林紫微，趙智萍，林志軍，王海龍，任守忠，李佩佩

（海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南?？?71199）

海南三叉苦抗炎作用及機(jī)制研究

林紫微，趙智萍，林志軍，王海龍，任守忠，李佩佩

（海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南?？?71199）

目的研究海南三叉苦水提物的抗炎作用并探索其作用機(jī)制。方法通過二甲苯致小鼠耳腫脹、角叉菜膠致大鼠足腫脹來觀察三叉苦的抗炎作用。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELΙSA法)測定腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素1β(ΙL-1β)的含量。結(jié)果與模型組(0)相比，三叉苦水提物中、高劑量(19.11%，22.94%)能抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹(P＜0.05)，中劑量對角叉菜膠致大鼠足腫脹有明顯的抑制作用，在致炎4 h[(0.53±0.17)cm]效果最明顯(P＜0.01)。水提物中、高劑量對大鼠血清中TNF-α[(169.61±73.80)ng/L和(124.34±85.65)ng/L]和ΙL-1β [(521.01±206.89)ng/L和(393.99±197.61)ng/L]有不同程度的降低作用，TNF-α較模型組[(283.98±68.68)ng/L]降低顯著(P＜0.05)。結(jié)論海南三叉苦水提物具有抗炎作用，其抗炎作用可能與抑制TNF-α和ΙL-1β的生成有關(guān)。

三叉苦；抗炎；作用機(jī)制；腫瘤壞死因子α；白細(xì)胞介素1β

三叉苦為蕓香科吳茱萸屬植物三叉苦[Evodia lepta(Spreng.)Merr]的干燥全株，又名三椏苦、小黃散、雞骨樹、三丫苦、三枝槍、三叉虎等，味苦，性寒，具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、消腫止痛等功效；主治咽喉腫痛、瘧疾、黃疸型肝炎、風(fēng)濕骨痛、濕疹皮炎、感冒發(fā)熱、扁桃體炎、咽喉炎、跌打腫痛、風(fēng)濕痹痛等[1-3]。由三叉苦等組成的貫黃感冒沖劑等復(fù)方具有清熱解毒、祛風(fēng)止咳作用，用于感冒、發(fā)熱、咳嗽等風(fēng)熱型感冒，在市場上具有較好的聲譽(yù)。本實(shí)驗(yàn)通過研究海南三叉苦對兩種急性炎癥模型的保護(hù)作用，比較海南三叉苦水提物對正常和炎癥模型大鼠血清中的TNF-α和ΙL-1β含量的影響，進(jìn)一步探討其抗炎作用機(jī)制，以便為開發(fā)海南三叉苦的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物50只健康昆明種小鼠和48只健康昆明種大鼠，購于長沙市天勤生物科技有限公司。

1.2 儀器TP-1200C公斤電子天平(湘儀天平儀器設(shè)備有限公司)；SENCO R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申生科技有限公司)；SENCO W201恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)；MK3酶標(biāo)儀(美國Thermo)。

1.3 藥材與試劑三叉苦采于海南省瓊海市長坡鎮(zhèn)，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院曾念開老師鑒定為蕓香科吳茱萸屬植物三叉苦的干燥莖葉；阿司匹林腸溶片(批號：150116222，辰欣藥業(yè)股份有限公司)；布洛芬緩釋膠囊(批號：20150505，長春海外制藥集團(tuán)有限公司)；二甲苯(批號：20140919，廣州光華科技股份有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 海南三叉苦水提物樣品制備水煎煮法制備，稱取三叉苦干燥莖葉共2 000 g，浸泡過夜，煎煮3次。第一次10倍量水煎煮2 h，第二次9倍量水煎煮1.5 h，第三次8倍量水煎煮1 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至稠膏，50℃下真空干燥，計(jì)算提取率。實(shí)驗(yàn)時(shí)用蒸餾水溶解至所需濃度。

1.4.2 海南三叉苦水提物對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響[4]取小鼠50只，稱重，標(biāo)號，按體重隨機(jī)分為5組，即模型組、阿司匹林組、三叉苦水提物低、中、高劑量組，每組10只。灌胃給藥，連續(xù)給藥5 d，1次/d，灌胃體積為0.1 mL/10 g體重，模型組給予等體積的蒸餾水。末次給藥后1 h，在每只小鼠右耳前后兩面涂二甲苯各20μL，左耳不涂作為對照，45 min后脫頸處死，剪下完整左右耳，用6 mm直徑打孔器在距耳緣1 cm處打下圓耳片，稱重。左右耳的重量之差作為腫脹度并計(jì)算腫脹抑制率，計(jì)算公式為：腫脹度=右耳重量-左耳重量，腫脹抑制率=(模型組腫脹度－藥物組腫脹度)/模型組腫脹度×100%。

