白麗娟，王繼禹，徐 勇，王 艷，張克讓，武克文*

(1.山西省榮軍精神康寧醫(yī)院，山西 太谷 030800；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，山西 太原 030001

論著·臨床

cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因與中國(guó)北方漢族人群精神分裂癥關(guān)聯(lián)研究

白麗娟1，王繼禹1，徐 勇2，王 艷1，張克讓2，武克文1*

(1.山西省榮軍精神康寧醫(yī)院，山西 太谷 030800；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，山西 太原 030001

目的 探討cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因多態(tài)性與中國(guó)北方漢族人群精神分裂癥之間的關(guān)系。方法 據(jù)《精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)(第4版)》(DSM-IV)診斷標(biāo)準(zhǔn)收集山西省榮軍精神康寧醫(yī)院和山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院精神衛(wèi)生科門診及住院部符合精神分裂癥診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者為研究組，同期收集符合入組標(biāo)準(zhǔn)且不符合排除標(biāo)準(zhǔn)的健康成年人為對(duì)照組，運(yùn)用連接酶檢測(cè)-聚合酶連鎖反應(yīng)(LDR-PCR)方法檢測(cè)1 230例精神分裂癥患者和1 120例健康成年人的CREB基因上單核苷酸多態(tài)性(SNP)rs6740584及rs10932201的等位基因和基因型分布情況，確定其與精神分裂癥是否相關(guān)。結(jié)果 rs6740584位點(diǎn)的基因型和等位基因在研究組和對(duì)照組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.236，P=0.266；χ2=2.720，P=0.257)；rs10932201位點(diǎn)的基因型和等位基因在研究組和對(duì)照組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.017，P=0.156；χ2=3.779，P=0.151)；兩組rs6740584與rs10932201在不同模型下的頻率分布均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 CREB基因rs6740584及rs10932201多態(tài)性與中國(guó)北方漢族人群精神分裂癥無關(guān)聯(lián)。

cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白；精神分裂癥；基因多態(tài)性

精神分裂癥病因復(fù)雜，到目前為止其發(fā)病危險(xiǎn)因素尚未完全闡明，有研究認(rèn)為大腦神經(jīng)發(fā)育障礙導(dǎo)致腦內(nèi)存在微小的病理變化是發(fā)病的基礎(chǔ)；遺傳和環(huán)境因素在精神分裂癥的發(fā)病過程中起重要作用[1]。盡管病因復(fù)雜，但識(shí)別其可疑遺傳因素及生物環(huán)路仍顯得尤為重要。

轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(Cyclic adenosine monophosphate response element binding protein，CREB)于1986年被Montminy等[2-3]發(fā)現(xiàn)，并從未分化的PC12細(xì)胞及小鼠腦組織中獲取[4]。磷酸化的CREB可增強(qiáng)多種靶基因的表達(dá)[5]，CREB基因位于2q34，是DNA活性轉(zhuǎn)錄因子家庭中的成員，被認(rèn)為是神經(jīng)元總的存活程序的可能調(diào)節(jié)物，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用，動(dòng)物研究顯示CREB在長(zhǎng)時(shí)記憶形成中發(fā)揮重要作用[6]。1999年Kawanishi等[7]發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者CREB基因存在兩個(gè)突變位點(diǎn)(-933T→C和-413G→A)，這兩個(gè)位點(diǎn)分別位于啟動(dòng)子區(qū)域，攜帶-933T→C位點(diǎn)的患者除具有一般臨床表現(xiàn)外，還具有一些特殊癥狀，說明該突變位點(diǎn)可能會(huì)影響基因功能。Forero等[8]綜合各種生物實(shí)驗(yàn)和證據(jù)識(shí)別可能參與cAMP/PKA/CREB功能環(huán)路的可疑基因，通過對(duì)CREB等7種基因的48個(gè)單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNP)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，CREB基因與精神分裂癥無關(guān)聯(lián)，但目前有研究發(fā)現(xiàn)在雙相障礙及精神分裂癥患者中CREB功能異常，Ren等[9]對(duì)大腦前額葉皮層及扣帶回區(qū)域的CREB蛋白、mRNA的表達(dá)及功能進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示精神分裂癥患者大腦扣帶回CREB蛋白、mRNA的表達(dá)及功能均低于對(duì)照組，提示大腦扣帶回CREB異常可能與精神分裂癥有關(guān)。由此推測(cè)CREB基因也可能參與了CREB功能異常過程，可能與精神分裂癥相關(guān)。目前關(guān)于CREB基因多態(tài)性與精神分裂癥關(guān)聯(lián)的研究報(bào)道很少，為進(jìn)一步探討CREB基因多態(tài)性與精神分裂癥的相關(guān)性進(jìn)行本研究。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

