葉磊海，鐘世歡，葉佳明，楊 琳，許榮年

（1.浙江公正檢驗中心有限公司，浙江杭州 310009；2.浙江贊宇科技集團股份有限公司，浙江杭州 310009）

LC-MS-MS法同時測定動物肌肉組織和牛奶中10種氨基糖苷類藥物的方法優(yōu)化研究

葉磊海1，鐘世歡1，葉佳明1，楊 琳1，許榮年2

（1.浙江公正檢驗中心有限公司，浙江杭州 310009；2.浙江贊宇科技集團股份有限公司，浙江杭州 310009）

應(yīng)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，建立了動物肌肉組織和牛奶中壯觀霉素、潮霉素B、鏈霉素、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、安譜霉素、妥布霉素、新霉素、慶大霉素10種氨基糖苷類藥物的的檢測方法。樣品通過三氯乙酸提取并沉淀蛋白，用HLB固相萃取柱凈化，通過SILICA SG80 S5色譜柱分離，在正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式下分析定量。在0.02～1μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)大于0.995，在100、200、300μg/kg 添加水平下，平均回收率為70%～110%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%，檢測限為20μg/kg。該方法簡單，快速，準(zhǔn)確，同時避免七氟丁酸等離子對試劑對儀器造成的污染及離子抑制問題。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；氨基糖苷類藥物；動物肌肉組織和牛奶

氨基糖苷類抗生素是一類含有氨基糖苷鍵的抗生素，抗菌譜廣，對需氧革蘭陰性桿菌具有強大的抗菌活性，臨床應(yīng)用廣泛，目前已有數(shù)十種天然抗生素或半合成品種，由于其高效低價，是當(dāng)今世界使用最為普遍的抗生素種類之一，廣泛用于養(yǎng)殖業(yè)中。然而由于其具有耳腎等毒副作用，同時伴隨著大量應(yīng)用這類抗生素而出現(xiàn)臨床耐藥菌。我國衛(wèi)生部、農(nóng)業(yè)部，質(zhì)檢總局以及相關(guān)部門也將其列為監(jiān)管工作中的重點，為此，建立簡單、可靠、快速、靈敏的檢測方法對于保證動物源食品安全，促進養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，具有十分重要的意義。

目前國內(nèi)外檢測此類抗生素的方法主要有微生物法[1]、免疫分析法[2]、氣相色譜法和質(zhì)譜法，液質(zhì)聯(lián)用法是目前檢測此類抗生素最廣泛的的方法[3]。但是由于氨基糖苷類藥物易溶于水，極性很強，在C18柱上保留很弱，且無紫外吸收，目前使用最多的是通過加入離子對試劑增強保留，動物源食品基質(zhì)復(fù)雜，給目標(biāo)物的定性和定量檢測帶來很大的難度，目前文獻報道的方法前處理步驟繁瑣，整個檢測周期長，基質(zhì)效應(yīng)較為嚴重[4]，很難獲得良好的峰型和分離。

本方法通過改變前處理方式，優(yōu)化質(zhì)譜條件，能夠縮短檢測時間，有效去除不同基質(zhì)樣品帶來的基質(zhì)效應(yīng)，同時避免七氟丁酸等離子對試劑對儀器造成的污染及離子抑制問題。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent6460液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧（ESI）離子源（美國 Agilent公司）AR2140電子分析天平，KS-300EI超聲波清洗器（寧波海曙科生超聲設(shè)備公司）、Centrifug-5804R臺式離心機（德國 Eppendorf），N-EVAP 11氮吹儀（美國Organomation associates Inc），milli-Q純水儀（美國millpore公司）chunGX-274固相萃取裝置，Oasis HLB SPE（3cc/6mg，美國 Waters）。

乙腈，色譜純。甲酸，色譜純。三氯乙酸：純度≥99%。

10種標(biāo)準(zhǔn)品（純度90.0%～100%）：Dr.Ehrenstorfer德國。

分別稱取10mg氨基糖苷類藥物標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解，配置成濃度為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18℃避光保存。用空白基質(zhì)樣品配置成不同濃度系列的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