1.4.3 海南三叉苦水提物對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響[5]取大鼠42只，按1.4.1方法分為6組，即空白組、模型組、布洛芬組、三叉苦水提物低、中、高劑量組，每組8只。灌胃給藥，連續(xù)5 d，1次/d，灌胃體積為1 mL/100 g體重，空白組和模型組給予等體積蒸餾水。末次給藥后，測量每只大鼠右后足踝關(guān)節(jié)周長(cm)，1 h后，除空白組以外，每組大鼠均在右后足足趾中部皮下注射1%角叉菜膠0.1 mL/只致炎。分別在致炎后1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h測定大鼠右后足踝關(guān)節(jié)周長，計(jì)算足趾腫脹度，即足趾腫脹度=致炎后踝關(guān)節(jié)周長-致炎前踝關(guān)節(jié)周長。致炎后6 h，乙醚麻醉，斷頭取血，備用。

1.4.4 大鼠血清中TNF-α和ΙL-1β的含量取1.4.3法中大鼠斷頭所得全血，于3 600 r/min下離心，吸取上清液即得到血清。用酶聯(lián)免疫吸除法(ELΙSA)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，測定大鼠血清中TNF-α和ΙL-1β的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，顯著性水平α界定值設(shè)定為0.05。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義。

2 結(jié)果

2.1 海南三叉苦水提物對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響與模型組比較，三叉苦水提物中、高劑量組對二甲苯致小鼠耳腫脹的抑制較明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而三叉苦水提物低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三叉苦不同劑量組之間有一定的量效關(guān)系，高、中劑量組與低劑量組之間有明顯的量效關(guān)系，而中、高劑量組之間的量效關(guān)系不明顯，見表1。

表1 海南三叉苦水提物對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響(±s)

表1 海南三叉苦水提物對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響(±s)

注：與模型組比較，aP＜0.05，bP＜0.01。

組別劑量(g/kg)耳腫脹度(mg)腫脹抑制率(%)模型組阿司匹林組三叉苦-0.5 18 6 2 4.97±0.59 3.03±1.39b3.83±1.39a4.02±0.94a4.38±0.59 0 39.64 22.94 19.11 11.87

2.2 海南三叉苦水提物對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響由表2可知，與模型組比較，致炎后1 h、2 h、4 h、5 h、6 h，三叉苦中劑量組的大鼠足腫脹度顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)；致炎后4 h、5 h，高劑量組足腫脹度顯著降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；致炎后4 h，低劑量組足腫脹度降低顯著，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 海南三叉苦水提物對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響(±s)

表2 海南三叉苦水提物對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響(±s)

注：與模型組比較，aP＜0.05，bP＜0.01。

組別劑量（g/kg）足腫脹度(cm)模型組布洛芬組三叉苦-0.09 13.5 4.5 1.5 1 h 0.50±0.34 0.23±0.14 0.40±0.35 0.16±0.16a0.39±0.26 2 h 0.86±0.55 0.33±0.14a0.71±0.39 0.44±0.25a0.90±0.33 3 h 0.99±0.35 0.46±0.22b0.63±0.45 0.67±0.21 0.75±0.19 4 h 1.10±0.27 0.37±0.23b0.59±0.37a0.53±0.17b0.78±0.19a5 h 0.93±0.17 0.34±0.22b0.51±0.34a0.46±0.34b0.69±0.15 6 h 0.89±0.38 0.33±0.15b0.63±0.21 0.39±0.27a0.59±0.24

2.3 大鼠血清中TNF-α和ΙL-1β的含量三叉苦水提物中、高劑量組均能降低TNF-α的含量，且與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)；三叉苦水提物各劑量組能不同程度地降低ΙL-1β的含量，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表3 海南三叉苦水提物對角叉菜膠所致足腫脹大鼠血清中TNF-α和IL-1β含量的影響(±s)

表3 海南三叉苦水提物對角叉菜膠所致足腫脹大鼠血清中TNF-α和IL-1β含量的影響(±s)

注：與模型組比較，aP＜0.05，bP＜0.01。

組別空白組模型組布洛芬組三叉苦劑量(g/kg) --0.09 13.5 4.5 1.5 TNF-α(ng/L) 133.97±51.64b283.98±68.68 198.26±66.51a124.34±85.65b169.61±73.80a211.78±43.33 ΙL-1β(ng/L) 383.39±232.27a565.88±202.14 562.84±214.19 393.99±197.61 521.01±206.89 571.97±223.47

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制二甲苯致小鼠耳腫脹、角叉菜膠致大鼠足腫脹兩種急性炎癥模型，觀察三叉苦水提物抗炎效果。結(jié)果表明，三叉苦水提物對角叉菜膠致大鼠足腫脹有抑制作用，且三叉苦水提物中劑量組對足腫脹的抑制效果明顯?？梢姾Ｄ先婵嗨嵛镉忻黠@的抗炎作用。

