劉慰華，　林雙峰，　石吉相，　潘　婷，　陳秋梅，　王爍婷，　尚　慧

(1廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，廣州心血管疾病研究所，廣東 廣州 510260;2廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405)

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1-磷酸鞘氨醇在高糖誘導血管內(nèi)皮細胞功能損傷中的作用*

劉慰華1△，林雙峰2，石吉相1，潘婷1，陳秋梅1，王爍婷1，尚慧1

(1廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，廣州心血管疾病研究所，廣東 廣州 510260;2廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405)

[摘要]目的： 探討1-磷酸鞘氨醇(S1P)在高糖誘導血管內(nèi)皮細胞功能損傷中的作用及其機制。方法: 在高糖培養(yǎng)的人主動脈內(nèi)皮細胞模型中，分別或同時給予S1P、鞘氨醇激酶1抑制劑和Akt抑制劑處理后，觀察一氧化氮(NO)、粒細胞-內(nèi)皮細胞黏附率、細胞間黏附分子1(ICAM-1)蛋白表達、內(nèi)皮細胞遷移以及Akt/內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)信號途徑的改變。結(jié)果: S1P明顯降低高糖誘導的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)上清液中NO含量，促進粒細胞與內(nèi)皮細胞黏附，顯著增加內(nèi)皮細胞ICAM-1蛋白表達，抑制內(nèi)皮細胞遷移和Akt/eNOS信號通路激活。鞘氨醇激酶1抑制劑減少S1P生成后上述內(nèi)皮細胞功能指標得以明顯改善，Akt/eNOS信號通路恢復激活。結(jié)論: S1P促進高糖培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞功能障礙的形成，可能與其抑制Akt/eNOS信號通路激活有關(guān)。抑制S1P生成有望成為減輕內(nèi)皮細胞功能損傷的治療策略之一。

[關(guān)鍵詞]1-磷酸鞘氨醇； 內(nèi)皮細胞； 內(nèi)皮型一氧化氮合酶； 細胞間黏附分子1

血管內(nèi)皮細胞損傷是高血壓、糖尿病血管并發(fā)癥等多種類型心血管疾病的早期表現(xiàn)和共同的病理生理基礎(chǔ)。內(nèi)皮細胞功能障礙早期體現(xiàn)為內(nèi)皮依賴性血管舒張功能下降，主要與內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)活性降低進而一氧化氮(nitric oxide，NO)合成減少有關(guān)[1-2]。慢性高血糖是糖尿病導致血管內(nèi)皮細胞損傷最重要的元兇之一。除高糖外，研究發(fā)現(xiàn)1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)亦參與糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程。S1P是一種有生物活性的溶血磷脂，膜磷脂類神經(jīng)酰胺分解代謝產(chǎn)物鞘氨醇在限速酶鞘氨醇激酶作用下生成S1P。內(nèi)皮細胞、單核細胞、血小板等可生成釋放S1P[3]。近年來研究顯示糖尿病患者和糖尿病動物循環(huán)中S1P含量增加，S1P參與糖尿病傷口愈合、糖尿病腎病、動脈粥樣硬化、急性血管炎癥等病理進程[4-7]。然而S1P在糖尿病誘導內(nèi)皮細胞功能損傷的作用及其機制目前還未完全闡明。

本研究采用高糖培養(yǎng)人主動脈內(nèi)皮細胞，構(gòu)建高糖誘導內(nèi)皮細胞損傷的體外細胞模型，并分別給予S1P、鞘氨醇激酶 1抑制劑和Akt抑制劑處理，觀察NO含量、粒細胞-內(nèi)皮細胞黏附率、細胞間黏附分子 1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)表達、內(nèi)皮細胞遷移及Akt/eNOS信號通路的改變，探討S1P在高糖培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞功能障礙中的作用及其機制，為探尋S1P作為可能的新的藥物干預靶點防治糖尿病內(nèi)皮細胞功能損傷奠定實驗基礎(chǔ)。

材料和方法

1內(nèi)皮細胞培養(yǎng)、傳代和處理

人主動脈內(nèi)皮細胞(human aortic endothelial cells，HAECs)購于ScienCell Research Laboratories。內(nèi)皮細胞用含10%胎牛血清及多種生長因子的EBM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)。采用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合液消化、傳代。培養(yǎng)細胞2～6代用于實驗。

