丁錦麗，楊菁，李風(fēng)和

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢　430060)

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移植胚胎數(shù)量和輔助孵化對高齡不孕癥患者助孕臨床結(jié)局的影響

丁錦麗，楊菁*，李風(fēng)和

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢430060)

【摘要】目的分析移植胚胎數(shù)量和輔助孵化對高齡婦女助孕結(jié)局的影響，探討減少移植胚胎數(shù)量及取消輔助孵化對這類患者的可行性。方法回顧性分析首次輔助生殖技術(shù)(ART)助孕的高齡患者(35～37歲)的395個周期的臨床資料，根據(jù)是否行激光輔助孵化(LAH)分為LAH組(n=274)和對照組(n=121)，分析兩組患者的受精及胚胎的情況及其妊娠率和種植率的差異。結(jié)果兩組患者年齡、不孕年限、BMI、不孕類型、基礎(chǔ)FSH水平及不孕因素等資料及獲卵數(shù)、受精方式、獲得的優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)及卵裂情況均無顯著差異(P>0.05)；LAH組移植的胚胎數(shù)(2.45±0.50)顯著高于對照組(2.00±0.00)(P<0.001)，但兩組的種植率(28.06% vs. 30.99%)、臨床妊娠率(48.91% vs. 48.76%)、流產(chǎn)率(23.13% vs. 22.03%)、多胎妊娠率(10.94% vs. 9.09%)及新生兒結(jié)局均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；LAH組中移植2枚或3枚胚胎的周期有相似的臨床結(jié)局，但移植3枚者多胎妊娠率有升高趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論對于35～37歲高齡首次助孕且有優(yōu)質(zhì)胚胎移植的患者，建議移植2枚胚胎，且LAH并未改善其臨床結(jié)局。

【關(guān)鍵詞】激光輔助孵化；移植胚胎數(shù)；臨床妊娠率；種植率

(JReprodMed2016，25(1)：16-21)

胚胎的成功著床是一個復(fù)雜的過程，涉及到子宮內(nèi)膜容受性、胚胎質(zhì)量等多方面的因素，其中透明帶的孵化是一個至關(guān)重要的步驟，胚胎孵化的失敗可能是影響輔助生殖技術(shù)(ART)結(jié)局的一個重要因素。輔助孵化人為地破壞透明帶，從而提高ART的胚胎植入能力[1-2]。目前國內(nèi)行胚胎植入前輔助孵化的主要適應(yīng)證有高齡、反復(fù)著床失敗、凍胚周期、卵母細胞體外成熟、透明帶增厚的患者。其中非接觸式激光輔助孵化(LAH)是最常見的方法。關(guān)于輔助孵化對ART結(jié)局的影響還存在爭議，大部分研究認為LAH能改善凍胚周期反復(fù)種植失敗或高齡患者的臨床結(jié)局，提高其種植率及妊娠率[3-4]，且LAH對圍產(chǎn)期結(jié)局沒有不利影響[5]。關(guān)于LAH對新鮮胚胎結(jié)局的影響，有學(xué)者認為其能夠改善年齡≥35歲或多次ART助孕失敗患者的臨床結(jié)局[6-7]，也有研究認為其對臨床結(jié)局沒有顯著的影響[4，8]。也有研究認為，對于年齡≥38歲的患者來說，LAH能明顯改善胚胎的種植率[9-10]。我國衛(wèi)生和計劃生育委員會規(guī)定，對于首次助孕年齡<35歲的患者移植胚胎數(shù)應(yīng)不高于2枚，≥35歲患者移植胚胎數(shù)不高于3枚。目前已有少量關(guān)于年齡≥35歲患者胚胎移植數(shù)量對妊娠結(jié)局影響的報道[11]。國內(nèi)生殖中心對于選擇哪些年齡段女性(首次助孕)的新鮮周期行LAH的意見并不一致。對于年齡介于35～37歲、首次行ART助孕患者來說，是否有必要行LAH，移植多少枚胚胎合適，目前還沒有臨床研究及國家層面的統(tǒng)一指南。本項研究的目的在于分析減少移植胚胎數(shù)量及取消輔助孵化對高齡不孕癥患者助孕臨床結(jié)局的影響，從而為臨床提供參考。

