫杉醇對PAK5下調(diào)后CAOV-3卵巢癌細(xì)胞的毒性及凋亡的變化,以及紫杉醇對PAK5下調(diào)后CAOV-3卵巢癌細(xì)胞自噬水平的變化,初步探討下調(diào)PAK5的表達(dá)對化療藥物紫杉醇誘導(dǎo)CAOV-3卵巢癌細(xì)胞發(fā)生自噬和凋亡的影響。
1.1 主要材料與試劑 卵巢癌細(xì)胞系HO-9810、SKOV-3、CAOV-3以及正常胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫,在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco公司)、37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。紫杉醇由辰欣藥業(yè)股份有限公司提供(中國山東省),制成溶液,4℃儲存。X-treme GENE HP DNA及X-treme siRNA轉(zhuǎn)染試劑購自Roche公司,Annexin V/PI雙染法檢測試劑盒及Cell Counting Kit-8(簡稱CCK-8)試劑均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,兔抗人微管相關(guān)蛋白LC3B抗體、抗GAPDH抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購自Cell Signal Technology公司。
1.2 siRNAs的轉(zhuǎn)染 靶向PAK5的siRNA序列及無關(guān)干擾序列即陰性對照NC siRNA由百奧邁科生物技術(shù)有限公司合成。PAK5 siRNA的序列(5'-3')如下:正義鏈GGCGUACAGUGAAAGUGAAdTdT,反義鏈UUCACUUUCACUGUACGCCdTdT。NC siRNA的序列(5'-3')如下:正義鏈UUCUCCGAACGUGUCACDUdTdT,反義鏈ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT。按照X-treme siRNA轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染CAOV-3卵巢癌細(xì)胞。
1.3 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)mRNA的定量分析 使用TRIzol提取細(xì)胞中所有RNA,從100 ng總的RNA中合成其互補(bǔ)(c)DNA。在Bio-Rad CFX96實時PCR機(jī)器中進(jìn)行PCR反應(yīng)。PAK5的引物序列:上游,5'-CCGATACTACTGCTGACTACAC-3';下游,5'-GCTCTCTGATACTCCCACTTG-3'。GAPDH的引物序列:上游,5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3';下游,5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。通過Bio-Rad處理器2.1軟件檢測其Ct值,進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,每組蛋白重復(fù)3次。
1.4 Western blot方法檢測紫杉醇處理后細(xì)胞內(nèi)LC3B表達(dá)的變化 CAOV-3卵巢癌細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中,每組均取20μg總蛋白,經(jīng)SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)膜和封閉后,分別加入兔抗人PAK5抗體或LC3B抗體過夜,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗,室溫孵育2 h,加入ECL工作液,用分子成像系統(tǒng)曝光、拍照。實驗重復(fù)3次。
1.5 藥物敏感性測定 將CAOV-3卵巢癌細(xì)胞制成5×104/mL懸液,100μL/孔接種于96孔板中,每組設(shè)3個復(fù)孔,分別轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA和PAK5 siRNA48 h后,分別加入不同劑量紫杉醇(2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL以及8μg/mL、10μg/mL)處理細(xì)胞24 h后,加入10μL CCK-8溶液,5%CO2、37℃孵育1.5 h,利用酶標(biāo)儀于450 nm波長測定每孔的光密度。
1.6 細(xì)胞凋亡試驗 使用Annexin V/PI雙染法檢測試劑盒來檢測細(xì)胞凋亡。即細(xì)胞在轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后,用10μg/mL的紫杉醇處理24 h后收集細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液,200μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,加入5μL PI溶液和10μL FITC-AnnexinV溶液,在暗盒中孵育達(dá)到15 min,加入300μL結(jié)合緩沖液,上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。實驗重復(fù)3次。
1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行分析,使用GraphPad5.0繪制圖資料。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 PAK5在卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá) RT-qPCR分析顯示PAK5在卵巢癌細(xì)胞系中高表達(dá)。正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1作為對照組,我們與GES-1細(xì)胞中PAK5 mRNA水平相比,PAK5 mRNA水平在CAOV-3卵巢癌細(xì)胞中是其2.73倍,HO-9810細(xì)胞中是其3.36倍,SKOV-3細(xì)胞中是其2.45倍,說明PAK5在卵巢癌細(xì)胞系中明顯表達(dá)升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖1。