高糖培養(yǎng)內(nèi)皮細胞：正常培養(yǎng)內(nèi)皮細胞接近匯合狀，無血清同步化處理12 h后更換成含22 mmol/L高糖培養(yǎng)基，即正常糖培養(yǎng)基(含5.5 mmol/L葡萄糖)中添加16.5 mmol/L 葡萄糖至終濃度為22 mmol/L 為高糖培養(yǎng)。22 mmol/L甘露醇(mannitol)作為高滲對照。實驗分為正常組、甘露醇組、高糖(high glucose, HG)組、高糖+S1P(1 μmol/L)組、高糖+二甲基鞘氨醇(N,N-dimethylsphingosine，DMS；2.5 μmol/L)組和高糖+MK2206(0.5 μmol/L)組和高糖+ MK2206+DMS組。S1P和鞘氨醇激酶 1抑制劑DMS 購于Sigma, Akt抑制劑MK2206 購于MedChem Express。

2實驗方法

2.1培養(yǎng)液NO含量的檢測內(nèi)皮細胞接種于24孔板中，分別給予正常糖、甘露醇、高糖、高糖+S1P和高糖+DMS處理24 h后收集培養(yǎng)液，每組4個復孔。實驗獨立重復4次。根據(jù)NO檢測試劑盒(購于南京建成生物工程研究所)說明書要求，采用呈色反應和比色方法測定細胞培養(yǎng)液中NO含量，用分光光度計測定波長550 nm處各組吸光度值(A)并進行計算。

2.2粒細胞-內(nèi)皮細胞黏附實驗內(nèi)皮細胞接種于48孔I型膠原酶包被的無菌培養(yǎng)板中，分別給予正常糖、甘露醇、高糖、高糖+S1P和高糖+DMS處理24 h后，無血清培養(yǎng)液洗滌3次，每孔加入新鮮分離的中性粒細胞1×105個，37 ℃ 孵育30 min，無血清培養(yǎng)液輕柔洗滌2次，去除未結(jié)合的粒細胞。每組4個復孔。實驗獨立重復3次。根據(jù)髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性變化對黏附于內(nèi)皮細胞上的粒細胞進行定量分析。粒細胞黏附率(%) = 黏附粒細胞MPO活性/總粒細胞數(shù)(1×105個)MPO活性。

2.3Western blot實驗用三去污裂解液裂解內(nèi)皮細胞，收集細胞裂解液移至1.5 mL EP管中，采用BCA蛋白定量試劑盒(Thermo)測定各組細胞裂解液中蛋白質(zhì)含量。經(jīng)12% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，每孔蛋白總量40 μg。在Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀上轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，相應的Ⅰ抗[ICAM-1 1∶5 000，p-eNOS(Ser1177) 1∶5 000，t-eNOS 1∶5 000，p-Akt(Ser473)1∶5 000，t-Akt 1∶5 000，tubulin 1∶10 000；均購于Abcam 公司]4 ℃孵育過夜，次日辣根過氧化物酶標記的相應 II 抗室溫孵育1 h，加入ECL化學發(fā)光試劑，X光膠片曝光。UVP GDS8000系統(tǒng)拍攝圖像，應用ImageJ軟件分析并計算各組條帶灰度值。

2.4內(nèi)皮細胞劃痕實驗內(nèi)皮細胞以每孔2×105的密度接種24孔板中。分組培養(yǎng)，每組3個平行孔。實驗至少重復3次。細胞生長近融合80%～90%時，換用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h使細胞同步化。用200 μL無菌槍頭垂直在24孔板內(nèi)底部正中劃痕1次，PBS輕洗去除劃痕處細胞。各組相應加入新鮮培養(yǎng)基和藥物處理后繼續(xù)培養(yǎng)，顯微鏡下拍照，分別觀察記錄0 h、24 h時劃痕寬度。細胞遷移距離(μm)= 劃痕后0 h寬度(μm)-24 h時劃痕寬度(μm)。