資料與方法

一、研究對象

收集2010年1月至2014年6月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行IVF/ICSI助孕的夫婦的資料。不孕原因包括盆腔及輸卵管、子宮內(nèi)膜異位癥、排卵障礙等女方因素、男方因素及不明原因不孕的患者，不孕時間1～18年。

納入標準：①年齡35～37歲；②首次行ART助孕；③新鮮周期第3天移植2～3枚優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎。排除標準：排除因子宮內(nèi)膜、卵巢過度刺激征、胚胎質(zhì)量等原因而取消移植的周期。

共納入395個周期，根據(jù)是否行激光輔助孵化LAH分為LAH組(n=274)和對照組(n=121)。

二、治療方法回顧

1.卵巢功能評估及促排卵：開始促排前于患者月經(jīng)D2～3檢測基礎(chǔ)FSH水平。采用我中心常規(guī)使用的超長方案、長方案及短方案促排卵[12]。陰道超聲示3個以上直徑≥18 mm的卵泡時，注射5 000～10 000 U的人絨毛膜促性腺激素(HCG，雪蘭諾，瑞士)，注射后36 h在陰超引導(dǎo)下采卵。根據(jù)男方精子質(zhì)量采取自然受精或卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)受精。

2.胚胎質(zhì)量評估：D3對胚胎形態(tài)學(xué)進行分級：≥6個均勻一致的卵裂球且細胞碎片小于20%的胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎[13]。

3.LAH：在D3胚胎形態(tài)學(xué)評估后進行。將微滴放置于顯微鏡視野中央，選擇碎片較集中或卵周間隙大的區(qū)域，輕移載物臺使非接觸式激光(MTG激光破膜儀，德國)對焦于胚胎透明帶，調(diào)整激光發(fā)射量(1 480 nm)，發(fā)射激光削薄透明帶，最終使削薄深度為透明帶厚度的2/3，透明帶形成一個25～30 μm孔徑的開口，然后將胚胎洗滌后移入培養(yǎng)皿[14]。

4.胚胎移植：受精后第3天行胚胎移植，移植后行黃體酮(浙江仙琚藥業(yè))支持治療。我中心對于新鮮周期中年齡≥35歲的患者常規(guī)行LAH，一般移植胚胎3枚。自2013年7月后將常規(guī)LAH年齡界定為≥38歲，且對于年齡<38歲的患者移植2枚胚胎。

所以，本研究中的對照組為2013年7月后接受治療的35～37歲患者，移植胚胎2枚；而LAH組為2013年7月前接受治療者，移植胚胎2或3枚。

三、分析指標及判定標準

比較兩組患者年齡、不孕年限、移植胚胎數(shù)等基礎(chǔ)資料及種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率及新生兒結(jié)局等資料。

胚胎移植后14 d檢測血清β-HCG>10 U/L，2周后B超下見孕囊確定為臨床妊娠。活產(chǎn)率定義為分娩周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；多胎妊娠率定義為多胎妊娠例數(shù)/移植周期數(shù)×100%(本項研究中多胎均為雙胎)。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計量資料結(jié)果以均數(shù)±標準差(±s)表示，計數(shù)資料以率(%)表示。定量資料比較采用t檢驗，定性資料的比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、兩組基礎(chǔ)資料比較

本項研究共納入395個周期，LAH組274周期，對照組121周期。

LAH組原發(fā)不孕夫婦為80對(29.20%)，對照組為37對(30.57%)；LAH組男性不育因素占26.07%，女性因素占87.67%，不明原因占0.70%；對照組男性不育因素、女性因素、不明原因分別占32.77%，90.91%和0.83%。兩組患者的年齡、不孕時間、BMI、不孕類型、基礎(chǔ)FSH水平及不孕原因的資料均無顯著差異(P>0.05)(表1)。

二、兩組患者受精及胚胎情況比較

395個周期促排后共獲卵4 666枚，共受精3 408枚，卵裂率96.00%(3 335/3 408)，LAH組卵裂率為97.76%(2 311/2 366)，對照組卵裂率為98.08%(1 024/1 044)。兩組患者獲卵數(shù)、受精方式、獲得的優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)及卵裂情況均無顯著差異(P>0.05)(表2)。

