董哲，孫玲，陳志恒，簡悅紅

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心生殖醫(yī)學(xué)中心，廣州　510623)

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以孕酮水平確定凍融胚胎移植時間的臨床研究

董哲，孫玲*，陳志恒，簡悅紅

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心生殖醫(yī)學(xué)中心，廣州510623)

【摘要】目的比較基于排卵監(jiān)測的方案(MOR)與基于孕酮水平監(jiān)測的方案(MPR)確定自然周期凍融胚胎移植(FET)時機的臨床結(jié)局。方法回顧性分析190個自然周期FET的臨床資料。結(jié)果61.1%(116/190) 的周期應(yīng)用MPR方案，38.9%(74/190)為MOR方案；MOR組生化妊娠率為9.5%，同MPR組(1.7%)相比顯著升高(P=0.014)；然而，MPR、MOR組的臨床妊娠率相似，分別為53.4%及51.4%，種植率、持續(xù)妊娠率及活產(chǎn)率的差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。多元Logistic回歸分析顯示移植方案是生化妊娠的獨立影響因素，MPR與生化妊娠呈負相關(guān)[(OR 0.050，95%CI (0.004，0.593)](P=0.018)。結(jié)論在基本情況及周期治療情況相似的患者中，與MOR方案相比，MPR方案進行自然周期FET可能獲得更低的生化妊娠率(即更低的妊娠丟失率)，但仍需進一步研究證實。

【關(guān)鍵詞】凍融胚胎移植；自然周期；方案；孕酮

(JReprodMed2016，25(1)：11-15)

在體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的治療中，一般認為凍融胚胎移植(FET)的妊娠率低于新鮮胚胎移植[1]。然而，F(xiàn)ET也有其優(yōu)勢，比如增加累計妊娠率、減少花費、便于應(yīng)用及同新鮮周期比較有更短的治療周期等特點[2]。生殖醫(yī)學(xué)工作者為了改善FET的結(jié)局開展了大量的工作，其中包括對冷凍技術(shù)的改進如玻璃化冷凍技術(shù)。玻璃化冷凍是一種使用高濃度冷凍劑進行快速冷凍程序的技術(shù)，有助于避免冰晶的形成。玻璃化冷凍的胚胎復(fù)蘇率可達到95%以上[3]，并可減少細胞損傷，使胚胎保持與新鮮胚胎相似的生殖潛能[4]。

FET的成功與兩方面因素密切相關(guān)，即胚胎質(zhì)量與胚胎-子宮內(nèi)膜間的同步化。盡管冷凍技術(shù)的改進極大地提高了FET的妊娠率[5]，但是對如何改善胚胎及子宮內(nèi)膜的同步化仍知之甚少。目前，世界范圍內(nèi)用于FET周期內(nèi)膜準備的方案主要有3種：自然周期、促排卵周期及人工周期。無足夠證據(jù)表明哪種方案更為優(yōu)越，它們的妊娠率無明顯差異[6]。國內(nèi)研究也證實，自然周期與人工周期的妊娠率、種植率間的差異亦無顯著性[7]。然而，無藥物應(yīng)用等特點仍使自然周期得到更為廣泛的應(yīng)用。在自然周期方案中，內(nèi)膜情況及FET時間通常由排卵時間決定。眾所周知，內(nèi)膜的轉(zhuǎn)化程度是由孕酮(P)的濃度和作用時間決定的，P水平才是決定內(nèi)膜容受性的關(guān)鍵因素。因此，是否能夠通過直接監(jiān)測自然周期P水平?jīng)Q定FET時間呢？我們提出了一種新的基于P水平?jīng)Q定自然周期方案FET時間的方法，在本研究中，我們將其臨床結(jié)局與監(jiān)測排卵法自然周期FET進行對比，以評價其臨床效果。

材料與方法

一、研究對象

本研究選取2011年3月至2012年7月在本院生殖醫(yī)學(xué)中心進行自然周期FET治療的婦女為觀察對象，所有婦女在治療前均簽署了知情同意書。

入選標準包括：(1)年齡：25～40歲；(2)月經(jīng)規(guī)律(周期25～34 d)；(3)體外受精治療周期有D3胚胎凍存；(4)第一次凍融胚胎移植；(5)子宮腔未發(fā)現(xiàn)異常；(6)簽署知情同意書。

排除標準：使用睪丸或附睪精子進行體外授精，早卵泡期卵泡刺激素(FSH)≥12 U/L，移植日內(nèi)膜厚度<8 mm及體重指數(shù)(BMI)≥30 kg/m2[8]。