3統(tǒng)計學處理

每組實驗至少重復3次以上，實驗結(jié)果用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件行統(tǒng)計學分析。多組比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1S1P對高糖培養(yǎng)內(nèi)皮細胞NO含量的影響

高糖組培養(yǎng)液中NO含量較正常組顯著減少(P<0.05)。S1P刺激后高糖培養(yǎng)內(nèi)皮細胞NO含量減少更加明顯(P<0.05)。鞘氨醇激酶 1抑制劑DMS減少S1P生成后高糖條件下內(nèi)皮細胞NO含量明顯增加(P<0.05)。高滲對照甘露醇組NO含量與正常組相比無明顯改變，見圖1。

Figure 1.The effect of S1P on NO content in endothelial cells exposed to high glucose. NO: nitric oxide; NG: normal glucose; HG: high glucose; S1P: sphingosine 1-phosphate; DMS:N,N-dimethylsphingosine. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsNG;#P<0.05vsHG.

圖1S1P對高糖培養(yǎng)下內(nèi)皮細胞NO含量的影響

2S1P對高糖培養(yǎng)內(nèi)皮細胞黏附功能的影響

正常培養(yǎng)僅有少量多形核中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophils，PMN)黏附于內(nèi)皮細胞表面。高糖培養(yǎng)的PMN-內(nèi)皮細胞黏附率顯著增加(P<0.05)。S1P刺激進一步提高高糖培養(yǎng)PMN-內(nèi)皮細胞黏附率(P<0.05)。給予鞘氨醇激酶 1抑制劑DMS后發(fā)現(xiàn)高糖條件下PMN-內(nèi)皮細胞黏附率顯著降低(P<0.05)。高滲對照甘露醇組PMN黏附率與正常組相比較無顯著變化，見圖2。

我們還檢測內(nèi)皮細胞黏附分子ICAM-1蛋白表達的變化情況。高糖培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞ICAM-1蛋白表達較正常組明顯增加(P<0.05)。S1P進一步促進高糖培養(yǎng)內(nèi)皮細胞ICAM-1蛋白的表達(P<0.05)。鞘氨醇激酶 1抑制劑DMS則抑制高糖條件下內(nèi)皮細胞ICAM-1的表達(P<0.05)。高滲對照甘露醇對ICAM-1蛋白表達無明顯影響,見圖3。

3S1P對高糖培養(yǎng)內(nèi)皮細胞遷移的影響

如圖4所示，正常組和高滲對照甘露醇組內(nèi)皮細胞遷移較快，培養(yǎng)24 h后幾乎覆蓋劃痕區(qū)。高糖組細胞遷移減慢，遷移距離明顯小于正常組(P<0.05)。S1P刺激后高糖培養(yǎng)內(nèi)皮細胞遷移距離進一步縮短(P<0.05)。鞘氨醇激酶 1抑制劑DMS處理后，高糖下內(nèi)皮細胞遷移加快，遷移距離明顯增加(P<0.05)。

4S1P對高糖培養(yǎng)內(nèi)皮細胞Akt/eNOS信號通路激活的影響

圖5所示，與正常組相比，高糖組內(nèi)皮細胞Akt和eNOS磷酸化蛋白水平均明顯減少(P<0.05)。

Figure 2.The effect of S1P on PMN-endothelial cell adhesive rate exposed to high glucose (×200). PMN: polymorphonuclear neutrophils; NG: normal glucose; HG: high glucose; S1P: sphingosine 1-phosphate; DMS:N,N-dimethylsphingosine. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsNG;#P<0.05vsHG.

圖2S1P對高糖培養(yǎng)下粒細胞-內(nèi)皮細胞黏附率的影響

Figure 3.The effect of S1P on ICAM-1 protein level in endothelial cells exposed to high glucose. NG: normal glucose; HG: high glucose; S1P: sphingosine 1-phosphate; DMS:N,N-dimethylsphingosine. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNG;#P<0.05vsHG.