炎癥過程中釋放的炎性介質(zhì)是造成機(jī)體損害的重要原因，TNF-α是炎性細(xì)胞因子，參與全身炎癥反應(yīng)，是一種內(nèi)源性致熱源，能夠引起發(fā)燒，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，TNF-α與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合可增加過氧化物陰離子產(chǎn)生，刺激細(xì)胞脫顆粒和髓過氧化物酶，從而使內(nèi)皮細(xì)胞分泌ΙL-8、ΙL-1和GM-CSF等炎性因子增加，并促進(jìn)中性粒細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞上黏附，進(jìn)而刺激機(jī)體局部發(fā)生炎癥反應(yīng)，是一個(gè)重要的炎癥介質(zhì)[6]。ΙL-1β是由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎性因子，能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中纖維蛋白的沉積和溶解，促進(jìn)成纖維細(xì)胞膠原酶的產(chǎn)生，刺激成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)膠原沉積，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)過程[7]。三叉苦水提物給藥組大鼠血清中TNF-α和ΙL-1β的含量與模型組比較有不同程度的降低，其中TNF-α下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ΙL-1β雖有一定程度降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示抑制TNF-α和ΙL-1β的生成可能是三叉苦抗炎的作用機(jī)制。且其抑制作用具有明顯的量效關(guān)系，在一定的范圍內(nèi)，TNF-α和ΙL-1β的含量隨著給藥劑量的增加而顯著降低。

從小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，海南三叉苦水提物的抗炎效果次于阿司匹林；從大鼠足腫脹以及血清中TNF-α、ΙL-1β的測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，海南三叉苦水提物的抗炎效果優(yōu)于布洛芬。由此可見，海南三叉苦具有良好的抗炎作用。據(jù)調(diào)查，一些海南人民會(huì)用三叉苦葉子泡茶，有藥食同源之功。因此，海南三叉苦具有很高的藥用商品化價(jià)值，可以被進(jìn)一步的開發(fā)利用。

[1]國家中醫(yī)藥管理局編委會(huì).中華本草:第二十九卷第四分冊[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1999:915.

[2]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,2003: 68.

[3]中醫(yī)學(xué)編輯委員會(huì).中國醫(yī)學(xué)百科全書:中醫(yī)學(xué)中冊[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1991:1030.

[4]徐叔云,卞如濂,陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1992:719．

[5]徐叔云.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2002: 882.

[6]趙瑋,徐景杰.腫瘤壞死因子-α在炎癥與腫瘤中的作用[J].中國療養(yǎng)醫(yī)學(xué),2012,21(7):607-609.

[7]俞浩,方艷夕,毛斌斌,等.地榆炮制前后水提物抗炎效果研究[J].中藥材,2014,37(1):34-37.

Anti-inflammatory effect and mechanism of Evodia lepta in Hainan.

LIN Zi-wei,ZHAO Zhi-ping,LIN Zhi-jun,WANG Hai-long,REN Shou-zhong,LI Pei-pei.School of Pharmacy,Hainan Medical University,Haikou 571199,Hainan,CHINA

ObjectiveTo study the anti-inflammatory effect and mechanism of Evodia lepta in Hainan. MethodsThe anti-inflammatory effect of Evodia lepta was observed by acute inflammation model of the mouse ear swelling and rat foot swelling.The contents of tumor necrosis factor alpha(TNF-α)and interleukin 1 beta(ΙL-1β) were determined by enzyme-linked immunosorbent assay(ELΙSA).ResultsCompared with the model group,the middle and high dose water extracts(19.11%,22.94%,respectively)of Evodia lepta could inhibit the ear swelling induced by xylene(P＜0.05);The water extracts at middle doses could remarkably restrained paw edema induced by carrageen,with the best anti-inflammatory effect at 4 h[(0.53±0.17)cm,P＜0.01];The water extracts at middle and high dose could reduce the content of TNF-α[(169.61±73.80)ng/L vs(124.34±85.65)ng/L]and ΙL-1β[(521.01±206.89) ng/L vs(393.99±197.61)ng/L]in rat serum;Compared with the model group[(283.98±68.68)ng/L],the TNF-α was decreased significantly(P＜0.05).ConclusionThe water extract of Evodia lepta has anti-inflammatory effect,and its anti-inflammatory effect may be related to inhibiting the formation of TNF-α and ΙL-1β.

Evodia lepta(Spreng.)Merr.;Anti-inflammatory;Mechanism;Tumor necrosis factor alpha (TNF-α);Ιnterleukin 1 beta(ΙL-1β)

R285.1

A

1003—6350（2016）13—2079—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.13.005

2016-02-25)

2014年省級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（編號：20140112）

任守忠。E-mail：540877323@qq.com