二、自然周期內(nèi)膜準備方案

入選觀察對象根據(jù)治療方案的不同分為兩組，具體治療方案如下：

1.排卵為基礎(chǔ)的自然周期方案(MOR)：從月經(jīng)第8～10日起開始應(yīng)用B超監(jiān)測卵泡發(fā)育，主導(dǎo)卵泡直徑≥14 mm后每日用黃體生成素(LH)試紙(上海凱創(chuàng)生物技術(shù))監(jiān)測尿LH。LH試驗呈陽性第2日如果主導(dǎo)卵泡消失，則認定為排卵日(即D0)，F(xiàn)ET于D3進行。移植日開始給予地屈孕酮片(雅培，荷蘭)10 mg q8h口服。

2.孕酮(P)水平為基礎(chǔ)的自然周期方案(MPR)：從月經(jīng)第10日起，每4日一次監(jiān)測卵泡發(fā)育，此方案不需確定排卵的具體日期。一旦發(fā)現(xiàn)主導(dǎo)卵泡消失，當日即檢測血清P水平。排卵及移植時間定義如下：P≤9.54 nmol/L為排卵日(D0)；9.54 nmol/L

三、FET時機及結(jié)局評價指標

FET治療周期后所有觀察對象均有D3胚胎凍存。胚胎均為玻璃化冷凍并按說明書標準流程復(fù)蘇，采用Jieying thawing培養(yǎng)基 (Jieying Laboratory Inc，加拿大)。胚胎移植均選用標準胚胎移植管 (Wallace，Smith Medical，墨西哥)，在腹部B超引導(dǎo)下進行。根據(jù)年齡、既往進行的移植周期數(shù)及患者意愿等因素，本研究中移植的胚胎數(shù)目為2或3個。優(yōu)質(zhì)胚胎定義為D3胚胎有7或8個大小均勻、形狀相似的卵裂球，碎片<10%，無多核。研究中主要由三名醫(yī)師進行胚胎移植。

妊娠定義為移植后14 d的血清β-HCG檢測為陽性；臨床妊娠定義為移植后4周陰道B超檢查可見妊娠囊；生化妊娠定義為移植后14 d的血清β-HCG檢測為陽性，移植后4周及以后 B超檢查未見妊娠囊；種植率為孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)；持續(xù)妊娠為妊娠持續(xù)至≥12周。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

本研究主要應(yīng)用SPSS13.0軟件(SPSS Inc，美國)進行統(tǒng)計學(xué)分析。使用Kolmogorov-Smirnov檢驗對連續(xù)變量進行正態(tài)分布檢驗。連續(xù)變量采用均值±標準差描述。根據(jù)正態(tài)分布情況，連續(xù)變量間的差異由t檢驗或Mann-Whitney 檢驗確定。分類變量間的差異由Pearson’sχ2檢驗確定。多元因素Logistic回歸分析用來確定FET方案與生化妊娠間的相關(guān)因素，使用Waldχ2檢驗對回歸模型進行檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

共190個觀察對象(190個移植周期)納入本研究。MOR組74例(38.9%)，MPR組116例(61.1%)。

一、MOR組和MPR組臨床基本情況的比較

兩組病例在年齡、BMI、基礎(chǔ)FSH及不育因素間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性(表1)。

二、MOR組和MPR組IVF周期及FET周期的治療情況

兩組的促性腺激素(Gn)用量、HCG日雌二醇(E2)水平、卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)周期的比例、受精率、冷凍胚胎數(shù)、復(fù)蘇胚胎數(shù)、移植胚胎數(shù)、移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)及移植日內(nèi)膜厚度等指標均無顯著性差異(P>0.05)，兩組輔助孵化的使用率均為100%(表2)。

三、MOR及MPR組FET周期的臨床結(jié)局

兩組間的臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率及種植率均無顯著性差異(P>0.05)，但MPR組的生化妊娠率顯著低于MOR組(1.7% vs. 9.5%，P<0.05)(表3)。

四、生化妊娠的多元因素Logistic回歸分析

為了進一步確定FET方案與生化妊娠之間的相關(guān)因素，使用了多元因素Logistic回歸分析。校正混雜因素后，MPR顯示出了與生化妊娠間的負相關(guān)關(guān)系，比值比(OR)為0.050，95%CI為 0.004～0.593(P=0.018)。此外，BMI顯示出了與生化妊娠間的正相關(guān)關(guān)系(P=0.031)(表4)。