圖3S1P對高糖培養(yǎng)下內(nèi)皮細胞ICAM-1蛋白表達的影響

與Akt 抑制劑MK2206相似，S1P刺激使高糖培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞磷酸化Akt和磷酸化eNOS蛋白水平降低更加明顯(P<0.05)。鞘氨醇激酶-1抑制劑DMS干預后顯著增加高糖誘導的內(nèi)皮細胞Akt和eNOS磷酸化蛋白水平(P<0.05)。內(nèi)皮細胞先加入Akt 抑制劑MK2206預處理后再給予DMS干預，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DMS上調(diào)Akt磷酸化和eNOS磷酸化水平作用明顯減弱(P<0.05)。高滲對照甘露醇對Akt/eNOS信號通路激活沒有明顯影響。

討論

內(nèi)皮細胞作為血管壁的第一道滲透屏障，襯于血管腔最內(nèi)層，還分泌多種血管活性物質(zhì)如NO、前列環(huán)素、抗凝和纖溶因子等。NO在維持血管穩(wěn)態(tài)中作用至關(guān)重要，包括介導內(nèi)皮依賴性血管舒張，促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移，抑制血小板聚集，抑制中性粒細胞趨化及粘附于血管內(nèi)皮等[1]。內(nèi)皮細胞損傷是糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生的起始環(huán)節(jié)和最早期病理表現(xiàn)。內(nèi)皮細胞損傷及其功能障礙可進一步誘發(fā)和加速動脈粥樣硬化和血栓形成[8]。糖尿病狀態(tài)下除了高血糖外，血小板活化等亦參與內(nèi)皮功能障礙發(fā)生發(fā)展進程。血小板作為循環(huán)中S1P主要來源，在高血糖、胰島素抵抗和氧化應激等病理性因素刺激后活化生成并釋放大量S1P[9-10]。近年來研究顯示糖尿病患者和糖尿病動物血清中S1P含量明顯增加，與糖尿病腎病、動脈粥樣硬化、急性血管炎癥等病程發(fā)展密切相關(guān)[4-7]。然而S1P在高糖誘導內(nèi)皮細胞損傷中的作用及機制目前還未完全闡明。本研究觀察到高糖培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞NO含量減少、粘附作用增強和遷移能力下降，表明我們成功構(gòu)建高糖誘導內(nèi)皮細胞功能障礙的體外細胞模型。S1P刺激明顯降低高糖培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞NO含量，增加PMN粘附率和粘附分子ICAM-1蛋白表達，抑制內(nèi)皮細胞遷移，提示S1P促進高糖誘導的內(nèi)皮細胞功能障礙，進一步加重內(nèi)皮細胞損傷。給予鞘氨醇激酶 1抑制劑DMS減少S1P生成后，發(fā)現(xiàn)高糖條件下內(nèi)皮細胞NO含量明顯增加，PMN粘附率和ICAM-1蛋白表達顯著下降，內(nèi)皮細胞遷移加速，表明鞘氨醇激酶1抑制劑可改善內(nèi)皮細胞功能，減輕高糖誘導的內(nèi)皮細胞損傷。

Figure 4.The effect of S1P on migration of endothelial cells exposed to high glucose (×40). NG: normal glucose; HG: high glucose; S1P: sphingosine 1-phosphate; DMS:N,N-dimethylsphingosine. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNG;#P<0.05vsHG.

圖4S1P對高糖培養(yǎng)下內(nèi)皮細胞遷移的影響

Figure 5.The effect of S1P on the phosphorylated protein levels of Akt and eNOS in endothelial cells exposed to high glucose. NG: normal glucose; HG: high glucose; S1P: sphingosine 1-phosphate; DMS:N,N-dimethylsphingosine. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNG;#P<0.05vsHG;△P<0.05vsHG+DMS.