1.2 實驗條件

1.2.1 樣品前處理

稱取樣品約5.00g（精確至1 mg），置于50.0mL離心管中，加入10.0mL5%三氯乙酸，渦旋30s，超聲提取15min，10 000r/min離心，1min，倒出上清液于50mL離心管，殘渣重復(fù)提取一遍，合并上清液，備用。

凈化：分別用3.0mL甲醇，3mL水，3mL5%三氯乙酸淋洗后，準(zhǔn)確將20mL提取液放入小柱，先用5mL水溶液淋洗，再用6mL甲醇洗脫，收集洗脫液于試管中，氮吹至近干，用0.1%甲酸乙腈（3+7）定容至1.0mL，漩渦混勻，過0.22μm微孔濾膜，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測定。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：SILICA SG80 S5；2.0mm i.d.×150mm

流動相：A：0.1% 甲酸（5mol/L乙酸銨）B：CH3CN，0.1% HCOOH

B% 70%（0min）-＞70%（2min）-＞10%（6min）-＞10% （8min）-＞70%（12min）

流速：0.3mL/min

溫度：35℃

進樣量：5μL

1.2.3 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI+）。

噴霧壓力：40psi。

干燥氣流速：10L/min。

干燥氣溫度：350℃。

毛細管電壓：4 000V。

表1 監(jiān)測離子對及相關(guān)電壓參數(shù)設(shè)定

2 結(jié)果與討論

2.1 提取和凈化條件的優(yōu)化

動物肌肉組織和牛奶樣品基質(zhì)復(fù)雜，有很多內(nèi)容源性的物質(zhì)干擾分析測定，因此，必須對樣品的提取和凈化方法進行適當(dāng)?shù)膬?yōu)化，我們比較了不同濃度的三氯乙酸，發(fā)現(xiàn)20mL5%的三氯乙酸不僅可以充分的提取目標(biāo)物，而且也能有效的沉淀樣品中的蛋白，也防止高濃度的三氯乙酸污染質(zhì)譜儀器。

Oasis HLB固相萃取柱是親水親酯平衡的反相萃取柱，是一種可適用于酸性，中性，堿性化合物的通用性萃取柱，實驗證明Oasis HLB固相萃取柱對氨基糖苷類藥物萃取效率較高，凈化效果好。本方法對洗脫液的用量和類型進行了考察，選擇甲醇作為洗脫液，得到了理想的效果，并優(yōu)化了洗脫液的體積，采用6mL甲醇能夠完全把目標(biāo)物質(zhì)洗脫下來。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

由于氨基糖苷類藥物易溶于水，極性很強，在C18柱上保留很弱，目前國標(biāo)方法中大多采用七氟丁酸等改性劑來增強該類物質(zhì)的保留[4]，確實能獲得分離度及對稱因子較好的峰型，但是對于儀器的污染非常嚴重，會顯著抑制負離子模式的響應(yīng)，儀器的背景噪音會非常高。也有相關(guān)文獻采用HILIC色譜柱等親水性色譜柱來分離此類藥物，但是筆者經(jīng)過試驗發(fā)現(xiàn)此類色譜柱重現(xiàn)性較差，平衡時間長，不利于大批量檢測工作的開展。本實驗采用SILICA SG80 S5色譜柱是普通硅膠柱，采用常用的甲酸乙酸胺-乙腈體系就能獲得理想的分離度和靈敏度。通過考察不同濃度乙酸銨-乙腈體系，發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸5moL/L乙酸銨-乙腈體系分離效果和響應(yīng)最好，故以此作為流動相，并通過優(yōu)化梯度，10種藥物在15min內(nèi)全部出峰，其總離子流圖詳見圖1。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