表1兩組基本情況的比較 [x-±s，n(%)]

組 別例數(shù)年齡(歲)BMI(Kg/m2)基礎(chǔ)FSH(U/L)不育因素輸卵管因素男方因素內(nèi)異癥雙方因素不明原因MOR組7431.92±0.5220.84±0.265.31±0.1547(63.5)15(20.3)8(10.8)3(4.1)1(1.3)MPR組11632.29±0.4021.04±0.285.42±0.1164(55.2)37(31.8)11(9.5)4(3.5)0

注：兩組比較，P均>0.05。

表2兩組的體外受精治療周期情況的比較[x-±s，n(%)]

組 別例數(shù)Gn總量(U)HCG日E2水平(pmol/L)ICSI輔助孵化受精率冷凍胚胎數(shù)MOR組741945.95±96.8411525.10±717.8316(21.6)74(100.0)0.67±0.027.43±0.56MPR組1162066.41±80.309817.23±453.5429(25.0)116(100.0)0.72±0.016.90±0.44組 別例數(shù)復(fù)蘇胚胎數(shù)復(fù)蘇率移植胚胎數(shù)移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)移植日內(nèi)膜厚度(mm)MOR組742.36±0.080.97±0.012.27±0.070.97±0.1110.58±0.14MPR組1162.27±0.060.97±0.012.09±0.050.85±0.0810.76±0.21

注：兩組比較，P均>0.05

表3兩組的FET治療周期臨床結(jié)局的比較(n(%)]

組 別例數(shù)臨床妊娠率生化妊娠率異位妊娠率種植率持續(xù)妊娠率活產(chǎn)率MOR組7438(51.4)7(9.5)2(2.7)55/168(32.7)32(43.2)29(39.1)MPR組11662(53.4)2(1.7)*6(5.2)75/239(31.3)49(42.2)45(38.8)

注：與MOR組比較，*P<0.05

表4生化妊娠的多元因素Logistic回歸分析

相關(guān)因素OR95%CIP年齡0.8750.730~1.047>0.05BMI1.3071.024~1.6690.031移植胚胎數(shù)0.6160.133~2.859>0.05移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)1.3840.615~3.114>0.05移植日內(nèi)膜厚度0.7690.411~1.438>0.05治療方案(MPR)0.0500.004~0.5930.018

討論

在FET方案中，自然周期的應(yīng)用十分廣泛[8]。因P的濃度及作用時間在內(nèi)膜的轉(zhuǎn)化及種植前準備中發(fā)揮了最為關(guān)鍵的作用，故我們提出了這種通過檢測排卵后血清P水平確定FET時機的方法。這種方法的關(guān)鍵是如何確定P的界值。通過文獻得知，自然周期中，排卵日的P升高并不顯著，D1的P水平也在 9.54 nmol/L以下；隨后，P水平逐漸升高，D2的P水平在9.54～19.08 nmol/L；D3的P水平約19.08～25.44 nmol/L；D4的P水平升至25.44～31.8 nmol/L[9]。本研究連續(xù)監(jiān)測月經(jīng)周期正常的志愿者的血清P水平，也得到了相似結(jié)果。

在MPR方案中，我們設(shè)定P≤9.54 nmol/L為排卵日(D0)，9.54 nmol/L

為了證實MPR方法的有效性，我們將MPR治療患者的結(jié)局與MOR組進行比較。本研究結(jié)果提示，在基本情況及周期治療情況具有可比性的患者中，MPR治療可以獲得與MOR相似的臨床結(jié)局。兩組的臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率及種植率無顯著性差異。表明MPR在確定FET時機方面具有與傳統(tǒng)MOR法相似的效果。事實上，兩種治療方法確定的移植時間并不完全一致，但是相似的結(jié)局可能提示內(nèi)膜的容受性是一段時間而不是特定的時間點。既往的研究也發(fā)現(xiàn)胚胎的種植窗從P作用的48 h以后開始，并可能持續(xù)4 d[11]。

盡管沒有證據(jù)支持MPR方案優(yōu)于MOR方案，但是MOR組有著更高的生化妊娠率。多元因素回歸分析也顯示MPR是降低生化妊娠的獨立因素。MPR可能有助于降低生化妊娠率。通常認為只有生化妊娠(而無臨床妊娠)意味著胚胎著床的失敗[12]，由于兩種治療方法確定的移植時間并不完全一致，使移植時內(nèi)膜的轉(zhuǎn)化程度也不盡相同，這可能導(dǎo)致了子宮內(nèi)膜的容受性及胚胎著床結(jié)局的差異，即兩組生化妊娠率的差異可能是由移植方案確定的移植時機不同引起的。BMI是另外一個影響生化妊娠率的因素，雖然具體原因仍不清楚，但是已有研究發(fā)現(xiàn)過高或過低的BMI均與FET后流產(chǎn)相關(guān)[13-14]。