三、兩組患者的臨床結(jié)局比較

395例患者共移植912枚胚胎，種植率為28.83%(263/912)，臨床妊娠率為48.85%(193/395)。兩組患者平均移植的胚胎數(shù)有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，但兩組的種植率(28.06%vs.30.99%)及臨床妊娠率(48.91% vs. 48.76%)均無顯著差異(P>0.05)，流產(chǎn)率及多胎妊娠率也無顯著差異(23.13% vs. 22.03%、10.94% vs. 9.09%)(P>0.05)(表3)。

表1兩組患者基本資料[x-±s，n(%)]

組 別周期數(shù)年齡(歲)不孕時間(年)BMI(kg/m2)原發(fā)不孕LAH組27435.82±0.826.48±4.1621.96±3.1680(29.20)對照組12135.83±0.806.57±3.7522.13±3.3737(30.57)組 別周期數(shù)基礎(chǔ)FSH(U/L)不育原因*男性因素女性因素不明原因LAH組2747.17±2.2971(26.07)240(87.67)2(0.70)對照組1216.82±2.3239(32.77)110(90.91)1(0.83)

注：*不育原因可兼具多項

表2兩組患者受精及胚胎情況比較[x-±s，n(%)]

組 別周期數(shù)平均獲卵數(shù)(枚)總獲卵數(shù)(枚)IVFICSI卵裂率優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)(枚)LAH組27411.62±4.873185208(75.91)66(24.09)2311(97.76)5.12±2.66對照組12112.24±5.46148186(71.08)35(28.93)1024(98.08)4.74±2.81

表3兩組患者的臨床結(jié)局[x-±s，n(%)]

組 別周期數(shù)平均移植數(shù)(枚)移植數(shù)(枚)種植率臨床妊娠率流產(chǎn)率多胎妊娠率LAH組2742.45±0.50*670188(28.06)134(48.91)31(23.13)30(10.94)對照組1212.00±0.0024275(30.99)59(48.76)13(22.03)11(9.09)

注：與對照組相比，*P<0.01

四、兩組患者的新生兒結(jié)局比較

LAH組活產(chǎn)103個周期，其中30個周期為多胎妊娠，73個周期為單胎妊娠；對照組活產(chǎn)46個周期，11個周期多胎妊娠，35個周期單胎妊娠。LAH組早產(chǎn)率為19.42%(20/103)，對照組為21.74%(10/46)；LAH組低出生體重兒比例為25.24%(26/103)，對照組為23.91%(11/46)。兩組患者的早產(chǎn)率、低出生體重率、妊娠天數(shù)及單胎出生體重和多胎總體重均無顯著差異(P>0.05)(表4)。

五、移植胚胎數(shù)對妊娠結(jié)局的影響

由于組間移植胚胎數(shù)存在顯著差異，為了明確不同移植胚胎數(shù)以及LAH對臨床結(jié)局的影響，我們進一步將研究對象按照移植胚胎數(shù)分組，LAH組中移植2枚胚胎的周期為A組(152例)，3枚胚胎者為B組(122例)，比較A組、B組及對照組的臨床結(jié)局。A組、B組及對照組組間的年齡、不孕年限、BMI、FSH等基礎(chǔ)資料均無顯著差異(P>0.05)。對照組、A組及B組組間臨床妊娠率及多胎妊娠率均無顯著差異(P>0.05)，B組活產(chǎn)率較對照組及A組均有升高趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表5)。

表4兩組患者新生兒結(jié)局比較[x-±s，n(%)]

組 別活產(chǎn)周期數(shù)妊娠時間(d)早產(chǎn)率出生體重(g)單胎多胎低出生體重率LAH組103265.89±13.6620(19.42)3256.16±540.704966.43±1073.4926(25.24)對照組46265.19±16.9810(21.74)3160.29±533.115088.18±894.0611(23.91)

注：早產(chǎn)是指孕周<37周，低出生體重指出生體重<2 500 g

表5不同移植胚胎數(shù)患者的臨床結(jié)局[x-±s，n(%)]

組 別周期數(shù)年齡(歲)不孕時間(年)BMI(kg/m2)原發(fā)不孕基礎(chǔ)FSH(U/L)對照組12135.83±0.806.57±3.7522.13±3.3737(30.58)6.82±2.32A組15235.71±0.686.52±4.2221.99±3.2639(25.66)6.86±2.23B組12235.90±0.846.42±4.0922.00±3.0441(33.61)7.05±2.33組 別周期數(shù)優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)(枚)移植胚胎數(shù)(枚)臨床妊娠率活產(chǎn)率多胎妊娠率對照組1214.74±2.812.00±0.0059(48.36)45(37.19)11(9.09)A組1525.22±2.832.00±0.0073(48.02)55(36.18)16(10.53)B組1224.99±2.433.00±0.0060(49.18)48(39.34)14(11.48)