圖5S1P對高糖培養(yǎng)下內(nèi)皮細胞Akt/eNOS信號通路的影響

Akt(又稱蛋白激酶B) 作為細胞內(nèi)關(guān)鍵信號分子之一，在細胞增殖、遷移、分化、凋亡和物質(zhì)代謝等一系列生理和病理進程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[10]。Akt Ser473位點磷酸化后被活化，可使相應底物蛋白如eNOS、GSK-3等特定部位的絲/蘇氨酸發(fā)生磷酸化，從而激活或抑制其下游靶蛋白功能。eNOS是NO合成過程的關(guān)鍵酶，是血管內(nèi)皮功能完整的標志之一。在血管內(nèi)皮細胞中，活化的Akt 可導致eNOS-Ser1177 位點磷酸化，進而激活eNOS，后者催化L-精氨酸與氧分子經(jīng)氧化還原反應產(chǎn)生并釋放NO。eNOS活性降低、NO合成減少是導致血管內(nèi)皮功能障礙的主要原因[11]。在本研究中，我們進一步考察S1P加重高糖下內(nèi)皮細胞功能障礙的作用是否與其影響Akt/eNOS信號通路激活有關(guān)。結(jié)果顯示高糖培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞p-Akt(Ser473)和p-eNOS(Ser1177)蛋白水平顯著降低，提示高糖抑制內(nèi)皮細胞 Akt/eNOS信號通路激活。S1P刺激進一步抑制高糖條件下Akt/eNOS信號通路激活。鞘氨醇激酶 1抑制劑明顯上調(diào)p-Akt(Ser473)和p-eNOS(Ser1177)的水平，表明鞘氨醇激酶 1抑制劑可減輕高糖對Akt/eNOS信號通路的抑制效應，Akt/eNOS信號通路激活得以部分恢復。

簡言之，本研究結(jié)果顯示S1P加重高糖誘導的內(nèi)皮細胞功能損傷，包括減少NO含量、增強粘附作用和抑制內(nèi)皮細胞遷移。鞘氨醇激酶 1抑制劑減少S1P生成后上述內(nèi)皮細胞功能得以明顯改善，激活Akt/eNOS信號通路可能是鞘氨醇激酶 1抑制劑改善高糖誘導內(nèi)皮細胞損傷的作用機制之一。S1P通過何種途徑影響內(nèi)皮細胞Akt/eNOS信號通路以及其他作用機制是我們將進一步深入研究的內(nèi)容，以期探明糖尿病內(nèi)皮細胞功能障礙發(fā)生機制和尋找可能新的干預靶標。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Role of sphingosine 1-phosphate on high glucose-induced vascular endothelial cell dysfunctionLIU Wei-hua1, LIN Shuang-feng2, SHI Ji-xiang1, PAN Ting1, CHEN Qiu-mei1, WANG Shuo-ting1, SHANG Hui1

(1TheSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,GuangzhouInstituteofCardiovascularDisease,Guangzhou510260,China;2TheFirstAffiliatedHospital,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,China.E-mail:liuweihua.96@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To explore the role of sphingosine 1-phosphate (S1P) in the dysfunction of vascular endothelial cells exposed to high glucose. METHODS: In human aortic endothelial cells cultured under high-glucose (22 mmol/L glucose) medium, nitric oxide (NO) level, polymorphonuclear neutrophil-endothelial cell adhesion rate, protein level of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), migration of endothelial cells and Akt/endothelial nitric oxide synthase (eNOS) pathway activation were observed after S1P, sphingosine kinase-1 inhibitor and/or Akt inhibitor treatments. RESULTS: S1P decreased NO level, increased polymorphonuclear neutrophil adhesive rate, enhanced ICAM-1 protein level, and inhibited migration of endothelial cells and activation of Akt/eNOS pathway in endothelial cells cultured under high-glucose condition. Sphingosine kinase-1 inhibitor, which reduced S1P content, significantly improved the above endothelial cell function indexes and restored the activation of Akt/eNOS pathway. CONCLUSION: S1P promoted high glucose-induced dysfunction of endothelial cells probably by inhibiting the activation of Akt/eNOS signal pathway. Targeting S1P is expected to become one of potential treatment strategies to reduce endothelial cell dysfunction.

[KEY WORDS]Sphingosine 1-phosphate; Endothelial cells; Endothelial nitric oxide synthase; Intercellular adhesion molecule-1

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.009

[中圖分類號]R363.21

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel: 020-34153256; E-mail: liuweihua.96@163.com

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 81400234)；廣東省科技計劃(No. 2013B021800182)；廣州市屬高校科技計劃(No. 1201410344)

[收稿日期]2015- 08- 20[修回日期] 2015- 12- 10

[文章編號]1000- 4718(2016)02- 0245- 06