雖然我們未能證實MPR在治療結(jié)局上的優(yōu)越性，但是與MOR相似的妊娠率及以下優(yōu)點使其更具應(yīng)用價值：首先，MPR可能發(fā)現(xiàn)一些潛在的黃體功能不全患者。在治療中我們發(fā)現(xiàn)個別患者在B超確定排卵后P不出現(xiàn)升高，隔日再次檢測P水平上升仍不明顯，甚至無上升。這種現(xiàn)象可能是黃體功能不全的一種表現(xiàn)，而MPR可以篩選出這類患者，并于下個周期可采用人工周期FET，避免移植后的不良結(jié)局。其次，即使發(fā)生未破裂卵泡黃素化，MPR仍可決定移植時機。通常發(fā)生未破裂卵泡黃素化時，MOR很難確認排卵時機，從而增加了FET的周期取消率，而只要P水平達到設(shè)定值，MPR仍能通過P水平確定移植時機。最后，MPR方法方便了患者。患者不再需要頻繁來到醫(yī)院密切監(jiān)測卵泡生長，只要確定有優(yōu)勢卵泡發(fā)育且排卵即可通過一次血清檢測確定移植時機。

越來越多的研究表明，新鮮周期的分泌前期內(nèi)膜處于“亢進”的狀態(tài)[15]，并不適合胚胎的種植。同Gn刺激下的新鮮周期內(nèi)膜相比，F(xiàn)ET周期的內(nèi)膜更易于控制[16]，因此FET周期中胚胎及內(nèi)膜發(fā)育的同步化將更有利于妊娠。不同于以往的認識，近期的隨機對照研究同樣證實，F(xiàn)ET周期的妊娠率顯著高于新鮮周期移植[17]，且FET可能有助于改善持續(xù)妊娠率及IVF治療的結(jié)局[18]。這些事實都提示，F(xiàn)ET可能是進一步提高IVF治療效果的有效手段，而我們的研究旨在尋找更合適的FET時機，并為提高FET臨床結(jié)局提供新的思路。

在自然周期FET的患者中，通過使用MPR可以獲得與MOR相似的臨床妊娠率及持續(xù)妊娠率，但MPR可能有助于降低只有生化妊娠(而無臨床妊娠)，即降低妊娠丟失率。目前，我們的研究暫無充分證據(jù)表明MPR與MOR的優(yōu)劣性，故仍需要擴大樣本量得出進一步結(jié)論。然而，MPR在應(yīng)用中也顯示了自身的一些優(yōu)點，本結(jié)果為進一步開展P為基礎(chǔ)的自然周期FET方案提供了依據(jù)。

【參考文獻】

[1]Andersen AN，Goossens V，F(xiàn)erraretti AP，et al. Assisted reproductive technology in Europe，2004： results generated from European registers by ESHRE[J]. Hum Reprod，2008，23：756-771.

[2]de Mouzon J，Goossens V，Bhattacharya S，et al. Assisted reproductive technology in Europe，2007： results generated from European registers by ESHRE[J]. Hum Reprod，2012，27：954-966.

[3]Balaban B，Urman B，Ata B，et al. A randomized controlled study of human day 3 embryo cryopreservation by slow freezing or vitrification： vitrification is associated with higher survival，metabolism and blastocyst formation[J]. Hum Reprod，2008，23：1976-1982.

[4]Fahy GM，MacFarlane DR，Angell CA，et al. Vitrification as an approach to cryopreservation[J]. Cryobiology，1984，21：407-426.

[5]Kuleshova LL，Lopata A. Vitrification can be more favorable than slow cooling[J]. Fertil Steril，2002，78：449-454.

[6]Ghobara T，Vandekerckhove P. Cycle regimens for frozen-thawed embryo transfer[J/CD]. Cochrane Database Syst Rev，2008：CD003414.

[7]唐慧珍，高士友，鄧朝暉，等. 三種內(nèi)膜準備方案在凍融胚胎移植中的結(jié)局分析[J]. 生殖醫(yī)學(xué)雜志，2015，24：236-239.