討論

LAH是否能夠增加胚胎著床的效率迄今仍然存在爭議。透明帶是由糖類、蛋白質(zhì)等組成的包繞在卵子和胚胎外圍的糖蛋白基質(zhì)層。在生理狀態(tài)下，隨著囊胚的擴張透明帶變薄，蛋白水解酶得以釋放以水解透明帶，從而使囊胚孵出，在子宮內(nèi)膜與滋養(yǎng)層細胞的相互作用下完成著床。胚胎孵化的失敗是導(dǎo)致生育能力下降的原因之一[15]。ART過程中體外培養(yǎng)的過程使透明帶變硬、增厚及彈性下降，降低了胚胎孵出的能力，影響臨床結(jié)局[16]。另外，女性年齡的增加也可能降低透明帶的薄化能力，使透明帶變硬，孵出胚胎困難，從而引起胚胎著床失敗[6]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，包括酵素、蛋白酶、振動器和激光等多種技術(shù)已用于輔助孵化[17]，利用激光、化學(xué)或機械的方法使透明帶厚度變薄，促進胚胎從透明帶中孵出。

非接觸式LAH是目前最常用的方法，激光通過顯微鏡經(jīng)液體傳導(dǎo)至透明帶，利用熱效應(yīng)使透明帶發(fā)熱融解。在LAH中通過調(diào)整激光的功率、作用時間及脈沖次數(shù)來控制激光的總能量，達到融解透明帶的目的。激光在透明帶上產(chǎn)生精確的圓柱形小孔，LAH安全、快速、簡便、易于控制的特點使其已成為許多生殖中心的常規(guī)輔助方法[18]，用于反復(fù)著床失敗、高齡、胚胎質(zhì)量較差或凍胚移植的患者[10]。

關(guān)于LAH對ART結(jié)局是否有改善作用，目前還存在爭議。多項研究結(jié)果表明，LAH可能通過機械方式促進孵化過程及允許胚胎與子宮內(nèi)膜早期接觸[19]，從而增加胚胎的著床能力，提高患者的種植率及臨床妊娠率[3，5-7]。然而，杜生榮等[8]的研究結(jié)果表明，LAH并不能明顯改善胚胎的著床能力，因而認為LAH對新鮮D 3 胚胎的結(jié)局沒有明顯的改善。也有研究表明，即使是凍胚周期，LAH對臨床結(jié)局也沒有明顯的改善作用[20]。以年齡介于35～37歲且首次ART助孕的患者為研究對象，我們的結(jié)果表明雖然LAH組D 3移植的優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)顯著高于對照組，但兩組的種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率及新生兒結(jié)局均無顯著差異。因此我們認為，對于這類人群，LAH并不能改善其臨床結(jié)局，這與Valojerdi等[3]、Hageman等[21]報道的輔助孵化并不能改善年齡<38歲患者的臨床結(jié)局這一結(jié)論一致。

研究報道減少移植的胚胎數(shù)可能降低患者的臨床妊娠率[22]。但有研究表明，若患者有足夠的優(yōu)質(zhì)胚胎，移植2枚胚胎對臨床妊娠率沒有很大影響[23]，且不影響35～37婦女的多次IVF-ET的妊娠率[24]，同時也降低了其多胎妊娠的風(fēng)險[11]。黃仲英等[25]的研究表明，35～36歲患者移植2枚及3枚胚胎所獲得的臨床妊娠率沒有差異，但移植3枚胚胎的患者有較高的多胎妊娠率。我們的研究也表明，雖然LAH組移植的胚胎數(shù)顯著高于對照組，但僅移植2枚胚胎的對照組也獲得與LAH組相似的種植率及臨床妊娠率，這與前面學(xué)者的研究結(jié)果一致。美國生殖醫(yī)學(xué)降低多胎妊娠的指南也指出：35～37歲首次IVF-ET助孕時建議移植的卵裂期胚胎數(shù)不超過2個[26]。因此，我們認為對于35～37歲首次助孕且有優(yōu)質(zhì)胚胎移植的患者，建議將移植胚胎數(shù)由3枚降為2枚。