研究組為2012年1月-2014年6月在山西省榮軍精神康寧醫(yī)院住院部、山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院門診及住院部就診的精神分裂癥患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合《精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)(第4版)》(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, fourth edition, DSM-IV)精神分裂癥診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡18～55歲；③中國(guó)漢族；④陽性和陰性癥狀量表(Positive and Negative Syndrome Scale，PANSS)評(píng)分≥60分；⑤患者本人及其監(jiān)護(hù)人對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有嚴(yán)重的軀體或神經(jīng)系統(tǒng)疾病者；②軀體疾病或神經(jīng)系統(tǒng)疾病所致精神障礙者；③物質(zhì)濫用或依賴者。符合入組標(biāo)準(zhǔn)且不符合排除標(biāo)準(zhǔn)共1 230例，其中男性739例(60.08%)，女性491例(39.92%)；平均年齡(47.3±11.6)歲。對(duì)照組為2012年1月-2013年12月在山西省榮軍精神康寧醫(yī)院及山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院招募的健康成年人，包括正常志愿者、與患者無血緣關(guān)系的家屬、實(shí)習(xí)生及醫(yī)院職工。入組標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～55歲；②對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有精神疾病史者；②有重大軀體疾病史以及藥物濫用史者。符合入組標(biāo)準(zhǔn)且不符合排除標(biāo)準(zhǔn)共1 120例，其中男性633例(56.52%)，女性487例(43.48%)；平均年齡(45.2±10.1)歲。兩組性別(t=-1.941，P>0.05)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，年齡(t=-4.682，P<0.01)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)山西省榮軍精神康寧醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

所有受試者的血樣標(biāo)本全部采用K2EDTA導(dǎo)管進(jìn)行收集。使用血樣DNA提取工具(Tiangen Biotech，中國(guó)北京)從150 uL外周血中提取基因組DNA，提取結(jié)束后將DNA標(biāo)本保存于-80°超低溫冰箱用于基因型分析。

1.2.2 選擇檢測(cè)位點(diǎn)

通過查詢NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，查到CREB中等位基因頻率>0.30的SNP(rs6740584、rs10932201)，且該位點(diǎn)在中國(guó)人群中已有研究。

1.2.3 SNP基因分型

每個(gè)SNP的基因型使用上海Biowing Applied Biotechnology Co.Ltd(www.biowing.com.cn) 連接酶檢測(cè)-聚合酶連鎖反應(yīng)Ligase Detection Reaction-Polymerase Chain Reaction(LDR-PCR)方法。從臨床樣本中提取的DNA首先通過多樣化的PCR方法獲得PCR產(chǎn)物，包含所要測(cè)序的SNP位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物和LDR探針被用于進(jìn)行多樣化的LDR反應(yīng)，之后通過DNA序列分析儀檢測(cè)得到產(chǎn)物。為了檢測(cè)這個(gè)操作的有效性，大約10%的樣本被隨機(jī)抽取后使用相同的步驟進(jìn)行重測(cè)，結(jié)果顯示重測(cè)樣本與大樣本的結(jié)果一致。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用PLINK統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件(http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink)進(jìn)行Hardy-Weinberg equilibrium(HWE)檢測(cè)、病例組和對(duì)照組基因型及等位基因頻率計(jì)算，采用SPSS 17.0軟件對(duì)病例組及對(duì)照組多態(tài)性位點(diǎn)不同模型進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.1 H-W平衡檢驗(yàn)

rs6740584(χ2=2.174、χ2=0.048)、rs10932201(χ2=0.523、χ2=0.838)多態(tài)性在研究組和對(duì)照組均符合H-W平衡(P均>0.05)。