[8]Lo JC，F(xiàn)eigenbaum SL，Yang J，et al. Epidemiology and adverse cardiovascular risk profile of diagnosed polycystic ovary syndrome[J]. J Clin Endocrinol Metab，2006，91：1357-1363.

[9]Chang EM，Han JE，Kim YS，et al. Use of the natural cycle and vitrification thawed blastocyst transfer results in better in-vitro fertilization outcomes： cycle regimens of vitrification thawed blastocyst transfer[J]. J Assist Reprod Genet，2011，28：369-374.

[10]Rabe T，Diedrich K，Strowitzki T，eds. Manual on assisted reproduction.2ndupdated edition[B]. Berlin： Springer-Verlag，2000：262-263.

[11]Prapas Y，Prapas N，Jones EE，et al. The window for embryo transfer in oocyte donation cycles depends on the duration of progesterone therapy[J]. Hum Reprod，1998，13：720-723.

[12]Lenton EA，Woodward AJ. The endocrinology of conception cycles and implantation in women[J]. J Reprod Fertil Suppl，1988，36：1-15.

[13]Veleva Z，Tiitinen A，Vilska S，et al. High and low BMI increase the risk of miscarriage after IVF/ICSI and FET[J]. Hum Reprod，2008，23：878-884.

[14]Lashen H，F(xiàn)ear K，Sturdee DW. Obesity is associated with increased risk of first trimester and recurrent miscarriage： matched case-control study[J]. Hum Reprod，2004，19：1644-1646.

[15]Devroey P，Bourgain C，Macklon NS，et al. Reproductive biology and IVF： ovarian stimulation and endometrial receptivity[J]. Trends Endocrinol Metab，2004，15：84-90.

[16]Shapiro BS，Daneshmand ST，Garner FC，et al. Contrasting patterns in in vitro fertilization pregnancy rates among fresh autologous，fresh oocyte donor，and cryopreserved cycles with the use of day 5 or day 6 blastocysts may reflect differences in embryo-endometrium synchrony[J]. Fertil Steril，2008，89：20-26.

[17]Shapiro BS，Daneshmand ST，Garner FC，et al. Evidence of impaired endometrial receptivity after ovarian stimulation for in vitro fertilization： a prospective randomized trial comparing fresh and frozen-thawed embryo transfer in normal responders[J]. Fertil Steril，2011，96：344-348.

[18]Aflatoonian A，Oskouian H，Ahmadi S，et al. Can fresh embryo transfers be replaced by cryopreserved-thawed embryo transfers in assisted reproductive cycles? A randomized controlled trial[J]. J Assist Reprod Genet，2010，27：357-363.

[編輯：宋濟范]

Schedule frozen-thawed embryo transfer by monitoring progesterone level

DONGZhe，SUNLing*，CHENZhi-Heng，JIANYue-Hong

ReproductiveMedicineCenter，GuangzhouWomen&Children’sMedicalCenter，Guangzhou510623

【Abstract】

Objective： To compare the clinical outcomes of frozen-thawed embryo transfer (FET) in nature cycle by utilizing monitoring ovulation regimen (MOR) or progesterone level regimen (MPR).

Methods： The clinical data of one hundred and ninety FET cycles between 2011 and 2012 were retrospectively analyzed.

Results： MPR was used in 61.1% (116/190) of the cycles and MOR in 38.9% (74/190). There was a significantly higher biochemical pregnancy rate in the MOR group (9.5%) compared with the MPR group (1.7%) (P=0.014). However，the clinical pregnancy rate was similar in the two groups (51.4% and 53.4%，respectively). No differences were found in the implantation rate，ongoing pregnancy rate and live birth rate between the two groups (P>0.05). A logistic regression analysis showed that the regimen was the independent prognostic factors for biochemical pregnancy，and MPR was negatively correlated with biochemical pregnancy (OR0.050，95%CI0.004-0.593；P=0.018).

Conclusions： When the basic conditions are similar，MPR might obtain significantly lower biochemical pregnancy rate compared with MOR. The conclusion needs further investigation to confirm.

Key words：Frozen-thawed embryo transfer；Natural cycle；Regimen；Progesterone

【作者簡介】董哲，女，黑龍江鶴崗人，博士，住院醫(yī)師，生殖醫(yī)學(xué)專業(yè).(*通訊作者，Email：sunling2009@hotmail.com)

【基金項目】廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技一般引導(dǎo)項目(20141A011032)

【收稿日期】2015-06-08；【修回日期】2015-07-27

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.1.003