我們的研究結(jié)果表明，LAH組中移植2枚胚胎與3枚胚胎組間臨床妊娠率及活產(chǎn)率沒有顯著差異，即35～37歲的高齡婦女移植2枚或3枚胚胎可獲得相似的臨床結(jié)局，但移植3枚胚胎組有較高的多胎妊娠率；當(dāng)移植胚胎數(shù)均為2枚時，行LAH和對照組的種植率、臨床妊娠率及活產(chǎn)率沒有顯著差異，但LAH組多胎妊娠率有升高趨勢(P>0.05)。有研究表明LAH的激光熱效應(yīng)可能會對胚胎產(chǎn)生一定的影響，動物實驗顯示，1 480 nm的激光二極管對小鼠D 3的胚胎進行孵化處理后，小鼠胚胎植入及植入后的發(fā)育潛能均受到影響[27-29]。目前缺乏關(guān)于LAH熱效應(yīng)對人類新生兒發(fā)育、胎兒畸形等結(jié)果評估的研究[4]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)LAH后的單卵多胎率升高，可能增加婦女圍產(chǎn)期、分娩期及新生兒染色體異常等風(fēng)險[28-30]。因此，必須考慮到行LAH對婦女及子代安全性的影響。

總之，我們的結(jié)果表明，對于年齡介于35～37歲且首次ART助孕、D 3移植優(yōu)質(zhì)胚胎的婦女來說，移植2枚胚胎與移植3枚胚胎有相似的臨床結(jié)局，LAH并未改善其種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率及新生兒結(jié)局。考慮到LAH可能帶來的多胎、發(fā)育異常等潛在風(fēng)險，臨床醫(yī)生在工作中應(yīng)綜合多方面因素進行決策。根據(jù)我們的研究資料建議35～37歲且首次ART助孕的患者移植2枚胚胎，且不建議行LAH。但是，本項研究是一個時間跨度比較大、樣本量較小的回顧性研究，另外，作為一項前后對比的研究(LAH組和對照組有明確的時間先后)，藥物、試劑以及技術(shù)方面的革新也可能對研究結(jié)果存在干擾，因此，其結(jié)論的可靠性還待進一步研究。

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[編輯：陸彩玲]

Effect of number of embryos transferred and laser assisted hatching on clinical outcome in older patients

DINGJin-li，YANGJing*，LIFeng-he

ReproductiveMedicalCenter，RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060

【Abstract】

Objective：To explore the effect of number of embryos transferred and laser assisted hatching (LAH) on the clinical outcome of patients aged 35 to 37 years.

Methods：The data of 395 patients in their first assisted reproductive technology (ART) cycle were analyzed retrospectively. These patients were divided into two groups according to whether applying LAH： LAH group and control group. The clinical outcomes in the two groups were analyzed and compared.

Results：There were no significantly differences in patients’ age，duration of infertility，BMI，infertility type，basal FSH level，the number of oocytes retrieved，fertilization way，number of good quality embryos and cleavage rate (P>0.05). The number of embryo transferred in the LAH group (2.45±0.50) was significantly higher than that in control group (2.00±0.00)(P<0.001)，while implantation rate (28.06% vs. 30.99%)，clinical pregnancy rate (48.91% vs. 48.76%)，abortion rate (23.13% vs. 22.03%)，multiple pregnancy rate (10.94% vs. 9.09%) and newborn outcome were not significantly different (P>0.05). The patients in LAH group had similar clinical outcomes no matter they were transferred 2 or 3 embryos，but the latter had a slightly higher multiple pregnancy rate (P>0.05).

Conclusions：Laser assisted hatching did not improve the clinical outcome of the patients aged 35 to 37 years in their first ART cycle，and transferring two embryos was suggested.

Key words：Laser assisted hatching；Number of embryo transferred；Clinical pregnancy rate；Implantation rate

【作者簡介】丁錦麗，女，貴州遵義人，碩士，生殖內(nèi)分泌專業(yè).(*通訊作者)

【基金項目】國家自然科學(xué)基金(81370767、81401276)

【收稿日期】2015-05-09；【修回日期】2015-06-18

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.1.004