2.2 兩組rs6740584基因型和等位基因頻率比較

研究組與對(duì)照組rs6740584位點(diǎn)的基因型比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，等位基因頻率兩組比較差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組CREB rs6740584基因型和等位基因頻率比較

注：C為胞嘧啶，T為胸腺嘧啶

2.3 兩組rs6740584顯性及隱性模型下頻率比較

研究組與對(duì)照組CC+CT/TT模型頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，CC/CT+TT模型頻率兩組比較差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組CREB rs6740584不同模型下比較

注：C為胞嘧啶，T為胸腺嘧啶

2.4 兩組rs10932201基因型和等位基因頻率比較

研究組與對(duì)照組rs10932201位點(diǎn)的基因型比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，等位基因頻率兩組比較差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組CREB rs10932201基因型和等位基因頻率比較

注：A為腺嘌呤，G為鳥嘌呤

2.5 兩組rs10932201顯性及隱性模型下頻率比較

研究組與對(duì)照組AA+AG/GG模型頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，AA/AG+GG模型頻率兩組比較差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

3 討 論

CREB是胞內(nèi)與抑郁相關(guān)的幾個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個(gè)交匯點(diǎn)[10-11]，環(huán)磷酸腺苷(cAMP)通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路、鈣依賴蛋白激酶(CaMK)通路和葡萄糖合激酶3(GSK-3)通路形成了CREB的4條上游通路，這4條通路最終調(diào)節(jié)其下游通路的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)等基因的表達(dá)，影響神經(jīng)元的可塑性及神經(jīng)遞質(zhì)的合成[12]。CREB作為一種真核生物細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控因子，在神經(jīng)元再生、突觸可塑性及學(xué)習(xí)記憶等方面具有重要調(diào)節(jié)作用，CREB被認(rèn)為與早期海馬祖細(xì)胞分化、存活和遷移有關(guān)[20-21]。

1999年Kawanishi等[7]發(fā)現(xiàn)攜帶CREB-933T→C突變位點(diǎn)的精神分裂癥患者除具有一般臨床表現(xiàn)外，還具有一些特殊癥狀。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是rs6740584還是rs10932201，其基因型和等位基因頻率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，之后研究人員建立顯性模型與隱性模型進(jìn)行比較，同樣未發(fā)現(xiàn)任何陽性結(jié)果，這與Forero等[8]的研究結(jié)果基本一致。本研究在一定程度上表明中國(guó)北方漢族人群精神分裂癥可能與CREB基因多態(tài)性無關(guān)，而與發(fā)病過程中的其他影響因素有關(guān)，由于本研究設(shè)計(jì)之初是為了證實(shí)CREB基因多態(tài)性是否與精神分裂癥自殺行為相關(guān)，經(jīng)查閱文獻(xiàn)未發(fā)現(xiàn)-933T→C突變位點(diǎn)與自殺行為相關(guān)，故未對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行研究，在未來的研究中我們將進(jìn)一步研究是否攜帶CREB-933T→C突變位點(diǎn)的中國(guó)人群也具有上述特殊癥狀。

表4 兩組CREB rs10932201不同模型下比較

注：A為腺嘌呤，G為鳥嘌呤

眾多神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均能交匯并參與誘導(dǎo)CREB的激活，且CREB的總蛋白量能被某些外界因素調(diào)節(jié)，例如應(yīng)激因素或某些人為刺激因素[13-15]，而僅有磷酸化的CREB(phospho-CREB，pCREB) 方能作為轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮作用。CREB蛋白含有許多磷酸化位點(diǎn)，其中Ser-133的磷酸化位點(diǎn)尤為重要，當(dāng)CREB蛋白的Ser-133點(diǎn)突變時(shí)，將導(dǎo)致CREB蛋白的失活[16]。除此之外Lee等[17]研究發(fā)現(xiàn)抗抑郁藥對(duì)CREB磷酸化也有影響。CREB分子中與其轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)的功能結(jié)構(gòu)域包括KID區(qū)、X區(qū)、α區(qū)、Q1區(qū)、Q2區(qū)，其中KID區(qū)含有大量蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，因此，KID區(qū)的磷酸化是CREB活化的關(guān)鍵，并且僅在CREB活化后通過暴露Q1和Q2區(qū)，才能誘導(dǎo)相關(guān)目的基因轉(zhuǎn)錄的發(fā)生[22]。