圖1 PAK5高表達(dá)于不同卵巢癌細(xì)胞中
2.2 下調(diào)PAK5的表達(dá)增加卵巢癌細(xì)胞對紫杉醇的敏感性 通過細(xì)胞毒性實驗觀察PAK5的表達(dá)在卵巢癌細(xì)胞對紫杉醇化療敏感性方面所起的作用。CAOV-3卵巢癌細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染50 nmol/L PAK5 siRNA和陰性對照siRNA達(dá)48 h后,RT-qPCR實驗提示轉(zhuǎn)染PAK5 siRNA組的PAK5 mRNA水平顯著下調(diào)(圖2),Western blot實驗也提示了轉(zhuǎn)染PAK5 siRNA組的PAK5蛋白水平顯著下調(diào)(圖3),差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞隨后分別用10μg/mL的紫杉醇處理24 h,CCK-8實驗表明,PAK5的下調(diào)表達(dá)顯著的提高了紫杉醇對CAOV-3細(xì)胞毒性,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖4。
圖2 利用siRNA干擾技術(shù)可明顯下調(diào)PAK5 mRNA水平
圖3 利用siRNA干擾技術(shù)可明顯下調(diào)PAK5蛋白水平
圖4 PAK5的抑制表達(dá)增加紫杉醇對CAOV-3卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性
2.3 PAK5的下調(diào)表達(dá)提高了紫杉醇誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞的凋亡 在CAOV-3卵巢癌細(xì)胞中,共設(shè)三組,分別為空白組、陰性對照組NC siRNA以及轉(zhuǎn)染PAK5 siRNA組,再用10μg/mL的紫杉醇處理24 h,然后用Annexin V和PI染色。流式細(xì)胞術(shù)(圖5)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染PAK5 siRNA組細(xì)胞總凋亡率較空白組及陰性對照組siRNA明顯升高(P<0.05),而空白組及陰性對照組siRNA細(xì)胞總凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
2.4 下調(diào)PAK5的表達(dá)可能抑制了紫杉醇誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞自噬的形成 兩組CAOV-3卵巢癌細(xì)胞在分別轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA和PAK5 siRNA后,用10μg/mL的紫杉醇同時處理上述兩組細(xì)胞24 h后。Western blot檢測結(jié)果(圖6)顯示在CAOV-3卵巢癌細(xì)胞中,PAK5siRNA可以顯著下調(diào)PAK5蛋白的表達(dá),下調(diào)PAK5的表達(dá)可顯著地抑制自噬相關(guān)蛋白LC3B的表達(dá),從而可能抑制了卵巢癌細(xì)胞自噬的形成。
圖5 下調(diào)PAK5表達(dá)增加紫杉醇處理的CAOV-3卵巢癌細(xì)胞凋亡率
圖6 下調(diào)PAK5的表達(dá)抑制了紫杉醇誘導(dǎo)CAOV-3卵巢癌細(xì)胞自噬的形成
PAK5是絲氨酸/蘇氨酸激酶(PAKs)家族中最具特點(diǎn)的成員,在多種實體腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)[7-11]。體外研究發(fā)現(xiàn),在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,PAK5的敲除可能促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡,而抑制了細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲[12]。同樣在結(jié)腸癌細(xì)胞中,研究發(fā)現(xiàn)PAK5通過在絲氨酸112位直接磷酸化Bad,從而通過Akt信號通路間接導(dǎo)致絲氨酸136位的磷酸化,從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生[13]。田聰?shù)萚10]認(rèn)為PAK5在具有侵襲性和轉(zhuǎn)移的卵巢癌細(xì)胞中是高度表達(dá)的,并且PAK5的高表達(dá)與卵巢癌細(xì)胞的紫杉醇化療耐藥有關(guān)。本研究同樣發(fā)現(xiàn)在不同卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá)PAK5,因而PAK5在卵巢癌細(xì)胞化療敏感性方面的作用被進(jìn)一步探究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過下調(diào)PAK5的表達(dá),顯著地增強(qiáng)了紫杉醇對CAOV-3卵巢癌細(xì)胞的毒性,另外紫杉醇誘導(dǎo)的CAOV-3卵巢癌細(xì)胞凋亡率也明顯增加。