質(zhì)譜條件的優(yōu)化用直接接二通方式進行，用0.3mL/min的流速將氨基糖苷類藥物注入電噴霧離子源，進行一級質(zhì)譜分析得到相應(yīng)的分子離子峰，對分子離子峰進行二級質(zhì)譜（子離子）掃描，獲得二級質(zhì)譜信息，然后對裂解電壓及碰撞能進行優(yōu)化，使分子離子和特征子離子強度達到最佳，然后進一步優(yōu)化毛細管電壓，霧化器壓力，干燥器溫度和流速等質(zhì)譜參數(shù)使離子化效率達到最佳，具體參數(shù)見表1。

2.4 線性關(guān)系和檢出限的考察

在本文所確定的色譜和質(zhì)譜條件下，對氨基糖苷類藥物進行測定，用空白基質(zhì)配置一系列濃度分別為20，50，100， 200，500，1 000ng/mL，以目標(biāo)物濃度為橫坐標(biāo)（X），對應(yīng)的響應(yīng)值為縱坐標(biāo)（Y），進行線性回歸，線性回歸方程、線性關(guān)系，檢出限和線性范圍分別見表2。

圖1 氨基糖苷類總離子流圖

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液線性參數(shù)

2.6 方法回收率和精密度驗證

對陰性樣品分別進行3個濃度6次加標(biāo)回收試驗考察回收率和精密度，結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗（n=6）

由表3可知，樣品平均回收率在76.5%～86.9%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3%～4.9%，本方法具有較高的精密度和準(zhǔn)確度。

3 實驗結(jié)論

本文建立了HPLC-MS/MS法測定動物肌肉組織和牛奶中10種氨基糖苷類藥物的的檢測方法。優(yōu)化了前處理提取，凈化，色譜和質(zhì)譜條件，改變了氨基糖苷類抗生素在色譜柱上的保留行為，使氨基糖苷類抗生素與其它內(nèi)源性的干擾物有良好的分離。該方法簡單、靈敏度高、專屬性強在濃度為20～1 000 ng/mL時具有良好的線性和精密度。

[1] 馬彭.用鏈霉素微生物電極測定乳類食品中的鏈霉素[J].現(xiàn)代商檢科技，1996，6（5）：30-31.

[2] 王忠斌.氨基糖苷類藥物多殘留酶聯(lián)免疫分析方法的研究[J].中國食品學(xué)報，2008，8（5）：120-125.

[3] 周曉溪，姚羽.氨基糖苷類抗生素的分析方法進展[J].China pharmacist，2004，7（2）：142-144.

[4] 孫雷，張驪，黃耀凌.超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法檢測動物源食品中8種氨基糖普類藥物殘留等.質(zhì)譜學(xué)報[J]，2009，30（1）：60-64.

Simultaneous determination of muscle tissue and milk by LC-MS-MS Study on Optimization of 10 Kinds of Aminoglycoside Drugs

Ye Lei-hai，Zhong Shi-huan，Ye Jia-ming，Yang Lin，Xu Rong-nian

A method for the determination of spectinomycin，hygromycin B，streptomycin，dihydrostreptomycin，amikacin and kanamycin in animal muscle tissues and milk was established by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，10-aminoglycosides of anthracycline，tobramycin，neomycin and gentamicin.The samples were extracted by trichloroacetic acid and precipitated proteins were purified by HLB solid-phase extraction（SPE）column，separated by SILICA SG80 S5 and analyzed quantitatively in positive ion multiple reaction monitoring mode.The average recoveries were between 70% and 110% with the relative standard deviations（RSDs）of less than 15%，and the detection limits（LOD）were in the range of 0.02～1μg/mL，the correlation coefficient was more than 0.995 and 100，200，300μg/Kg.Mu]g/Kg.The method is simple，rapid and accurate，at the same time，it can avoid the contamination and ion suppression caused by the reagent of heptafluorobutyric acid.

high performance liquid chromatograpHy～tandem mass spectrometry；aminoglycoside；animal muscle tissue and milk

S859.84

A

1003-6490（2016）12-0107-03

2016-11-15

葉磊海（1983-），男，浙江杭州人，工程師，主要從事食品中獸藥及獸藥殘留檢測工作。