既往研究發(fā)現(xiàn)精神分裂癥及雙相情感障礙患者CREB蛋白功能存在異常，Ren等[9]在既往研究基礎(chǔ)上對(duì)CREB在精神分裂癥及雙相情感障礙患者背外側(cè)前額葉皮質(zhì)和扣帶回區(qū)域的mRNA及CREDNA表達(dá)及功能進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者扣帶回CREB、mRNA及CREDNA表達(dá)下降。動(dòng)物模型顯示DISC1(Disrupted in Schizophrenia 1)作為內(nèi)表型與精神分裂癥相關(guān)[18]，進(jìn)一步研究顯示敲除DISC1后使CREB蛋白活性增強(qiáng)[19]。

綜上所述，CREB活化受許多因素影響，精神分裂癥腦區(qū)蛋白表達(dá)下降可能與應(yīng)激、外界刺激和DNA甲基化等因素有關(guān)，今后將進(jìn)一步了解可能影響CREB表達(dá)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的因素，深入了解其內(nèi)在機(jī)制，繼續(xù)探索精神分裂癥發(fā)病機(jī)理，為其早期預(yù)防奠定基礎(chǔ)。

[1] Owen MJ. Implications of genetic findings for understanding schizophrenia[J]. Schizophr Bull, 2012, 38(5): 904-907.

[2] Montminy MR, Bilezikjian LM. Binding of a nuclear protein to the cyclic-AMP response element of the somatostatin gene[J]. Nature, 1987, 328(6126): 175-178.

[3] Yamamoto KK, Gonzalez GA, Biggs WH, et al. Phosphorylation-induced binding and transcriptional efficacy of nuclear factor CREB[J]. Nature, 1988, 334(6182): 494-498.

[4] 宋海龍, 鄭焱, 王曉民. CREB信號(hào)通路在神經(jīng)系統(tǒng)中的調(diào)控及功能[J]. 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 29(9): 797-804.

[5] 余瑞元, 王燕峰, 徐長(zhǎng)法. CREB研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)生物工程雜志, 2003, 23(1): 39-42.

[6] 葛軍, 張玉, 鄭增長(zhǎng), 等. CREB轉(zhuǎn)錄因子及其磷酸化信號(hào)通路的研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38(30): 16769-16771, 16774.

[7] Kawanishi Y, Harada S, Tachikawa H, et al. Novel variants in the promoter region of the CREB gene in schizophrenic patients[J]. J Hum Genet, 1999, 44(6): 428-430.

[8] Forero DA, Herteleer L, De Zutter S, et al. A network of synaptic genes associated with schizophrenia and bipolar disorder[J]. Schizophr Res, 2016, 172(1-3): 68-74.

[9] Ren X, Rizavi HS, Khan MA, et al. Alteration of cyclic-AMP response element binding protein in the postmortem brain of subjects with bipolar disorder and schizophrenia[J]. J Affect Disord, 2014, 152-154: 326-333.

[10] 劉紀(jì)猛, 李恒芬, 謝正. 抑郁模型大鼠中樞G蛋白的研究[J]. 中國(guó)神經(jīng)精神疾病雜志, 2009, 35(2): 108-110.

[11] Nibuya M, Nestler EJ, Duman RS. Chronic antidepressant administration increases the expression of cAMP response element binding protein (CREB) in rat hippocampus[J]. J Neurosci, 1996, 16(7): 2365-2372.

[12] 盧峻, 楊秀巖, 華茜, 等. CAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白: 抗抑郁信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交匯點(diǎn)[J].生理科學(xué)進(jìn)展, 2008, 39(4): 371-374.