此外,在CAOV-3卵巢癌細(xì)胞中,下調(diào)PAK5的表達(dá)可能抑制了紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬的形成。當(dāng)前認(rèn)為自噬對于腫瘤細(xì)胞,起著“促進(jìn)生存”及“誘導(dǎo)死亡”的雙向作用。一些化療藥物如表柔比星、吡柔比星、5-Fu等,不但可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡,同時也觀察到了自噬的出現(xiàn)[14-16]。在腫瘤治療中,Wang[13]發(fā)現(xiàn)卵巢癌耐藥性的產(chǎn)生來源于化療誘導(dǎo)自噬的形成,而且通過敲低ERK抑制自噬后,則可提高卵巢癌對順鉑的敏感性。同樣研究發(fā)現(xiàn),紫杉醇可以誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性自噬,抑制自噬可以提高卵巢癌細(xì)胞對紫杉醇的敏感性[6]。紫杉醇屬于新型抗微管類化療藥物,屬于一線的化療成分,臨床上被用于治療卵巢癌,乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌以及許多其他的人類惡性腫瘤[17],紫杉醇主要通過穩(wěn)定微管,最終導(dǎo)致細(xì)胞周期的停滯以及腫瘤細(xì)胞的凋亡性的死亡,來發(fā)揮它的抗腫瘤作用[18]。腫瘤細(xì)胞主要的特征之一就是其可以利用多種機(jī)制來逃避細(xì)胞凋亡的形成[19-20],而通過破壞腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制也可以導(dǎo)致紫杉醇的耐藥[21]。本研究發(fā)現(xiàn),下調(diào)PAK5的表達(dá)顯著地減少了自噬相關(guān)蛋白LC3B在紫杉醇處理的卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)水平,說明了下調(diào)PAK5的表達(dá),可能抑制了紫杉醇誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞自噬的形成。
已知自噬、凋亡以及壞死性細(xì)胞死亡之間存在著緊密的聯(lián)系,類似的刺激可誘發(fā)凋亡或者是自噬,兩者可能會相互調(diào)控、相互抑制,共同決定著細(xì)胞的最終命運(yùn)。本研究發(fā)現(xiàn)在卵巢癌細(xì)胞中,下調(diào)PAK5的表達(dá)后提高了紫杉醇的細(xì)胞毒性作用,提高了細(xì)胞凋亡率,可能抑制了細(xì)胞的自噬活性。由此推斷,PAK5可能在卵巢癌細(xì)胞存活以及化療耐藥性方面發(fā)揮著一個重要的作用,通過靶向抑制PAK5的表達(dá)可能提高了卵巢癌細(xì)胞化療療效,因此PAK5在卵巢癌細(xì)胞中充當(dāng)著一個潛在的治療靶點(diǎn)。
總之,本研究結(jié)果表明,PAK5高表達(dá)于卵巢癌細(xì)胞中,并初步探討了下調(diào)PAK5基因可能是通過抑制紫杉醇誘導(dǎo)CAOV-3卵巢癌細(xì)胞自噬的發(fā)生,提高了CAOV-3卵巢癌細(xì)胞對紫杉醇的敏感性,促進(jìn)細(xì)胞凋亡形成,從而減少紫杉醇獲得性耐藥的發(fā)生。因此,PAK5可能是卵巢癌的一個潛在的治療靶點(diǎn)。
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Downregulation of PAK5 inhibits paclitaxel-induced autophagy in ovarian cancer cells.
XU Hong-ling1,ZHANG Ping2,LI Di-you2,SUN Zhong-feng2,LIN Ya-ying2.1.Department of Gynaecology,Anqing Hospital,Anqing 246000, Anhui,CHINA;2.Department of Gynaecology,Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200090,CHINA
ObjectiveTo investigate the effect of downregulation of PAK5 on paclitaxel-induced autophagy and apoptosis in human ovarian cancer cell line(CAOV-3).MethodsPAK5 mRNA quantification in ovarian cancer was detected by RT-qPCR.In CAOV-3 cells,after down-regulation of PAK5 expression,the change of CAOV-3 cells cytotoxicity by paclitaxel was detected by Cell Counting Kit-8(CCK8),and cell apoptosis was detected by flow cytometry.The expression changes of autophagy-related protein(LC3B)were detected by western blotting.ResultsThe PAK5 is overexpressed in ovarian cancer cell line.PAK5-siRNA can significantly downergulate the expression of PAK5 gene in CAOV-3 cells(P<0.05).Silencing PAK5 significantly increases the sensitivity of CAOV-3 cells to paclitaxel(P<0.05). PAK5 knockdown enhances paclitaxel-induced apoptosis in ovarian cancer,and PAK5 silencing reduces paclitaxel-induced autophagy in CAOV-3 cells.ConclusionThe PAK5 is overexpressed in ovarian cancer cell line,and downregulation of PAK5 gene can inhibit LC3B expression and may promote apoptosis through inhibition of autophagy in CAOV-3 cells.
PAK5;Ovarian cancer;Autophagy;Paclitaxel
R737.31
A
1003—6350(2016)23—3798—04
10.3969/j.issn.1003-6350.2016.23.005
2016-06-27)
張萍。E-mail:727745108@qq.com