[13] Stern CM, Meitzen J, Mermelstein PG. Corticotropin-releasing factor and urocortin I activate CREB through functionally selective G beta gamma signaling in hippocampal pyramidal neurons[J]. Eur J Neurosci, 2011, 34(5): 671- 681.

[14] 王凌霄, 彭代輝, 黃建華, 等. CREB磷酸化水平在慢性應(yīng)激模型大鼠中表達(dá)研究[J]. 中國(guó)神經(jīng)精神疾病雜志, 2014, 40(1): 26-30.

[15] 林棟, 賴新生, 張宏, 等. 基于多元統(tǒng)計(jì)分析的針刺效應(yīng)對(duì)不同腦區(qū)CREB/p-CREB表達(dá)時(shí)空分布特征分析[J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2014, 29(10): 3286-3291.

[16] Lamph WW, Dwarki VJ, Ofir R, et al. Negative and positive regulation by transcription factor cAMP response element- binding protein is modulated by phosphorylation[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87(11): 4320-4324.

[17] Lee MG, Oh D, Choi MR, et al. NCAM140 and pCREB Expression after Tianeptine Treatment of SH-SY5Y Cells[J]. Psychiat Invest, 2014, 11(3):313-318.

[18] Kelly MP, Brandon NJ. Taking a bird's eye view on a mouse model review: a comparison of findings from mouse models targeting DISC1 or DISC1-interacting proteins[J]. Future Neurol, 2011, 6(5): 661-677.

[19] Wei J, Graziane NM, Wang H, et al. Regulation of N-Methyl-D-Aspartate Receptors by Disrupted-in-Schizophrenia-1[J]. Biol Psychiatry, 2014, 75(5): 414-424.

[20] Merz K, Herold S, Lie DC. CREB in adult neurogenesis-master and partner in the development of adult-born neurons?[J]. Eur J Neurosci, 2011, 33(6): 1078-1086.

[21] Kandel ER. The molecular biology of memory: CAMP, PKA, CRE, CREB-1, CREB-2, and CPEB[J]. Mol Brain, 2012, 5: 14.

[22] Alberini CM. Transcription factors in long-term memory and synaptic plasticity[J]. Physiol Rev, 2009, 89(1): 121-145.

(本文編輯：陳 霞)

Association between a polymorphism in the promoter region of the cAMP (response element binding protein) gene and schizophrenia in north han Chinese patients

BaiLijuan1,WangJiyu1,XuYong2,WangYan1,ZhangKerang2,WuKewen1*

(1.ShanxiRongjunPsychiatricCorelleHospital,Taigu030800,China; 2.FirstHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China

*Correspondingauthor:WuKewen,E-mail:sxtgwkw@126.com)

Objective To explore the association between a polymorphism in the promoter region of the cAMP (response element binding protein) gene and schizophrenia in north han Chinese patients.Methods Recruited inpatients and outpatients who conform to the diagnostic criteria of schizophrenia with DSM-IV from Shanxi Rongjun Psychiatric Corelle Hospital and First Hospital of Shanxi Medical University were study group, at the same time, collected health adults formed the control group. Ligase Detection Reaction-Polymerase Chain Reaction (LDR-PCR) was used to detect the rs6740584 and rs10932201 polymorphism of CREB in 1 230 schizophrenia patients and 1 120 health adults. The allele, genotype distribution and different model of CREB gene SNP were detected to determine the association between CREB and schizophrenia.Results No significant distribution difference of the genotype and allele of rs6740584 and rs10932201 of CREB were found between two groups (χ2=1.236,P=0.266;χ2=2.720,P=0.257;χ2=2.017,P=0.156;χ2=3.779,P=0.151).Conclusion No association is found between CREB SNP rs6740584 or rs10932201 and schizophrenia in north han Chinese population sample.

Cyclic adenosine monophosphate response element binding protein; Schizophrenia; Gene polymorphism

優(yōu)撫醫(yī)院部級(jí)課題(2012MZBAJ030)；山西省衛(wèi)生廳課題(201302054)

R749.3

A

10.11886/j.issn.1007-3256.2016.06.006

2016-10-10)

*通信作者：武克文，E-mail：sxtgwkw@126.com)